рекомбинантные флавивирусные вакцины

Формула изобретения

1. Химерный флавивирус, содержащий по меньшей мере одну мутацию в оболочечном белке химерного флавивируса и одну или более мутаций в (i) 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) генома химерного флавивируса, и/или (ii) в капсидном белке химерного флавивируса, где химерный флавивирус проявляет снижение висцеротропизма в сравнении с химерным флавивирусом с отсутствием мутаций, где вирус является полностью аттенуированным.

2. Химерный флавивирус по п.1, где химерный флавивирус содержит первый флавивирус, в котором мембранный и оболочечный белки первого флавивируса замещены на мембранный и оболочечный белки второго флавивируса.

3. Химерный флавивирус по п.2, в котором первый флавивирус представляет собой вирус желтой лихорадки.

4. Химерный флавивирус по п.3, в котором вирус желтой лихорадки представляет собой YF17D.

5. Химерный флавивирус по п.2, в котором второй флавивирус выбран из группы, состоящей из вирусов японского энцефалита, денге-1, денге-2, денге-3, денге-4, энцефалита долины Муррей, энцефалита Сент-Луис, лихорадки западного Нила, Кунжун, энцефалита Росио, Ильеус, центрально-европейского энцефалита, сибирского энцефалита, русского весенне-летнего клещевого энцефалита, киасанурской лесной болезни, Алхурма, омской геморрагической лихорадки, шотландского энцефалита овец, Повассан, Негиши, Абсеттаров, Гансалова, Апои и Нург.

6. Химерный флавивирус по п.5, в котором второй флавивирус представляет собой вирус лихорадки западного Нила.

7. Химерный флавивирус по п.6, в котором вирус лихорадки западного Нила содержит замены в аминокислотах оболочечного белка 107, 316 и 440.

8. Химерный флавивирус по любому из пп.1-6, в котором одна или более мутаций включает делецию.

9. Химерный флавивирус по любому из пп.1-7, в котором одна или более мутаций включает в себя замену.

10. Химерный флавивирус по любому из пп.1-7, в котором флавивирус включает мутацию в 3'-нетранслируемой области флавивируса и мутация включает менее чем 30 нуклеотидов.

11. Химерный флавивирус по п.10, в котором мутация в 3'-нетранслируемой области вируса дестабилизирует структуру стебля в 3'-нетранслируемой области вируса или возможные альтернативные элементы предсказанной вторичной структуры или общей структуры.

12. Химерный флавивирус по п.11, в котором структура стебля расположена в неконсервативном участке 3'-нетранслируемой области вируса.

13. Химерный флавивирус по п.12, в котором мутация выбрана из группы, состоящей из делеции в 3'-нетранслируемой области нуклеотидов 345-351 (d7), нуклеотидов 229-234 (dA), нуклеотидов 256-260 (dB), нуклеотидов 293-297 (dC), нуклеотидов 308-312 (dD) и их вариантов, при этом нумерация нуклеотидов начинается от первого нуклеотида 3'-нетранслируемой области вируса желтой лихорадки, после кодона терминации UGA открытой рамки считывания (ORF) вируса.

14. Химерный флавивирус по п.10, в котором мутация включает в себя делецию одного или нескольких нуклеотидов 352-374 консервативной последовательности 2 (CS2), при этом нумерация нуклеотидов начинается от первого нуклеотида 3'-нетранслируемой области вируса желтой лихорадки, после кодона терминации UGA открытой рамки считывания (ORF) вируса.

15. Химерный флавивирус по п.14, в котором мутация включает делецию нуклеотидов 360-364 (CS2 d5), или нуклеотидов 360-375 (CS2 dl6), или их варианты, при этом нумерация нуклеотидов начинается от первого нуклеотида 3'-нетранслируемой области вируса желтой лихорадки, после кодона терминации UGA открытой рамки считывания (ORF) вируса.

16. Химерный флавивирус по любому из пп.1-7, в котором флавивирус содержит мутацию в капсидной последовательности флавивируса.

17. Химерный флавивирус по п.16, в котором мутация включает делецию 1-4 аминокислот капсидного белка.

18. Химерный флавивирус по п.17, в котором мутация включает делецию 1-4 аминокислот в амнокислотах 41-55 спирали I (Helix I) капсидного белка.

19. Химерный флавивирус по п.18, в котором мутация включает делецию аминокислот 39-41 последовательности SEQ ID No: 6 капсидного белка С2 вируса желтой лихорадки.

20. Химерный флавивирус по любому из пп.1-7, в котором мутация в оболочечном белке включает замену аминокислоты оболочечного белка.

21. Химерный флавивирус по п.20, в котором мутация в оболочечном белке включает сочетание замен аминокислот оболочечного белка, выбранное из группы, состоящей из (i) 138; (ii) 176, 177 и 280; (iii) 176, 177, 244, 264 и 280; и (iv) 138, 176, 177 и 280.

22. Химерный флавивирус по любому из пп.1-7, в котором флавивирус содержит мутацию в 3'-нетранслируемой области вируса, капсидном белке и оболочечном белке.

23. Химерный флавивирус по любому из пп.1-7, в котором сочетания различных типов мутаций представляют собой (i) делецию аминокислот 39-41 последовательности SEQ ID No:6 капсидного белка вируса желтой лихорадки и делецию в 3'-нетранслируемой области нуклеотидов 345-351 (C2+d7), (ii) делецию аминокислот 39-41 последовательности SEQ ID No:6 капсидного белка вируса желтой лихорадки и делецию в 3'-нетранслируемой области нуклеотидов 256-260 (C2+dB), (iii) делецию аминокислот 39-41 последовательности SEQ ID No:6 капсидного белка вируса желтой лихорадки и делецию в 3'-нетранслируемой области нуклеотидов 308-312 (C2+dD), или делецию аминокислот 39-41 последовательности SEQ ID No:6 капсидного белка вируса желтой лихорадки и мутацию аминокислот Е176, Е177 и Е280 (С2+Е#5).

24. Химерный флавивирус по любому из пп.1-7, в котором флавивирус содержит мутацию в шарнирной области оболочечного белка флавивируса.

25. Химерный флавивирус по любому из пп.1-7, в котором флавивирус дополнительно содержит мутацию в мембранном белке флавивируса.

26. Химерный флавивирус по п.11, в котором мутантный флавивирус адаптирован к субстрату клеточной культуры, приводящему к спонтанной модификации мутации или к мутации во втором участке, которые не нарушают аттенуацию in vivo.

27. Химерный флавивирус по п.26, в котором спонтанная модификация увеличивает исходную делецию 5 нуклеотидов в мутантной форме dC до 24 нуклеотидов, где мутантная форма dC представляет собой делецию в 3'-нетранслируемой области нуклеотидов 293-297.

28. Химерный флавивирус по п.26, в котором мутация представляет собой делецию.

29. Химерный флавивирус по любому из пп.1-7 для применения при профилактике или лечении флавивирусной инфекции у субъекта.

30. Фармацевтическая композиция, применяемая в качестве вакцины, содержащая химерный флавивирус по любому из пп.1-28 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

31. Способ аттенуации вакцины-кандидата химерного флавивируса, где способ включает в себя внесение в вакцину-кандидат химерного флавивируса две или более мутаций, включающих по меньшей мере одну мутацию в оболочечном белке и по меньшей мере одну мутацию в 3'-нетранслируемой области или капсидном белке, где указанные мутации снижают висцеротропизм химерного флавивирусного кандидата по сравнению с висцеротропизмом химерного флавивирусного кандидата, у которого отсутствуют мутации, и химерный флавивирусный кандидат предпочтительно обладает характеристиками химерного флавивируса по любому из пп.1-28.

32. Применение химерного флавивируса по любому из пп.1-28 при получении вакцины или лекарственного средства для профилактики или лечения флавивирусной инфекции у субъекта.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки изобретения

Изобретение относится к вакцинам, которые включают в себя рекомбинантные флавивирусы.

Флавивирусы представляют собой маленькие оболочечные вирусы с положительной цепью РНК, которые, главным образом, передаются с помощью инфицированных москитов и клещей. Некоторые флавивирусы, такие как вирусы желтой лихорадки, денге, японского энцефалита, клещевого энцефалита и лихорадки западного Нила, представляют собой существующую или потенциальную угрозу здоровью населения всего мира. Вирус желтой лихорадки, например, был причиной эпидемий в определенных регионах Африки, расположенных к югу от Сахары, а также в некоторых областях Южной Америки. Несмотря на то, что многие инфекции вирусом желтой лихорадки являются мягкими, это заболевание также может вызывать тяжелое опасное для жизни состояние. Начальная или острая фаза болезненного состояния обычно характеризуется высокой лихорадкой, ознобом, головной болью, болью в спине, болью в мышцах, потерей аппетита, тошнотой и рвотой. Через трое или четверо суток эти симптомы исчезают. У некоторых пациентов симптомы затем снова возникают, поскольку заболевание входит в так называемую токсическую фазу. В ходе этой фазы высокая лихорадка появляется снова и может приводить к шоку, кровотечению (например, кровотечению из ротовой полости, носа, глаз и/или желудка), почечной недостаточности и печеночной недостаточности. Кроме того, печеночная недостаточность приводит к желтухе, при которой происходит окрашивание кожи и белков глаз в желтый цвет, и таким образом дает название "желтая лихорадка". Приблизительно половина пациентов, у которых возникает токсическая фаза, погибают в течение от 10 до 14 суток. Однако индивиды, которые выздоравливают от желтой лихорадки, приобретают пожизненный иммунитет против повторного заражения. Количество человек, инфицированных вирусом желтой лихорадки, возросло на протяжении последних двух десятилетий и в настоящее время составляет приблизительно 200000 случаев и приблизительно 30000 обусловленных им смертей каждый год. Повторное увеличение случаев заражения вирусом желтой лихорадки, таким образом, представляет собой серьезную проблему для здоровья населения.

Вирус лихорадки западного Нила (WN) широко распространен в Африке, Индийском субконтиненте, Европе, Украине, России, Центральной Азии и Среднем Западе (Monath and Heinz, in Virology 3^rd ed., Fields et al., eds., Lippincott-Raven, pp.961-1034, 1995). В 1999 году в США произошла беспрецедентная эпидемия энцефалита у человека и лошадей, вызванная вирусом WN (Enserik, Science 286:1450-1451, 1999). С того времени вирус постоянно существует в Америке, охватывая приблизительно всю территорию США. До настоящего времени рекордным годом с точки зрения заболеваемости/смертности в США был 2003 год с 9862 зарегистрированными случаями, среди которых приблизительно одна треть сопровождалась неврологическими симптомами и 264 смертями. Заболевание у человека варьирует от мягкого подобного денге состояния до смертельного менингоэнцефалита и наиболее тяжелое состояние возникает у пожилых людей. В настоящее время не существует эффективного медикаментозного лечения против вируса лихорадки западного Нила и способы контроля и профилактики не оказывают значительного влияния на количество случаев инфекции. Риск миграции вируса в Южную Америку, а также эпидемий в развивающихся странах является чрезвычайно высоким. Разработка безопасной и эффективной вакцины обеспечит борьбу с эпидемиями в будущем.

Флавивирусы, включая вирус желтой лихорадки и вирус лихорадки западного Нила, обладают двумя основными биологическими свойствами, ответственными за индукцию ими болезненного состояния у человека и животных. Первым из этих двух свойств является нейротропизм, который представляет собой склонность вируса к проникновению и инфицированию нервной ткани организма-хозяина. Нейротропная флавивирусная инфекция может приводить к воспалению и повреждению головного и спинного мозга (т.е. к энцефалиту), нарушению сознания, параличу и судорогам. Вторым из этих биологических свойств флавивирусов является висцеротропизм, который представляет собой склонность вируса к проникновению и инфицированию жизненно важных висцеральных органов, включая печень, почки и сердце. Висцеротропная флавивирусная инфекция может приводить к воспалению и повреждению печени (гепатит), почки (нефрит) и сердечной мышцы (миокардит), вызывая недостаточность или дисфункцию этих органов.

Нейротропизм и висцеротропизм, по-видимому, являются отдельными и обособленными свойствами флавивирусов. Некоторые флавивирусы являются, главным образом, нейротропными (такие как вирус лихорадки западного Нила), другие являются, главным образом, висцеротропными (например, вирус желтой лихорадки и вирус денге), однако другие обладают обоими свойствами (такие как вирус киасанурской лесной болезни). Однако как нейротропизм, так и висцеротропизм в определенной степени представлены во всех флавивирусах. В организме-хозяине, вероятно, происходит взаимодействие висцеротропизма и нейротропизма, поскольку инфицирование внутренних органов происходит до проникновения в центральную нервную систему. Таким образом, нейротропизм зависит от способности вируса к репликации в экстраневральных органах (внутренних органах). Эта экстраневральная репликация вызывает виремию, которая, в свою очередь, отвечает за проникновение в головной и спинной мозг. Полностью процессированные зрелые вирионы флавивирусов содержат три структурных белка: капсид (C), мембрану (M) и оболочку (E). Семь неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5) продуцируются в инфицированных клетках. Как домен связывания с рецептором, так и домен слияния вируса расположены в белке E. Кроме того, белок E также является желательным компонентом флавивирусных вакцин, поскольку антитела против этого белка могут нейтрализовать инфекционность вируса и обеспечить защиту организма-хозяина против заболевания. Зрелые вирионы флавивирусов, находящиеся в инфицированных клетках, содержат премембранный (prM) белок, который является предшественником белка M. Продукция белков флавивируса происходит посредством трансляции одной длинной открытой рамки считывания с образованием полибелка с последующей комплексной серией посттрансляционных протеолитических расщеплений полибелка с образованием зрелых вирусных белков (Amberg et al., J. Virol. 73:8083-8094, 1999; Rice, "Flaviviridae," In Virology, Fields et al., ed., Raven-Lippincott, New York, Vol.I, p.937, 1995). Структурные белки располагаются в N-концевой области полибелка в порядке C-prM-E, а неструктурные белки расположены в C-концевой области в порядке, указанном выше.

Живые вакцины обеспечивают наиболее эффективные и продолжительные защитные иммунные ответы против заболевания, вызываемого вирусными инфекциями. В случае флавивирусов, разработка успешной вакцины требует модификации вирулентных свойств, чтобы вакцинный вирус обладал сниженным нейротропизмом и висцеротропизмом у человека или животных. Для разработки вакцин против флавивирусов использовали несколько различных подходов. В случае вируса желтой лихорадки было разработано две вакцины (вакцина против желтой лихорадки 17D и французская нейротропная вакцина) посредством серийного пассирования (Monath, "Yellow Fever", In Plotkin and Orenstein, Vaccines, 3^rd ed., Saunders, Philadelphia, pp.815-879, 1999). Вакцина против желтой лихорадки 17D была разработана посредством серийного пассирования в ткани куриного эмбриона, и его результатом был вирус со значительно сниженным нейротропизмом и висцеротропизмом. Французская нейротропная вакцина была разработана посредством серийных пассирований вируса в ткани головного мозга мыши, и их результатом была потеря висцеротропизма, но сохранение нейротропизма. Действительно, с применением французской вакцины была связана высокая встречаемость неврологических повреждений (поствакцинальный энцефалит).

Другой подход к аттенуации включает в себя конструирование химерных флавивирусов, которые включают в себя компоненты двух (или более) различных флавивирусов. Были получены химерные флавивирусы, которые включают в себя структурные и неструктурные белки из различных флавивирусов. Например, в так называемой технологии ChimeriVax используют капсид вируса желтой лихорадки 17D и неструктурные белки для доставки оболочечных белков (prM и E) других флавивирусов (см., например, Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999). Действительно, эту технологию использовали для разработки вакцин-кандидатов против вирусов денге, вируса японского энцефалита (JE), вируса лихорадки западного Нила и вируса энцефалита Сент-Луис (SLE) (см., например, Pugachev et al., в New Generation Vaccines, 3 ^rd ed., Levine et al., eds., Marcel Dekker, New York, Basel, pp.559-571, 2004; Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999; Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999; Guirakhoo et al., J. Virol. 74:5477-5485, 2000; Arroyo et al., Trends Mol. Med. 7:350-354, 2001; Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004; Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004; Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003; Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004; и Pugachev et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 71:639-645, 2004). Они представляют собой живые вирусные вакцины, которые, аналогично вакцине YF17D, вызывают сильные гуморальные и клеточные иммунные ответы, направленные против требуемого гетерологичного вируса. Исходя из подробной охарактеризации вакцин ChimeriVax против JE и денге, было выявлено, что основные признаки вакцин ChimeriVax включают в себя способность к репликации до высоких титров в субстратных клетках (7 log₁₀ БОЕ/мл или выше), низкую нейровирулентность у мышей-отъемышей и новорожденных мышей (значительно ниже, чем в случае YF17D), высокую аттенуацию в официальных испытаниях на обезьянах в отношении нейровирулентности и висцеротропизма, высокую генетическую и фенотипическую стабильность in vitro и in vivo, слабую репликацию в москитах, которая является важной для предотвращения неконтролируемого распространения в природе, и индукцию сильного защитного иммунитета у мышей, обезьян и человека после введения однократной дозы без тяжелых побочных эффектов после иммунизации.

В других подходах к аттенуации проводили мутагенез флавивирусов, включая химерные флавивирусы. Описано несколько экспериментальных подходов к аттенуации флавивирусных патогенов дикого типа (см., например, обзор Pugachev et al., Int. J. Parasitol. 33:567-582, 2003). Например, было выявлено, что мутации в определенных аминокислотах оболочечных белков химерных флавивирусов, включающих в себя капсидные и неструктурные белки вируса желтой лихорадки и мембранные и оболочечные белки вируса японского энцефалита, вируса денге или вируса лихорадки западного Нила, снижают висцеротропизм (см., например, WO 03/103571 и WO 2004/045529). Другой подход, исходно примененный в отношении вируса денге-4 дикого типа, включает в себя крупные делеции из 30 нуклеотидов или более в 3'-нетранслируемой области (3'UTR; Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996; патент США № 6184024 B1). Одну из этих делеций, названную делецией дельта 30 или 30, впоследствии исследовали для вирусов денге-4 и денге-1 дикого типа и химерного вируса денге-4/WN (Durbin et al., AJTMH 65:405-413, 2001; Whitehead et al., J. Virol. 77:1653-1657, 2003; Pletnev et al., Virology 314:190-195, 2003; WO 03/059384; WO 03/092592; WO 02/095075). Кроме того, было выявлено, что некоторые из крупных делеций 3'UTR (длиной 417-616 нуклеотидов), внесенные в вирусы клещевого энцефалита (TBE) и Лангат дикого типа, являются высокоаттенуирующими в модели на мышах (Mandl et al., J. Virol. 72:2132-2140, 1998; Pletnev, Virology 282:288-300, 2001). Для вакцинного вируса YF17D было опубликовано ограниченное количество данных, полученных in vitro. В частности, Bredenbeek и соавторы показали, что крупная делеция всех трех элементов повторяющихся последовательностей (RS) в 3'UTR (длиной 188 нуклеотидов; расположение элементов RS представлено на фиг.1A) или делеция 25 нуклеотидов в элементе консервативной последовательности 2 (CS2) не препятствует репликации в клетках BHK, в то время как три другие делеции (длиной 25-68 нуклеотидов), которые нарушают CS1 или последнюю с 3'-конца структуру стебель-и-петля, являются летальными (Bredenbeek et al., J. Gen. Virol. 84:1261-1268, 2003). Другие авторы показали, что мутации, внесенные в крупную 3'-концевую структуру стебель-петля 3'UTR флавивируса (денге), приводят к аттенуации, но с сохранением способности вируса иммунизировать организм-хозяин (Markoff et al., J. Virol. 76:3318-3328, 2002).

Во втором подходе, который был описан для аттенуации высокопатогенного вируса TBE дикого типа, использовали относительно крупные делеции в капсидном белке C, как описано Kofler и коллегами, которые внесли ряд делеций в белок C вируса TBE и выделили несколько жизнеспособных мутантных форм (Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002). В частности, делеция из 16 аминокислот в центральном гидрофобном домене белка (предсказанная спираль I; см. на фиг.2A) существенно снижала репликацию вируса в клетках BHK и значительно снижала нейроинвазивность у мышей. Иммунизация этим мутантным TBE защищала мышей от заражения высокопатогенным штаммом TBE Hypr (>100 LD₅₀) (Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002).

Для многих значимых с медицинской точки зрения флавивирусов, обладающих висцеротропными свойствами, таких как, помимо прочих, вирусы лихорадки западного Нила, денге и омской геморрагической лихорадки, в настоящее время не существует одобренных вакцин.

Сущность изобретения

Это изобретение относится к рекомбинантным флавивирусам (например, вирусам желтой лихорадки или химерным флавивирусам), которые включают в себя одну или несколько мутаций, которые обеспечивают небольшое снижение висцеротропизма уже аттенуированного флавивируса, как описано в настоящем описании. Пример химерного флавивируса, относящегося к этому изобретению, представляет собой флавивирус, который включает в себя капсидный и неструктурные белки первого флавивируса (например, вируса желтой лихорадки, такого как штамм вируса желтой лихорадки 17D) и мембранный и оболочечный белки второго флавивируса (например, вируса, выбранного из группы, состоящей из вируса японского энцефалита, денге-1, денге-2, денге-3, денге-4, энцефалита долины Муррей, энцефалита Сент-Луис, западного Нила, Кунжин, энцефалита Росио, Ильеус, центрально-европейского энцефалита, сибирского энцефалита, русского весенне-летнего клещевого энцефалита, киасанурской лесной болезни, Алхурма, омской геморрагической лихорадки, шотландского энцефалита овец, Повассан, Негиши, Абсеттаров, Гансалова, Апои и Hypr). В случае химерного флавивируса, включающего в себя мембранный и оболочечный белки вируса лихорадки западного Нила, оболочечный белок необязательно может включать в себя замены аминокислот оболочечного белка 107, 316 и 440. Мутации рекомбинантных флавивирусов по этому изобретению могут представлять собой, например, одну или несколько делеций или замен.

Мутации по этому изобретению могут быть расположены в участках рекомбинантных флавивирусов, включающих в себя, например, 3'-нетранслируемую область рекомбинантных флавивирусов, и, главным образом, включают в себя менее 30 нуклеотидов. В качестве примера мутации этого типа, мутация может представлять собой мутацию, которая дестабилизирует структуру стебля в 3'-нетранслируемой области вируса (например, структуру стебля в неконсервативном участке 3'-нетранслируемой области вируса) или возможных альтернативных элементов предсказанной вторичной структуры или общей структуры. В качестве конкретных примеров, мутация может представлять собой любую одну или несколько из d7, dA, dB, dC и dD, как описано в настоящем описании. В других примерах, мутация может охватывать один или несколько нуклеотидов консервативной последовательности 2 (CS2) и, таким образом, может представлять собой, например, CS2 d5 или CS2 d16. В других примерах мутантный флавивирус адаптирован к субстрату клеточной культуры, вызывающему спонтанную модификацию мутации, которую он включает в себя (например, модификацию делеции, такую как, например, модификация, которая увеличивает исходную 5-нуклеотидную делецию в мутанте dC до 24 нуклеотидов; см. ниже), или мутацию во втором участке, которая не нарушает аттенуацию in vivo.

Мутации по этому изобретению также можно вносить в последовательности капсида. Такие мутации могут включать в себя, например, делецию 1-3 аминокислот капсидного белка. В качестве конкретного примера таких мутаций, мутации могут представлять собой одну или несколько делеций в спирали I капсидного белка (например, мутацию C2, как описано в настоящем описании).

В других примерах, мутации по этому изобретению могут включать в себя одну или несколько замен аминокислот оболочки. В одном примере такие мутации оболочки представляют собой замены одной или нескольких из аминокислот оболочечного белка 138, 176, 177, 244, 264 и 280 или их сочетания. Конкретные примеры таких сочетаний включают в себя следующие сочетания: 176, 177 и 280; 176, 177, 244, 264 и 280 и 138, 176, 177 и 280.

Рекомбинантные флавивирусы по этому изобретению могут включать в себя мутации только в одном из участков, указанных выше, или в двух или трех из этих участков. Кроме того, рекомбинантные флавивирусы могут включать в себя одну или несколько мутаций в шарнирной области оболочечного белка флавивируса и/или мутацию в мембранном белке флавивируса. В качестве конкретных примеров рекомбинантных флавивирусов по этому изобретению следует отметить флавивирусы, включающие в себя мутацию C2 в сочетании с мутациями d7, dB, dD и/или Е#5 (т.е. Е176, Е177 и Е280) (см. ниже), необязательно применительно к ChimeriVax -WN02 (также см. ниже). Дополнительные примеры рекомбинантных флавивирусов, включающих в себя множественные мутации, представлены в других частях настоящего описания.

Это изобретение также относится к способам профилактики или лечения флавивирусной инфекции у субъектов (например, у человека или у ветеринарных субъектов), включающим в себя введение субъекту вакцины, включающей в себя один или несколько из описанных в настоящем описании рекомбинантных флавивирусов, а также к фармацевтическим композициям, которые включают в себя такие рекомбинантные флавивирусы. Кроме того, это изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот (например, молекулам РНК или ДНК), которые содержат геномы (или комплементарные им последовательности) таких рекомбинантных флавивирусов. Кроме того, это изобретение относится к применению рекомбинантных флавивирусов, описанных в настоящем описании, для получения инактивированных вакцин. Также это изобретение относится к способам аттенуации флавивирусных вакцин-кандидатов, включающим в себя внесение в флавивирусные вакцины-кандидаты одной или нескольких мутаций, которые снижают висцеротропизм флавивирусных вакцин-кандидатов, как описано в настоящем описании.

Это изобретение обладает несколькими преимуществами. Вирусы, подвергаемые мутациям по этому изобретению, представляют собой живые аттенуированные флавивирусы, которые сохраняют способность инфицировать клетки млекопитающих. Вследствие того, что вирусы являются инфекционными, важно убедиться в том, что они являются достаточно аттенуированными, чтобы не приводить к заболеванию вакцинированных субъектов. Настоящее изобретение относится к подходам к регуляции флавивирусных вакцин-кандидатов, обеспечивающей, таким образом, возможность продукции безопасных вакцин. Рекомбинантные флавивирусы по этому изобретению также обладают преимуществами, поскольку они являются относительно безопасными по сравнению с исходными штаммами и штаммами дикого типа. Этот признак является преимущественным с точки зрения их применения и введения в качестве живых аттенуированных вакцин, а также с точки зрения их получения и применения в качестве инактивированных вакцин.

Другие признаки и преимущества этого изобретения станут очевидными из следующего подробного описания, рисунков и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1A представляет собой схематическое изображение 3'-нетранслируемой области вируса желтой лихорадки, на котором показаны домены этого участка (повторяющиеся последовательности (RS), CS2, CS1 и последняя с 3'-конца структура стебель-петля), а также примеры мутаций по этому изобретению (например, dA, dB, dC, dD, d7, d14, CS2 d5 и CS2 d16).

Фиг.1B представляет собой схематическое изображение последовательности и вторичной структуры 3'-нетранслируемой области вируса желтой лихорадки с середины 3 элемента RS и до конца UTR (Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999).

Фиг.1C представляет собой схематическое изображение предсказания оптимальной вторичной структуры 3'UTR YF17D, проведенного с использованием алгоритма укладки РНК Zuker.

Фиг.1D представляет собой схематическое изображение эффектов делеций в 3'UTR (показанных для делеции dC; способ Zuker) на оптимальную структуру YF17D (сравнить с фиг.1C).

Фиг.1Е представляет собой схематическое изображение эффекта спонтанного увеличения размера делеции в вирусе dC от 5 нуклеотидов (на уровне Р2) до 24 нуклеотидов (на уровне Р5) на предсказанную вторичную структуру (сравнить с фиг.1D и фиг.1C). Увеличенный размер делеции приводит к структуре, сходной с исходной оптимальной структурой YF17D.

Фиг.2А представляет собой схематическое изображение последовательности капсидного белка вируса клещевого энцефалита, а также делеций в этом белке, описанных Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002.

Фиг.2В представляет собой схематическое изображение последовательности капсидного белка YF17D. Участки, предсказанные с помощью компьютерного анализа, как обладающие -спиральной вторичной структурой ( -спирали I-IV), а также гидрофобными участками, указаны (SCQ ID № 6=Фиг.2B).

Фиг.3 представляет собой схематическое изображение модели гомологии гомодимера белка Е YF, показывающей расположение остатков, которые отличаются между YF дикого типа (Asibi) и штаммом вакцины YF17D.

Фиг.4 представляет собой схематическое изображение мембранного белка (M) и оболочечного белка (E) вируса лихорадки западного Нила, показывающее различные сочетания мутаций, внесенных в эти участки с использованием двухплазмидного подхода.

Фиг.5 представляет собой график, на котором представлена кинетика роста выбранных вариантов ChimeriVax -WN04 и контролей в WN02 с крупными бляшками (вакцина со сниженной аттенуацией) и мелкими бляшками.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным флавивирусам, которые можно использовать в терапевтических способах, таких как способы вакцинации. Основной чертой флавивирусов по этому изобретению является наличие аттенуирующих мутаций в геномах вирусов. Эти мутации могут аттенуировать вирус, например, посредством уменьшения висцеротропизма и/или нейротропизма вирусов. Мутации могут находиться в участках генома флавивируса, включающих в себя 3'-нетранслируемую область (3'UTR), последовательности капсида и/или последовательности оболочки. Как описано ниже, мутации по этому изобретению можно использовать для регуляции аттенуации вакцинных штаммов, которые уже включают в себя одну или несколько других аттенуирующих мутаций. Таким образом, например, мутации по этому изобретению можно идентифицировать по результату в виде снижения размера бляшек в анализах бляшкообразования и/или снижения виремии в моделях на животных (см. ниже). Мутации по этому изобретению, таким образом, обеспечивают дополнительный уровень безопасности в отношении аттенуации таких вирусов. Подробное описание вирусов и способов по этому изобретению представлено ниже.

Одним примером флавивируса, который можно подвергать мутациям по этому изобретению, является вирус желтой лихорадки, например, вакцинный штамм YF17D (Smithburn et al., "Yellow Fever Vaccination", World Health Org., p.238, 1956; Freestone, in Plotkin et al. (eds.), Vaccines, 2^nd edition, W.B.Saunders, Philadelphia, 1995). Также по этому изобретению можно использовать другие штаммы вируса желтой лихорадки, например YF17DD (регистрационный номер GenBank № U 17066) и YF17D-213 (регистрационный номер GenBank № U17067) (dos Santos et al., Virus Res. 35:35-41, 1995), YF17D-204 France (X15067, X15062), YF17D-204, 234 US (Rice et al., Science 229:726-733, 1985; Rice et al., New Biologist 1:285-296, 1989; C 03700, K 02749), и штаммы вируса желтой лихорадки, описанные Galler et al., Vaccine 16 (9/10):1024-1028, 1998.

Дополнительные флавивирусы, которые можно подвергать мутациям по этому изобретению, включают в себя другие переносимые москитами флавивирусы, такие как вирусы японского энцефалита (например, SA14-14-2), денге (серотипы 1-4), энцефалита долины Муррей, энцефалита Сент-Луис, лихорадки западного Нила, Кунжун, энцефалита Росио и Ильеус; клещевые флавивирусы, такие как вирусы центрально-европейского энцефалита, сибирского энцефалита, русского весенне-летнего клещевого энцефалита, киасанурской лесной болезни, Алхурма, омской геморрагической лихорадки, шотландского энцефалита овец, Повассан, Негиши, Абсеттаров, Гансалова, Апои и Hypr; а также вирусы из вирусов рода Hepaci (например, вирус гепатита C). Все эти вирусы обладают некоторой способностью к инфицированию внутренних органов. Висцеротропизм этих вирусов может приводить к дисфункции жизненно важных внутренних органов, однако репликация вируса в этих органах может вызывать виремию и, таким образом, приводить к проникновению в центральную нервную систему. Таким образом, в дополнение к снижению риска повреждения внутренних органов, снижение висцеротропизма этих вирусов посредством мутагенеза может уменьшить их способность проникать в головной мозг и вызывать энцефалит.

В дополнение к перечисленным выше вирусам, а также к другим флавивирусам, также к этому изобретению относятся химерные флавивирусы, которые включают в себя один или несколько типов мутаций, указанных выше. Эти химеры могут состоять из флавивируса (т.е. основного флавивируса), в котором структурный белок (или белки) заменен соответствующим структурным белком (или белками) второго вируса (т.е. тестируемого или предопределенного вируса, такого как флавивирус; см., например, патент США № 6696281; патент США № 6184024; патент США № 6676936 и патент США № 6497884). Например, химеры могут состоять из основного флавивируса (например, вируса желтой лихорадки), в котором мембранный и оболочечный белки заменены мембранным и оболочечным белками второго тестируемого вируса (например, вируса лихорадки западного Нила, вируса денге (серотип 1, 2, 3 или 4), вируса японского энцефалита или другого вируса, такого как любой из упомянутых в настоящем описании вирусов). Химерные вирусы можно получать из любого сочетания вирусов, однако, как правило, источником встраиваемого структурного белка(ов) является вирус, против которого хотят достичь иммунитета.

Конкретным примером типа химерного вируса, который можно подвергать мутациям по настоящему изобретению, является вакцинный штамм вируса желтой лихорадки человека, YF17D, в котором мембранный и оболочечный белки заменены мембранным и оболочечным белками другого флавивируса, такого как вирус лихорадки западного Нила, вирус денге (серотип 1, 2, 3 или 4), вирус японского энцефалита, вирус энцефалита Сент-Луис, вирус энцефалита долины Муррей или любой другой флавивирус, такой как один из перечисленных выше вирусов. Химерные флавивирусы, полученные с использованием этого подхода, обозначают как так называемые вирусы "ChimeriVax". Для получения вирусов по этому изобретению можно использовать следующие химерные флавивирусы, которые были получены с использованием технологии ChimeriVax и депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC) в Manassas, Virginia, U.S.A. по условиям Будапештского договора и которым присвоена дата депонирования 6 января 1998 года: химерный вирус желтой лихорадки 17D/Денге типа 2 (YF/DEN-2; ATCC регистрационный номер ATCC VR-2593) и химерный вирус желтой лихорадки 17D/японского энцефалита SA14-14-2 (YF/JE A1.3; ATCC регистрационный номер ATCC VR-2594). Подробные описания получения химерных вирусов, которые можно использовать по этому изобретению, представлены, например, в следующих публикациях: WO 98/37911; WO 01/39802; Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999; WO 03/103571; WO 2004/045529; патент США № 6696281; патент США № 6184024; патент США № 6676936 и патент США № 6497884.

Как указано выше, новые мутации по этому изобретению находятся в последовательностях 3'UTR, капсида и/или оболочки флавивирусов, включая химерные флавивирусы. Каждый из этих типов мутаций, которые можно объединять друг с другом и/или с другими аттенуирующими мутациями, описан ниже.

Мутации 3'-нетранслируемой области

Организация 3'UTR вакцинного штамма вируса желтой лихорадки, YF17D, которая является общей для всех вирусов ChimeriVax , представлена на фиг.1A. Она включает в себя в порядке от 3'-конца: (i) последнюю с 3'-конца структуру стебель-и-петля, которая, предположительно, выполняет функцию промотора для синтеза минус-цепи РНК и является консервативной у всех флавивирусов, (ii) два элемента консервативной последовательности, CS1 и CS2, которые обладают высокой степенью гомологии нуклеотидной последовательности с другими переносимыми москитами флавивирусами, и (iii) уникальные для штаммов вируса желтой лихорадки Восточной Африки, включая вакцинный вирус YF17D, три копии элемента повторяющихся последовательностей (RS), расположенные на 5'-конце 3'UTR (Chambers et al., Annu. Rev. Microbiol. 44:649-688, 1990). 3'UTR также включает в себя ряд предсказанных структур стебель-петля, таких как структуры в неконсервативном участке ниже элементов RS, как представлено на фиг.1B.

Мутации 3'UTR по настоящему изобретению, как правило, представляют собой короткие аттенуирующие делеции, например менее чем 30 нуклеотидов (например, 1, 2, 3 и т.д.) и вплоть до 29 (например, длиной 2-25, 3-20, 4-15, 5-10 или 6-8 нуклеотидов). При внесении в вакцины-кандидаты по отдельности или совместно с другими аттенуирующими мутациями новые мутации по этому изобретению могут обеспечивать дополнительный уровень аттенуации, таким образом, обеспечивая подход для регуляции уровня аттенуации вакцины-кандидата. В некоторых примерах короткие делеции 3'UTR по этому изобретению разрабатывают для дестабилизации вторичной структуры одной или нескольких из предсказанных структур стебля в 3'UTR и/или общей структуры 3'UTR. В дополнение к делециям, мутации в таких структурах также могут включать в себя замены, которые аналогично приводят к дестабилизации структуры стебля. В определенных примерах, структуры стебель-петля, которые подвергают мутациям по этому изобретению, находятся в неконсервативных участках 3'UTR или в консервативных участках, которые допускают такие мутации (например, в CS2). Например, для 3'UTR вируса желтой лихорадки (например, YF17D), как в случае неизмененного вируса желтой лихорадки, так и в случае химеры на основе вируса желтой лихорадки, дестабилизирующие структуру стебля мутации могут находиться в любой одной или нескольких структурах стебля, представленных на фиг.1B, на которой показаны четыре примера таких делеций (dA, dB, dC и dD), которые описаны далее. Таким образом, в дополнение к этим конкретным примерам, другие примеры мутаций 3'UTR в вирусе желтой лихорадки включают в себя мутации, которые содержат, например, 1-2, 3-8, 4-7 или 5-6 нуклеотидов в следующих последовательностях структур стеблей, которые представлены на фиг.1B, от 5'-конца к 3'-концу: TGGAG, CTCCA, GACAG, TTGTC, AGTTT, GGCTG, CAGCC, AACCTGG, TTCTGGG, CTACCACC, GGTGGTAG, GGGGTCT, AGACCCT, AGTGG и TTGACG.

В дополнение к мутациям, дестабилизирующим структуру стебля, мутации по этому изобретению также включают в себя другие короткие делеции в 3'UTR. Например, это изобретение относится к определенным мутациям, которые находятся в пределах мутации 30, описанной выше. Таким образом, например, это изобретение относится к любым приемлемым мутациям, которые представляют собой 1, 2, 3 и т.д. и вплоть до 29 (например, 1-25, 2-20, 3-15, 4-14, 5-13, 6-12, 7-11, 8-10 или 9) нуклеотидов в длину в пределах этого участка. В качестве конкретного примера, это изобретение относится к делеции d7, в которой удалены следующие нуклеотиды из этого участка в YF17D: нуклеотиды 345-351 (AAGACGG; нумерация от 1 нуклеотида 3'UTR после кодона терминации UGA вирусной ORF; фиг.1A). Мутации, которые включают в себя делецию, например, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов с 3'-конца или 5'-конца этой последовательности, также относятся к этому изобретению. В других примерах, к этому изобретению относятся короткие делеции в консервативных последовательностях CS1 и CS2. Эти мутации могут включать в себя делецию, например, 1-29, 2-25, 3-20, 4-15, 5-10 или 6-8 нуклеотидов этих последовательностей. В качестве двух конкретных примеров, которые описаны ниже, из YF17D-специфичной CS2 3'UTR удалены нуклеотиды 360-364 (GGTTA; CS2d5; фиг.1A) и/или нуклеотиды 360-375 (GGTTAGAGGAGACCCT; CS2d16; фиг.1A). Мутации, которые включают в себя делецию, например, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов с 3'-конца или 5'-конца этой последовательности, также относятся к этому изобретению. Для других флавивирусных 3'UTR можно проводить сходные мутации, исходя из вторичных структур 3'UTR. Предсказание вторичных структур 3'UTR других флавивирусов опубликовано, например, для денге, Кунжун и TBE (см., например, Proutski et al., Virus Res. 64:107-123, 1999) и HCV (см., например, Kolykhalov et al., J. Virol. 70:3363-3371, 1996). Кроме того, множество нуклеотидных последовательностей 3'UTR многих штаммов флавивирусов, соответствующих всем четырем основным серокомплексам (YF, JE, денге и TBE), являются доступными в GenBank. Последовательности дополнительных штаммов можно определить посредством секвенирования вируса. Вторичные структуры этих последовательностей можно легко предсказать с использованием стандартного программного обеспечения (например, программы mfold или RNAfold) для выявления потенциальных структур стебель-петля, которые можно подвергать мутагенезу.

Как описано ниже, мутации 3'UTR по этому изобретению можно использовать для обеспечения дальнейшей аттенуации уже аттенуированных вакцин-кандидатов. Таким образом, одну или несколько из мутаций 3'UTR, описанных в настоящем описании (например, d7, dB, dC и/или dD), можно вносить для обеспечения дополнительного уровня безопасности вакцинного штамма вируса желтой лихорадки YF17D. Необязательно, мутацию(ии) 3'UTR можно вносить в этот штамм с одной или несколькими дополнительными аттенуирующими мутациями, такими как аттенуирующая мутация в шарнирной области оболочечного белка вируса (например, замена любой одной или нескольких из аминокислот оболочечного белка 48-61, 127-131 и 196-283, например аминокислоты 279, или одной или нескольких аминокислот оболочечного белка в вирусе желтой лихорадки, соответствующих аминокислотам 204, 252, 253, 257, 258 и 261 вируса денге 1 (см., например, WO 03/103571); шарнирная область оболочечных белков флавивируса расположена между доменами I и II; см., например, Rey et al., Nature 375:291-298, 1995), мутация аминокислот мембранного белка вируса желтой лихорадки (например, мембранной части в виде спирали мембранного белка, например, аминокислоты, соответствующей положению 66 в мембранном белке вируса лихорадки западного Нила) или любые мутации капсида или оболочечного белка, описанные в настоящем описании (например, аминокислотные замены в положениях, соответствующих аминокислотам вируса лихорадки западного Нила 138, 176, 177, 244, 264, 280, 313, 316, 380 и 440, отдельно или в сочетании).

Действительно, можно объединять указанные мутации или делеции в 3'UTR с одной или несколькими мутациями или делециями в гене капсида (как описано ниже), в гене prM (например, в положениях M5 или M60 химер YF-японский энцефалит или в M66 в химерах YF-WN или в расположенных рядом аминокислотах (см. PCT/US2005/037369 и ниже)) или в гене E в участках, о которых известно, что они аттенуируют флавивирусы. Ген E содержит функциональные домены, аминокислотные замены в которых могут нарушать функцию и, таким образом, снижать вирулентность, как описано Hurrelbrink and McMinn (Adv. Virus Dis. 60:1-42, 2003). Функциональные участки белка E, в которые можно вносить мутации, которые совместно с делециями/мутациями 3'UTR, описанными в настоящей заявке, могут приводить к должным образом аттенуированной вакцине, включают в себя: a) предполагаемый связывающий рецептор участок на наружной поверхности домена III, b) молекулярную шарнирную область между доменами I и II, которая определяет зависимые от кислот конформационные изменения белка E в эндосоме и снижает эффективность интернализации вируса; c) область контакта белков prM/M и E, участок белка E, который контактирует с prM/M после перестройки из димера в тример после воздействия низких значений pH в эндосоме; d) конец домена слияния домена II, который вовлечен в слияние с мембраной эндосомы в ходе процесса интернализации; и e) якорный участок в виде стебля, который также функционально вовлечен в конформационные изменения белка E в ходе индуцируемых кислотой процессов слияния.

Мутации 3'UTR также можно вносить в химерные флавивирусные вакцины-кандидаты. В одном примере, который описан ниже, одну или несколько мутаций 3'UTR, описанных в настоящем описании, вносят в вакцину-кандидат (обозначаемую в настоящем описании как ChimeriVax -WN02), которая включает в себя капсид и неструктурные белки вируса желтой лихорадки (YF 17D) и мембранный и оболочечный белки вируса лихорадки западного Нила (NY99), оболочечный белок которого уже включает в себя аттенуирующие мутации (замены в положениях 107, 316 и 440; WO 2004/045529; также см. ниже). Таким образом, это изобретение относится к ChimeriVax -WN-02, которая также включает в себя, например, d7, dB, dC, dD или любую другую мутацию 3'UTR, описанную в настоящем описании (необязательно, в сочетании с одним или несколькими мутациями капсида или дополнительными мутациями оболочки, как описано в настоящем описании). В других примерах, мембранный и оболочечный белки представляют собой белки из другого флавивируса, такого как вирус японского энцефалита (например, SA14-14-2), вирус денге (вирус денге 1, 2, 3 или 4) или другой флавивирус, описанный в настоящем описании.

Как в случае вакцины на основе вируса желтой лихорадки, описанной выше, мутацию(ии) 3'UTR необязательно можно вносить в химерные флавивирусы с одной или несколькими дополнительными аттенуирующими мутациями, такими как аттенуирующая мутация в шарнирной области оболочечного белка вируса (например, замена любой одной или нескольких аминокислот, соответствующих аминокислотам вируса желтой лихорадки 48-61, 127-131 и 196-283, например аминокислоты 279, или одной или нескольких аминокислот оболочечного белка, соответствующих аминокислотам 204, 252, 253, 257, 258 и 261 вируса денге 1 (см., например, WO 03/103571)), мутация аминокислот в мембранном белке (например, мембранной спиральной части мембранного белка, например, аминокислот, соответствующих положению 66 мембранного белка вируса лихорадки западного Нила) или любая мутация капсида или оболочечного белка, описанная в настоящем описании (например, аминокислотные замены в положениях, соответствующих аминокислотам вируса лихорадки западного Нила 138, 176, 177, 244, 264 и 280, отдельно или в сочетании). Конкретные примеры высокоаттенуированных вирусов, содержащих сочетания различных типов аттенуирующих мутаций, описаны ниже. Они представляют собой химерные варианты вирус желтой лихорадки-вирус западного Нила, в которых делеция C2 в капсидном белке сочетается с делециями d7, dB или dD в 3'UTR, или с сочетанием аминокислотных замен E#5 в оболочечном белке (аминокислотные замены E176, E177 и E280).

Мутации капсида

Как описано ниже, авторы настоящего изобретения обнаружили, что короткие делеционные мутации в капсидном белке также можно использовать для обеспечения дополнительной аттенуации уже аттенуированной вакцины-кандидата. Таким образом, это изобретение относится к флавивирусам (включая химерные флавивирусы, такие как вакцины-кандидаты, уже включающие в себя другие аттенуирующие мутации), которые включают в себя короткие делеции (например, делеции 1, 2, 3 или 4 аминокислот) в капсидном белке. Примеры таких мутаций, представленные по отношению к капсидному белку вируса YF17D, включают в себя приемлемые делеции, нарушающие спираль I белка (см. фиг.2A). Конкретный пример такой мутации представляет собой мутацию C2, которая включает в себя делецию аминокислот PSR из спирали I (фиг.2A). Другие короткие мутации в этом участке можно тестировать на их эффективность и аттенуацию, и они также относятся к этому изобретению. Последовательности капсидного белка других флавивирусов опубликованы, например, для вирусов TBE, WN, Кунжун, JE и денге (например, Pletnev et al., Virology 174:250-263, 1990).

Как в случае мутаций 3'UTR, описанных выше, в вакцинный штамм вируса желтой лихорадки (например, YF17D) можно вносить мутации капсидного белка, необязательно в сочетании с любой одной или несколькими из следующих мутаций: мутации 3'UTR, как описано в настоящем описании (например, d7, dB, dC, dD или их варианты); аттенуирующие мутации в шарнирной области оболочечного белка вируса (например, замена любой одной или нескольких аминокислот, соответствующих аминокислотам вируса желтой лихорадки 48-61, 127-131 и 196-283, например аминокислоты 279, или одной или нескольких аминокислот оболочечного белка, соответствующих аминокислотам 204, 252, 253, 257, 258 и 261 вируса денге 1 (см., например, WO 03/103571)), мутации аминокислот в мембранном белке вируса желтой лихорадки (например, мембранной спиральной части мембранного белка, например, аминокислот, соответствующих положению 66 мембранного белка вируса лихорадки западного Нила) или любые мутации капсида или оболочечного белка, описанные в настоящем описании (например, аминокислотные замены в положениях, соответствующих аминокислотам вируса лихорадки западного Нила 138, 176, 177, 244, 264 и 280, отдельно или в сочетании).

Аналогично, мутации капсидного белка можно вносить в химерные флавивирусы. В одном примере, который описан ниже, одну или несколько мутаций капсида, описанных в настоящем описании, вносят в вакцину-кандидат (обозначаемую в настоящем описании как ChimeriVax -WN02), которая включает в себя капсид и неструктурные белки вируса желтой лихорадки (YF17D) и мембранный и оболочечный белки вируса лихорадки западного Нила (NY99), оболочечный белок которого уже включает в себя аттенуирующие мутации (замены в положениях 107, 316 и 440; WO 2004/045529; также см. ниже). Таким образом, это изобретение относится к ChimeriVax -WN-02, которая также включает в себя, например, мутацию C2 (необязательно, в сочетании с одной или несколькими мутациями 3'UTR и/или дополнительными мутациями оболочки, как описано в настоящем описании, например сконструированные и охарактеризованные сочетания делеции C2 с делециями d7, dB или dD в 3'UTR, или с сочетанием E#5 аминокислотных замен в оболочечном белке). В других примерах мембранный и оболочечный белки представляют собой белки из другого флавивируса, такого как вирус японского энцефалита (например, SA14-14-2), вирус денге (вирус денге 1, 2, 3 или 4) или другой флавивирус, описанный в настоящем описании. В других примерах, такие мутации вносят в природные (не химерные) флавивирусы, как описано выше.

Кроме того, мутацию(ии) 3'UTR необязательно можно вносить в химерные флавивирусы с одной или несколькими дополнительными аттенуирующими мутациями, такими как аттенуирующая мутация в шарнирной области оболочечного белка вируса (например, замена любой одной или нескольких аминокислот, соответствующих аминокислотам вируса желтой лихорадки 48-61, 127-131 и 196-283, например аминокислоты 279, или одной или нескольких аминокислот оболочечного белка, соответствующих аминокислотам 204, 252, 253, 257, 258 и 261 вируса денге 1 (см., например, WO 03/103571)), мутация аминокислот в мембранном белке (например, мембранной спиральной части мембранного белка, например, аминокислот, соответствующих положению 66 мембранного белка вируса лихорадки западного Нила) или любая мутация оболочечного белка, описанная в настоящем описании (например, аминокислотные замены в положениях, соответствующих аминокислотам вируса лихорадки западного Нила 138, 176, 177, 244, 264, 280, 313, 316, 380 и 440 отдельно или в сочетании).

Мутации оболочки

Как описано в другой части настоящего описания, определенные мутации оболочки описаны как аттенуирующие для флавивирусов, таких как вирус желтой лихорадки (например, YF17D) и химерные флавивирусы. Они включают в себя мутации шарнирной области (например, замены в положениях, соответствующих аминокислотам 48-61, 127-131, 170, 173, 200, 299, 305, 380 и 196-283 вируса желтой лихорадки и замены в остатках, образующих гидрофобный карман домена II (Hurrelbrink et al., Adv. Virus Res. 60:1-42, 2003; Modis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:6986-6991, 2003; см. фиг.3), включая остатки 52 и 200 в случае вируса желтой лихорадки (фиг.3), аминокислоте 279 вируса японского энцефалита (в случае химеры на основе вируса желтой лихорадки) и аминокислотам 204, 252, 253, 257, 258 и 261 вируса денге 1 (см., например, WO 03/103571), а также замены аминокислот 107, 316 и 440 оболочечного белка вируса лихорадки западного Нила (см., например, WO 2004/045529)).

Как описано ниже в примерах, авторы настоящего изобретения обнаружили, что мутации (например, замены) в последовательностях оболочки флавивируса также могут обеспечивать способы регуляции аттенуации уже аттенуированного флавивируса. Таким образом, это изобретение относится к флавивирусам (например, к вирусу желтой лихорадки или химерному флавивирусу, как описано в настоящем описании), которые включают в себя одну или несколько мутаций оболочечного белка, которые можно использовать для регуляции аттенуации вакцины-кандидата. Примеры таких мутаций включают в себя замены в положениях, соответствующих аминокислотам 138, 176, 177, 244, 264 и 280 вируса лихорадки западного Нила, и сочетания этих мутаций (например, 176, 177 и 280; 176, 177, 244, 264 и 280 и 138, 176, 177 и 280). Мутации оболочки, такие как эти мутации, которые приводят к небольшому снижению аттенуации уже аттенуированной вакцины-кандидата, можно вносить в аналогичные положения вакцины вируса желтой лихорадки (например, вакцины на основе YF17D) или химерного флавивируса, как описано в настоящем описании. Необязательно, эти мутации можно вносить с одной или несколькими другими мутациями оболочки, капсида, мембраны и/или 3'UTR, описанных в настоящем описании.

Все мутации, описанные для генов капсида и 3'UTR, можно объединять с этими мутациями оболочки (одного или нескольких остатков оболочки, которые, как показано, влияют на аттенуацию) с получением вируса с аттенуированным фенотипом, который является менее висцеротропным (т.е. индуцирует более низкую виремию в организме-хозяине), чем каждый из родительских вирусов по отдельности. Например, мутантную форму C2 (таблица 2) можно объединять с E#7 (таблица 4) или dC, dD и т.д. Делеции 3'UTR (таблица 1) можно объединять с вирусами C2 или E#7.

Мутации, которые можно вносить совместно с мутациями 3'UTR, капсидного белка и оболочечного белка по этому изобретению

В дополнение к одной или нескольким из аттенуирующих мутаций, указанных выше, флавивирусы по этому изобретению могут включать в себя другие аттенуирующие мутации. Несмотря на упоминание выше сочетаний с одним из трех типов мутаций, относящихся к этому изобретению, в этом разделе представлено более подробное описание этих мутаций.

Примеры мутаций, которые можно вносить в флавивирусы (включая химерные флавивирусы), которые включают в себя мутации по этому изобретению, включают в себя мутации в шарнирной области оболочечного белка или определенные мутации мембранного белка. В частности, было обнаружено, что определенные мутации шарнирной области оболочечного белка снижают висцеротропизм. Полипептидная цепь оболочечного белка укладывается в три отдельных домена: центральный домен (домен I), домен димеризации (домен II) и подобный иммуноглобулину модульный домен (домен III). Шарнирная область находится между доменами I и II и, при воздействии кислых значений pH, подвергается конформационному изменению (отсюда обозначение "шарнирная область"), которое приводит к образованию тримеров оболочечного белка, которые вовлечены в слияние вирусной и эндосомальной мембран, после захвата вируса рецептор-опосредуемым эндоцитозом. До конформационного изменения белки находятся в форме димеров. В шарнирной области находится множество аминокислот, например аминокислоты 48-61, 127-131 и 196-283 вируса желтой лихорадки (Hurrelbrink et al., Adv. Virus Res. 60:1-42, 2003; Rey et al., Nature 375:291-298, 1995). В вирусах по этому изобретению могут быть представлены аттенуирующие мутации любой из этих аминокислот или расположенных рядом аминокислот (и соответствующих аминокислот в других оболочечных белках флавивируса). Особый интерес представляют аминокислоты в гидрофобном кармане шарнирной области (Modis et al., опубликованная интерактивно перед выходом печатного издания 20 мая 2003 года, 10.1073 / pnas.0832193100. PNAS 10 июня 2003 года vol.100 № 12 6986-6991). В качестве конкретного примера, замена аминокислоты оболочечного белка (K на R в вирусе денге 1), которая расположена в гидрофобном кармане шарнирной области, в химерном флавивирусе, включающем в себя последовательности денге 1, встроенные в вектор вируса желтой лихорадки, приводит к аттенуации. Эта замена приводит к изменению структуры оболочечного белка, так что межмолекулярные водородные связи между одним и другим мономером оболочки в белке дикого типа разрушаются и заменяются новыми внутримолекулярными взаимодействиями в мономерах. Таким образом, дополнительные замены можно использовать для увеличения внутримолекулярных взаимодействий в гидрофобном кармане, обеспечивающих аттенуацию. Примеры таких мутаций/замен, которые могут быть внесены в гидрофобный карман в сочетании с мутациями по этому изобретению, включают в себя замены в E202K, E204K, E252V, E253L, E257E, E258G и E261H.

В дополнение к мутациям 3'UTR, капсида и/или оболочки, указанным выше, флавивирусы по этому изобретению также могут включать в себя одну или несколько аттенуирующих мутаций в мембранном белке, например, в аминокислоте, соответствующей аминокислоте 66 мембранного белка вируса лихорадки западного Нила, и/или в других аминокислотах предсказанной мембранной спирали (например, в любой одной или нескольких аминокислотах, соответствующих аминокислотам 40-75 вируса лихорадки западного Нила). В качестве конкретного примера, в случае мембранного белка вируса лихорадки западного Нила, аминокислоту 66 мембранного белка (лейцин в вирусе лихорадки западного Нила дикого типа) можно заменять другой аминокислотой, такой как пролин. В дополнение к пролину, аминокислоту в положении 66 мембранного белка дикого типа можно заменять другими гидрофобными аминокислотами, такими как изолейцин, метионин или валин, или небольшими аминокислотами, такими как аланин или глицин. В качестве других примеров, аминокислоты в положениях 60, 61, 62, 63 и/или 64 вируса лихорадки западного Нила (или соответствующих положений в других флавивирусах) можно заменять, отдельно или в сочетании друг с другом, с мутацией в положении 66 и/или с другой мутацией(ями). Примеры замен в этих положениях включают в себя: аргинин на глицин в положении 60, валин на аланин в положении 61, валин на глутаминовую кислоту или метионин в положении 62, фенилаланин на серин в положении 63 и валин на изолейцин в положении 64. Другой пример включает в себя мутацию аргинин на цистеин в положении 60 JE-специфичного мембранного белка в вирусе ChimeriVax -JE, которая, как было выявлено, повышает генетическую стабильность вакцин в процессе крупномасштабного изготовления. Также авторы настоящего изобретения впервые предоставляют доказательства того, что эктодомен белка M обладает большим функциональным значением, поскольку замена глутамина на пролин в остатке M5 ChimeriVax -JE повышает пороговое значение pH для инфекции (см. заявку PCT / US 2005/037369).

В дополнение к одной или нескольким мутациям мембранного белка, указанным выше, вирусы по этому изобретению также могут включать в себя одну или несколько дополнительных мутаций. Например, в случае вируса лихорадки западного Нила, такая дополнительная мутация(ии) может находиться в области положения 107 (например, L на F), 316 (например, A на V) или 440 (например, K на R) (или их сочетание) оболочечного белка вируса лихорадки западного Нила. Таким образом, мутации могут находиться, например, в одной или нескольких из аминокислот 102-112, 138 (например, E на K), 176 (например, Y на V), 177 (например, T на A), 244 (например, E на G), 264 (например, Q на H), 280 (например, K на M), 311-321 и/или 435-445 оболочечного белка вируса лихорадки западного Нила. В качестве конкретного примера, с использованием последовательности штамма NY99-фламинго 382-99 вируса лихорадки западного Нила (регистрационный номер GenBank AF 196835) в качестве исходного образца, лизин в положении 107 можно заменять фенилаланином, аланин в положении 316 можно заменять валином, и/или лизин в положении 440 можно заменять аргинином. Соответствующие мутации также можно вносить в другие флавивирусы.

Кроме того, вирусы по этому изобретению также могут включать в себя любые другие мутации, которые могут быть аттенуирующими мутациями, или могут не быть ими, но являются иным образом преимущественными для вакцины (например, для изготовления вакцины), например нуклеотидные замены в UTR или аминокислотные замены в структурных или неструктурных белках, которые могут спонтанно накапливаться в процессе размножения вируса и могут быть желательными. Например, недавно авторы настоящего изобретения обнаружили аминокислотную замену R на C в остатке 60, накопленную в вакцине ChimeriVax -JE в процессе крупномасштабного изготовления в условиях без сыворотки. Эта замена не влияет на иммуногенность или аттенуацию, однако она стабилизирует вирус посредством повышения его скорости роста и предотвращения накопления нежелательной реверсии в остаток дикого типа оболочечного белка (E107).

Мутации в вирусы по этому изобретению можно вносить с использованием стандартных способов, таких как сайт-направленный мутагенез. Мутации, описанные выше, представляют собой делеции или замены, а также по этому изобретению можно использовать другие типы мутаций, такие как инсерции. Кроме того, как указано выше, мутации могут быть представлены отдельно или с одной или несколькими дополнительными мутациями. Кроме того, в дополнение к конкретным аминокислотам, указанным выше, можно проводить замены посредством других аминокислот, таких как аминокислоты, которые приводят к консервативным заменам аминокислот, указанных выше. Консервативные замены, как правило, включают в себя замены в пределах следующих групп: глицин, аланин, валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин и глутамин; серин и треонин; лизин и аргинин; и фенилаланин и тирозин. Кроме того, как консервативные, так и неконсервативные замены можно выбирать для анализа их аттенуирующего эффекта(ов) на основе предсказанных с помощью компьютера (с использованием программного обеспечения для моделирования структуры белка) изменений, которые они вызывают в рентгеновской структуре белка E.

Вирусы (включая химеры) по настоящему изобретению можно получать с использованием стандартных в данной области способов. Например, молекулу РНК, соответствующую геному вируса, можно вводить в первичные клетки, куриные эмбрионы или диплоидные клеточные лини, из которых (или из супернатантов которых) затем может быть выделен вирус-потомок. В другом способе, который можно использовать для получения вирусов, используют гетероплоидные клетки, такие как клетки Vero (Yasumura et al., Nihon Rinsho 21, 1201-1215, 1963). В этом способе молекулу нуклеиновой кислоты (например, молекулу РНК), соответствующую геному вируса, вводят в гетероплоидные клетки, вирус выделяют из среды, в которой культивируют клетки, полученный вирус обрабатывают нуклеазой (например, эндонуклеазой, которая разрушает как ДНК, так и РНК, такой как Бензоназа ; патент США № 5173418), обработанный нуклеазой вирус концентрируют (например, применяя ультрафильтрацию с использованием фильтра, обладающего ограничением молекулярной массы, например, 500 кДа) и концентрированный вирус составляют для вакцинации. Подробное описание этого способа представлено в WO 03/060088 A2, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Вирусы по этому изобретению можно вводить в качестве средств первичной профилактики субъектам, обладающим риском инфекции, или их можно применять в качестве вторичных средств для лечения инфицированных пациентов. Вследствие того, что вирусы являются аттенуированными, они, в частности, хорошо подходят для введения "обладающим риском индивидам", таким как пожилые лица, дети или ВИЧ-инфицированные лица. Также вакцины можно использовать в ветеринарии, например, для вакцинации лошадей против инфекции вирусом лихорадки западного Нила или для вакцинации птиц (например, ценных, находящихся под угрозой исчезновения или домашних птиц, таких как фламинго, белоголовый орлан и гусь, соответственно). Кроме того, вакцины по этому изобретению могут включать в себя вирус, такой как химерный вирус, включающий в себя конкретную мутацию, в смеси с вирусами, лишенными таких мутаций.

Операции с вирусами по изобретению можно осуществлять с использованием стандартных в данной области способов. Широко известно множество фармацевтически приемлемых растворов для применения при изготовлении вакцины, и специалисты в данной области могут их легко адаптировать для применения по настоящему изобретению (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (18 издание), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). В двух конкретных примерах вирусы представляют в минимальной поддерживающей среде с солями Эрла (MEME), содержащей 7,5% лактозы и 2,5% сывороточного альбумина человека, или в MEME, содержащей 10% сорбита. Однако вирусы можно разбавлять непосредственно в физиологически приемлемом растворе, таком как стерильный физиологический раствор или стерильный солевой буфер. В другом примере вирусы можно вводить и составлять таким же образом, например, как вакцина против желтой лихорадки 17D, например, в качестве очищенной от примесей суспензии инфицированной ткани куриного эмбриона или жидкости, собранной от клеточных культур, инфицированных химерным вирусом.

Вакцины по этому изобретению можно вводить с использованием способов, хорошо известных в данной области, и специалисты в данной области могут легко определить приемлемые количества подлежащих введению вакцин. Количество, которое определяют как приемлемое количество вируса для введения, можно определять с учетом таких факторов, как, например, размер тела и общее состояние здоровья субъекта, которому намереваются вводить вирус. Например, вирусы по этому изобретению можно готовить в качестве стерильных водных растворов, содержащих между 10² и 10⁸ , например от 10³ до 10⁷, инфекционных единиц (например, бляшкообразующих единиц или инфекционных доз тканевой культуры) в объеме дозы от 0,1 до 1,0 мл, для введения, например, посредством внутримышечного, подкожного или внутрикожного способов. Кроме того, вследствие того, что флавивирусы могут обладать способностью инфицировать организм человека через слизистые оболочки, например, пероральным способом (Gresikova et al., "Tick-born Encephalitis," In The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, Volume IV, 177-203), вирусы также можно вводить через слизистую оболочку. Кроме того, вакцины по этому изобретению можно вводить в виде однократной дозы или, необязательно, введение может включать в себя применение первичной дозы с последующей вторичной дозой, которую вводят, например, через 2-6 месяцев и которую специалисты в данной области определяют как приемлемую.

Необязательно, при введении вирусов по этому изобретению можно использовать адъюванты, которые известны специалистам в данной области. Адъюванты, которые можно использовать для повышения иммуногенности вирусов, включают в себя, например, липосомальные составы, синтетические адъюванты, такие как (например, QS21), мурамилдипептид, монофосфориллипид A, полифосфазин, олигонуклеотиды CpG или другие молекулы, для которых выявлено, что они действуют посредством активации молекул Toll-подобного рецептора (TLR) на поверхности клеток или на ядерных мембранах в клетках. Несмотря на то, что эти адъюванты, как правило, используют для усиления иммунных ответов на инактивированные вакцины, их также можно использовать совместно с живыми вакцинами. В случае живых вакцин могут быть пригодными как агонисты TLR, так и антагонисты. В случае вируса, доставленного через слизистую оболочку, например, перорально, в качестве адъювантов можно использовать адъюванты для слизистых оболочек, такие как термолабильный токсин E.coli (LT) или мутантные производные LT. Кроме того, в вирусы можно встраивать гены, кодирующие цитокины, которые обладают адъювантной активностью. Таким образом, гены, кодирующие цитокины, такие как GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 или IL-5, можно встраивать совместно с генами чужеродного антигена для изготовления вакцины, которая вызывает повышенные иммунные ответы, или для модулирования иммунитета, направленного более конкретно на клеточный, гуморальный ответы или ответы слизистой оболочки.

В случае вирусов денге и/или химерных флавивирусов, включающих в себя мембранный белок и оболочечный белок вируса денге, вакцинация против которых может включать в себя индукцию иммунитета против всех четырех серотипов вируса денге, вирусы по изобретению можно использовать для составления четырехвалентных вакцин. Любой или все вирусы, используемые в таких четырехвалентных составах, могут включать в себя одну или несколько мутаций, которые снижают висцеротропизм, как описано в настоящем описании. Вирусы можно смешивать с образованием четырехвалентных препаратов в любой момент времени в процессе составления или их можно вводить сериями. В случае четырехвалентной вакцины, можно использовать эквивалентные количества каждого вируса. Альтернативно количества каждого из различных вирусов, представленных в подлежащих введению вакцинах, может варьировать (WO 03/101397 A2).

Флавивирусы по изобретению также можно применять для доставки продуктов гетерологичных генов, таких как антигены вакцины или другие лекарственные средства (см., например, WO 02/102828; патент США № 6589531 и WO 02/072835).

В основе этого изобретения, частично, лежат следующие экспериментальные результаты.

Экспериментальные результаты и примеры

Уровень техники и сущность изобретения

В одном примере этого изобретения, мутации, такие как описанные выше мутации, вносили в химерную флавивирусную вакцину-кандидат, обозначаемую в настоящем описании как ChimeriVax -WN02, которая содержит капсид и неструктурные белки вируса желтой лихорадки (YF17D) и премембранный и оболочечный белки вируса лихорадки западного Нила (NY99), как описано ниже. Эту вакцину-кандидат тестировали в доклинических испытаниях и клинических испытаниях I фазы. Несмотря на то, что она оказалась высокоаттенуированной и иммунногенной у мышей и макак-резусов, она индуцировала более активную репликацию у яванских макак и у нескольких человек-добровольцев в испытаниях I фазы (N=45) по сравнению с контрольной вакциной против желтой лихорадки (YF) 17D, исходя из виремии после инокуляции. Даже несмотря на то, что она оказалась хорошо переносимой в испытаниях I фазы и высокоиммуногенной, исходя из уровней виремии, авторы настоящего изобретения провели исследования для дальнейшего улучшения профиля безопасности ChimeriVax -WN02 посредством направленного мутагенеза с целью получения небольшого снижения виремии у небольших животных (хомяков) по сравнению с вариантом ChimeriVax -WN02. Использовали три подхода к мутагенезу, и все они описаны в примерах, представленных ниже. В первом подходе в 3'-нетранслируемую область вируса (3'UTR) вносили небольшие нуклеотидные делеции. Во втором подходе вносили аминокислотные делеции в капсидный белок. В третьем подходе определенные аттенуирующие аминокислотные замены вносили в оболочечный белок вируса. Как описано ниже и в других частях настоящего описания, для получения вирусов по этому изобретению эти типы мутаций можно объединять друг с другом (и другими аттенуирующими или иным образом преимущественными мутациями).

ChimeriVax -WN02

С использованием стандартной двухплазмидной системы конструировали исходную химеру YF17D/WN, содержащую последовательность гена prM-E дикого типа из штамма NY99 вируса WN, обозначаемую как ChimeriVax -WN01 (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004). JE-специфичные последовательности гена prM-E в плазмидах pYF5'3'IV/SA14-14-2 (содержат 5'- и 3'-участки кДНК вируса вакцины ChimeriVax -JE) и pYFM5.2/SA14-14-2 (содержит большой промежуточный участок кДНК ChimeriVax -JE) заменяли соответствующими последовательностями кДНК исходного штамма NY99 WN. Вирус ChimeriVax -WN01 получали посредством лигирования in vitro фрагментов полученных плазмид pYWN5'3'N1 3 и pYWN5.2/5 с получением полноразмерной матрицы ДНК, с последующей транскрипцией in vitro и трансфекцией полученными транскриптами РНК клеток Vero. Было показано, что новый химерный вирус является высокоаттенуированным у мышей и макак-резусов по сравнению с WN NY99 и YF17D, хотя он сохранял небольшую степень нейровирулентности у взрослых мышей. Его дополнительно аттенуировали посредством внесения трех специфичных для вакцины SA14-14-2 JE аминокислотных замен в остатках E107, E316 и E440 (см. таблицу 3 ниже) оболочечного белка (E). Две новые плазмиды, содержащие эти мутации, были обозначены как pYWN5'3'NF3 2 и pYWN5.2 316/440#2. Исходя из результатов тестирования полученной тройной мутантной формы, обозначенной как ChimeriVax -WN02, у мышей и обезьян, было сделано заключение, что она является в достаточной степени аттенуированной для дальнейшего тестирования в клинических испытаниях I фазы. Испытания проводили у здоровых взрослых (N=30 для дозы инокуляции, составляющей 5 log₁₀ БОЕ, и N=15 для дозы 3 log₁₀ БОЕ). Неожиданно у нескольких добровольцев после инокуляции развилась виремия, которая оказалась выше со статистической значимостью (вплоть до 3,5 раз), чем в случае контроля YF-Vax. Это показало, что, несмотря на то, что вакцина была хорошо переносимой и иммуногенной, для получения более аттенуированного варианта вакцины ChimeriVax -WN можно провести дальнейшую разработку. Высокие уровни виремии могут указывать на чрезмерную репликацию вируса в периферических органах и в случае ряда вакцин могут представлять риск развития геморрагических симптомов, сходных с классической желтой лихорадкой, или энцефалита вследствие пересечения гематоэнцефалического барьера, которому может способствовать высокая виремия, исходя из знаний об энцефалитогенных флавивирусах.

Таким образом, единственным субоптимальным параметром вакцины ChimeriVax -WN02 по сравнению с ожиданиями была незначительно более высокая виремия после инокуляции, наблюдаемая у группы людей-добровольцев, что может указывать на чрезмерную репликацию в периферических органах (висцеротропизм). Поскольку исходный вирус ChimeriVax -WN02 представляет собой уже высокоаттенуированную вакцину-кандидат по сравнению с вирулентным изолятом дикого типа, авторы настоящего изобретения предприняли поиск с целью идентификации новой мутации(ий), которые не приводят к сверхаттенуации вакцины. Поиск авторов настоящего изобретения был направлен на мутации, которые предотвращают возникновение высокой виремии в соответствующей модели(ях) на животных (в эксперименте, описанном ниже, авторы настоящего изобретения использовали хомяков), а затем и у человека, но без значительного снижения эффективности.

Экспериментальные стадии, вовлеченные в получение и охарактеризацию новых кандидатов ChimeriVax -WN04, включали в себя:

- конструирование плазмидных ДНК, содержащих требуемые мутации. Конкретно, все мутации вносили в исходные плазмиды ChimeriVax -WN02 pYWN5'3'NF3 2 и pYWN5.2 316/440#2 посредством стандартного олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием способов простой или перекрывающейся ПЦР, с последующим лигированием полученных продуктов ПЦР в эти плазмиды и селекции мутантных плазмид посредством клонирования в E.coli и секвенирования отдельных клонов;

- лигирование in vitro больших фрагментов EagI-BspEI соответствующих плазмид серии pYWN5'3' и pYWN5.2 с получением полноразмерных матриц кДНК, с последующей линеаризацией посредством XhoI;

- транскрипцию in vitro полноразмерных матриц ДНК с помощью РНК-полимеразы SP6 с получением синтетической инфекционной РНК;

- получение мутантных вирусов ChimeriVax -WN04 посредством трансфекции клеток Vero с использованием липофектамина или электропорации и сбор образцов вируса пассажа 1 (P1), с последующим дополнительным пассированием в не содержащей сыворотки среде с получением в качестве продукта вируса P2;

- подтверждение жизнеспособности мутантного вируса посредством мониторинга цитопатического эффекта (CPE), анализа бляшкообразования супернатантов клеток и детекции вирусной РНК посредством чувствительной RT-PCR;

- подтверждение наличия требуемых мутаций посредством консенсусного секвенирования вирусной геномной РНК на уровне P2 (и предварительный анализ генетической стабильности посредством секвенирования вирусов, пассированных до уровня P5);

- анализ морфологии бляшек и свойств, касающихся роста, посредством стандартного титрования вирусов P2 в клетках Vero;

- анализ висцеротропизма в сирийских хомяках с образцами вируса P2 в количестве 5 log₁₀ БОЕ/доза посредством определения виремии после инокуляции на 1-9 сутки; анализ иммуногенности посредством измерения сывороточных титров специфичных в отношении вируса WN нейтрализующих антител на 30 сутки с использованием стандартного теста нейтрализации по 50% снижению бляшек (PRNT₅₀).

Как описано ниже, авторы настоящего изобретения вносили делеции в 3'UTR или капсидный (C) белок вируса ChimeriVax -WN02, стремясь достичь очень небольшого аттенуирующего эффекта в этой вакцине-кандидате с показанной высокой аттенуацией. Этого достигали посредством небольших делеций длиной 5-16 нуклеотидов в 3'UTR или делеций 3 аминокислот в белке C. Некоторые делеции в 3'UTR представляли собой короткие (5-6 нуклеотидов) делеции, которые были разработаны, исходя из предсказанной вторичной структуры 3'UTR вируса YF17D (Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999). Они были нацелены на специфичную дестабилизацию определенных предсказанных с помощью компьютера структур стебель-петля в центре 3'UTR, расположенных вне каких-либо элементов консервативной последовательности. В третьем подходе авторы настоящего изобретения вносили дополнительные аттенуирующие мутации SA14-14-2 в белок E ChimeriVax -WN02 тем же способом, который авторы настоящего изобретения использовали для разработки ChimeriVax -WN02 из ChimeriVax -WN01. Мониторинг эффектов этих модификаций проводили в модели на хомяках. Были идентифицированы варианты ChimeriVax -WN04, которые приводили к требуемому небольшому снижению висцеротропизма у хомяков.

Конструирование кандидатов ChimeriVax -WNQ4-3'UTR посредством внесения определенных делеций в 3'UTR

Как описано выше, организация специфичной для YF17D 3'UTR, являющаяся общей для всех вирусов ChimeriVax , представлена на фиг.1A. Она содержит в порядке от 3'-конца: (i) консервативную для всех флавивирусов последнюю с 3'-конца структуру стебель-и-петля, (ii) два элемента консервативной последовательности, CS1 и CS2, и (iii) три копии элемента повторяющихся последовательностей (RS), расположенные на 5'-конце 3'UTR (Chambers et al., Annu. Rev. Microbiol. 44:649-688, 1990). Одним важным признаком делеций в этом участке является их стабильность, поскольку спонтанная реверсия в процессе репликация вируса является практически невозможной. Внесенные авторами настоящего изобретения 11 делеций в вирус ChimeriVax -WN02 (с использованием плазмиды pYWN5'3'NF3 2) с получением новых кандидатов ChimeriVax -WN04-3'UTR представлены на фиг.1A и включают в себя:

- делецию dRS с удалением трех элементов RS (нуклеотиды 18-164, ATAACCGGG - TCCACAC, в 3'UTR YF17D; нумерация от первого нуклеотида 3'UTR после кодона терминации TGA вирусной ORF);

- четыре небольших делеции 5-6 нуклеотидов: dA (нуклеотиды 229-234, GCAGTG), dB (нуклеотиды 256-260, CAGGT), dC (нуклеотиды 293-297, CCAGA) и dD (нуклеотиды 308-312, CGGAG), расположенные между RS и CS2, разработанные для дестабилизации отдельных предсказанных с помощью компьютера структур стебель-петля/псевдоузел (Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999), представленные на фиг.2B;

- большую делецию 105 нуклеотидов d105 (нуклеотиды 218-321, TAAGCT - CCGCTA), с удалением большинства нуклеотидов между RS и CS2 (для DEN4 дикого типа был толерантен к аналогичной делеции, однако она значительно снижала репликацию in vitro и in vivo (Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996) и, таким образом, авторы настоящего изобретения ожидали, что она может привести к сверхаттенуации ChimeriVax -WN02);

- делецию 30 нуклеотидов d30 (нуклеотиды 322-351, CCACCC - GACGG) выше CS2, имитирующую мутацию 30, первоначально описанную, как аттенуирующую вирус DEN4 дикого типа (Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996; патент США № 6184024 B1);

- две делеции меньших размеров d7 (нуклеотиды 345-351, AAGACGG) и d14 (нуклеотиды 338-351, TGGTAGAAAGACGG) в участке 30, которые тестировали, поскольку авторы настоящего изобретения предположили, что описанная выше мутация d30 может приводить к сверхаттенуации ChimeriVax -WN02 in vitro и/или in vivo;

- две небольшие делеции 5 и 16 нуклеотидов в участке CS2, обозначенные как CS2d5 (нуклеотиды 360-364, GGTTA) и CS2d16 (нуклеотиды 360-375, GGTTAGAGGAGACCCT).

Мониторинг жизнеспособности мутантных вирусов проводили посредством внимательного микроскопического исследования CPE в процессе пассирования P1 и P2, а также последующего пассирования вплоть до P5 для оценки генетической стабильности жизнеспособных мутантных форм и для определения возможности восстановления жизнеспособности явно нежизнеспособных мутантных форм посредством каких-либо мутаций во втором участке. Данные этих исследований подтверждали посредством RT-PCR и анализа бляшкообразования в клетках Vero. Анализ бляшкообразования также давал важную информацию, касающуюся титров мутантного вируса, указывающих на связанные с ростом свойства в клетках Vero, и изменения морфологии бляшек, вызванного внесенными делециями. Соответствующие участки геномов жизнеспособных вирусов секвенировали на уровнях P2 и P5. Обобщенные результаты этих экспериментов представлены в таблице 1.

Исходя из данных в таблице 1, авторы настоящего изобретения сделали выводы.

1. Несмотря на большой размер делеции dRS, она не приводила к заметной аттенуации in vitro, поскольку мутантный вирус образовывал большие и прозрачные бляшки, сходные с бляшками контроля LP ChimeriVax -WN02 (контроль с большими бляшками; см. примечание 1 таблицы 1), и доходил до относительно высокого титра, составляющего 6×10 ⁶ БОЕ/мл. Этот результат был ожидаемым, поскольку аналогичная делеция практически не оказала эффекта на репликацию вируса YF17D in vitro (Bredenbeek et al., J. Gen. Virol. 84:1261-1268, 2003), и аналогичная большая делеция не снижала нейровирулентности вируса ChimeriVax -JE у мышей на стадии вскармливания.

2. Небольшие делеции dA, dB, dC и dD приводили к заметной аттенуации in vitro, оцененной по морфологии бляшек. Размеры бляшек всех четырех мутантных вирусов были уменьшены; бляшки вируса dD были непрозрачными (бляшки как контроля LP, так и контроля SP WN02 являются прозрачными). Вирусы достигали относительно высоких титров в процессе пассирования P2, превышая 6 log ₁₀ БОЕ/мл, что является желательным признаком при производстве (таблица 1; за исключением титра для мутантной формы dA, который нельзя было определить, поскольку она образует слишком маленькие бляшки, чтобы их можно подсчитать в этом эксперименте). Эти результаты указывают на то, что предсказанные структуры стебель-петля/псевдоузел (фиг.1B) существуют и являются важными для репликации флавивируса. В противоположность вирусу DEN4 дикого типа, который был толерантным к большим делециям в этом участке выше CS2 (Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996), большая делеция d105, охватывающая все структурные элементы, определяемые небольшими делециями, была сверхаттенуирующей (летальной) для вируса ChimeriVax -WN02.

3. Делеция d30, которая является аналогичной мутации 30 (Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996; патент США № 6184024 B1), а также более короткая делеция d14 в участке непосредственно перед CS2 были летальными. Единственной переносимой ChimeriVax -WN02 мутацией в этом участке была небольшая делеция d7. Она была аттенуирующей, поскольку она уменьшала структуру бляшки.

4. Небольшие делеции CS2d5 и CS2dl6 обладали умеренными аттенуирующими эффектами in vitro, поскольку содержащие делецию мутанты образовывали непрозрачные бляшки промежуточного размера. Ожидалось, что этим мутации влияют на предсказанную структуру стебель-петля, которая включает в себя последовательность участка рестрикции XbaI в нуклеотиде 10708, как показано на фиг.1B.

В этих экспериментах авторы настоящего изобретения впервые показали, что небольшие делеции вне консервативных элементов 3'UTR могут обеспечить некоторую степень аттенуации. Кроме того, авторы настоящего изобретения впервые показали, что избирательная дестабилизация отдельных предсказанных структур стебель-петля/псевдоузел приводит к аттенуации. Кроме того, существует множество предсказанных структур стебель-петля/псевдоузел в 3'UTR флавивирусов, включая вирус YF17D, обеспечивающих широкое множество возможностей достижения ряда аттенуирующих эффектов. Нацеливание на эти структуры или области между структурами далее можно осуществлять посредством небольших делеций, которые могут быть внесены специалистами в данной области. Далее можно ожидать, что мутагенез любой из этих структур, исходя из открытия авторов настоящего изобретения, обеспечивает некоторую степень аттенуации. Выбор из диапазона эффектов позволяет проводить селекцию мутантов с требуемой степенью аттенуации.

Таблица 1 Характеристики мутантов с делецией ChimeriVax -WN04-3'UTR in vitro
Мутация	Жизнеспособность мутантной формы	Титр Р2, БОЕ/мл	Морфология бляшек
dRS	жизнеспособна	6×106	большие, прозрачные
dA	жизнеспособна	N/D 2	маленькие
dB	жизнеспособна	6,3×10 6	меньше, чем в контроле SP,
dC	жизнеспособна	1,5×106	маленькие
dD	жизнеспособна	6,6×10 6	промежуточных размеров, непрозрачные
CS2d5	жизнеспособна	1,2×107	промежуточных размеров, непрозрачные
CS2d16	жизнеспособна	5,3×106	промежуточных размеров, непрозрачные
d7	жизнеспособна	5,2×106	меньше, чем в контроле SP
d14	нежизнеспособна	N/A	нет бляшек
d30	нежизнеспособна	N/A	нет бляшек
d105	нежизнеспособна	N/A	нет бляшек
Контроль WN02 LP1			большие, прозрачные
Контроль WN02 SP1			небольшие, прозрачные
1 Контрольные вирусы LP и SP (используемые для сравнения морфологии бляшек только в анализе бляшкообразования) выделяли предварительно посредством очистки из бляшек из изготовленного образца вируса ChimeriVax -WN02 P5, которые представляли собой группу больших бляшек (LP) и маленьких бляшек (SP); вариант SP появился вследствие накопления после аминокислотной замены M66 Leu на Pro 2 N/D - не определен, вследствие того, что размер бляшек был слишком маленьким при окрашивании нейтральным красным на 5 сутки после инфекции, чтобы их можно было подсчитать

Следует отметить, что истинные вторичные структуры 3'UTR флавивирусов, включая вирус YF17D, неизвестны, поскольку не существует доступных способов экспериментального доказательства их существования в случае целых вирусов, и, таким образом, опубликованные предсказания, например одно предсказание для YF17D Proutski и коллегами (фиг.1B), могут быть неточными. В относительно длинной молекуле РНК можно предсказать формирование множества альтернативных структур (Zuker et al., N.A.R. 19:2707-2714, 2001), и возможно, что на разных стадиях вирусного цикла образуются и функционируют различные структуры (в плюс- или минус-цепях). На истинные структуры может оказывать влияние образование различных псевдоузлов (Olsthoorn et al., RNA 7:1370-1377, 2001) и удаленные взаимодействия в РНК (например, циклизация РНК и другие взаимодействия) (Alvarez et al., J. Virol. 79:6631-6643, 2005), а также возможные взаимодействия РНК с организмом-хозяином и вирусными белками. Для дальнейшего усложнения интерпретации опубликованных результатов теоретических компьютерных предсказаний часто используют работу вручную, такую как первоначальная сборка частичных последовательностей с последующим вовлечением изначально предсказанных структур в структуры более длинных последовательностей РНК, искусственное применение N в ходе стадий первоначальной сборки и субъективная селекция предпочтительных элементов структуры (например, Mutebi et al., J. Virol. 78:9652-9665, 2004). Для этого авторы настоящего изобретения применяли сборку последовательности РНК 3'UTR YF17D с использованием широко используемого алгоритма предсказания Zuker. Предсказанная оптимальная структура представлена на Фиг.1C, которая отличается от предсказания Proutsky, представленного на фиг.1B. Важно, чтобы небольшие делеции dA, dB, dC, dD, d7 и d14 на фиг.1A и 1B, главным образом, дестабилизировали предсказанную оптимальную (фиг.1C) и субоптимальную структуры исходного YF17D. Пример одной из таких измененных оптимальных структур (для мутантной формы dC) представлен на фиг.1D. Напротив, делеции CS2d5 и CS2d16 (фиг.1A и 1B) не приводили к заметным изменениям оптимальной исходной структуры, указывая на то, что эти делеции могут аттенуировать вирус (аттенуация была показана в модели на хомяках для Chimed Vax -WN) посредством непосредственного изменения последовательности CS2, а не структуры 3'UTR или, альтернативно, посредством изменения некоторых субоптимальных структур. Таким образом, даже несмотря на то, что некоторые делеции были разработаны, исходя из предсказания структуры Proutski (фиг.1B), их истинный эффект может быть следствием дестабилизации элементов структуры, отличающихся от предсказанных структур стебель-петля на фиг.1B.

После пассирования мутантной формы dC от пассажа уровня P2 до P5 в не содержащих сыворотки клетках Vero для анализа генетической стабильности и секвенирования вируса P5 было обнаружено, что делеция пяти нуклеотидов спонтанно увеличилась в длину до 24 нуклеотидов (удалены нуклеотиды 277-300, TCTGGGACCTCCCACCCCA) (другие делеции (dRS, d7, CS2d5, CS2d16, dA, dB и dD) были стабильными в процессе указанного пассирования для определения генетической стабильности.) Эффект увеличения размера делеции состоял в том, что предсказанная вторичная структура стала сходной с исходной оптимальной структурой YF17D (фиг.1E; сравнить с фиг.1C). Это спонтанное изменение, по-видимому, является адаптацией клеточной культуры. Как вариант P2, так и вариант P5 были высокоаттенуированными и иммуногенными у хомяков (см. примечание 4 таблицы 5). Таким образом, вариант P5 мутантной формы dC может обладать желательным для вакцины фенотипом.

Конструирование кандидатов ChimeriVax -WN04-C посредством внесения конкретных делеций в специфичный для YF17D капсидный белок C

Проведенный авторами настоящего изобретения компьютерный анализ структуры белка C YF17D с использованием способов ProteinPredict и Protean позволил предсказать, что его общая организация по существу не отличается от TBE (фиг.2B). Авторы настоящего изобретения сделали вывод, что большие делеции в белке в ChimeriVax -WN02, наиболее вероятно, приводят к сверхаттенуации. Таким образом, авторы настоящего изобретения внесли пять небольших делеций из 3-4 аминокислот, как представлено на фиг.2B (удаленные остатки заключены в прямоугольники). В плазмиде pYWN5'3'NF3 2 ChimeriVax -WN02 конструировали делеции, которые охватывают ген белка C полностью. Первые три делеции (C 1-3; каждая длиной 3 аминокислоты) расположены в одной и той же общей области, описанной для TBE Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002. Однако авторы настоящего изобретения расположили мутации таким образом, чтобы иметь возможность тестирования важности определенных структурных элементов: делеция C1 расположена выше как центрального гидрофобного участка, так и предсказанной спирали I, C2 нарушает только спираль I, и C3, как ожидали, нарушает как спираль I, так и центральный гидрофобный участок. Кроме того, разработали делецию C4 (длиной 4 аминокислоты) для нацеливания на предсказанную спираль III в C-концевом положительно заряженном участке белка и делецию C5 (3 аминокислоты), расположенную между спиралями III и IV (она также удаляет участок расщепления вирусной протеазы NS2b/NS3 на C-конце внутриклеточной формы белка; она была внесена для определения возможности компенсации ожидаемого дефекта процессинга полибелка посредством мутаций во втором участке).

Обобщенные результаты охарактеризации in vitro мутантных форм WN04-C представлены в таблице 2. Только мутантные формы C1 и C2 были жизнеспособными, в то время как делеции C3-C5 были летальными. Несмотря на то, что сильный отрицательный эффект мутации C5 не был удивительным, было интересно, что небольшая делеция в C-концевом положительно заряженном участке белка (C4) была летальной, подтверждая, что вирусы не толерантны к изменениями последовательности/структуры в этом участке. Наиболее удивительным наблюдением было то, что делеция C3 также была летальной, поскольку она расположена в той же общей области, что и делеции в вирусе TBE, к которым он был толерантен. Наличие делеций в вариантах C1 и C2 подтверждали секвенированием. Результаты секвенирования всего участка структурного белка в вирусах на уровнях P2 и P5 представлены в таблице 2. Несмотря на то, что в варианте C1 произошло накопление замен в остатках M14 и E313, которое проявлялось в виде гетерогенности в пассаже P5, но не P2 (полагают, что изменение E313 представляет собой адаптацию к условиям роста вируса без сыворотки, накопление которой ранее наблюдали в ChimeriVax -WN02), вариант C2 оказался генетически стабильным. Последний вирус обладал гетерогенностью в остатке M71 как в P2, так и в P5, однако соотношение мутантной формы к немутантной форме (~80%) не изменялось при пассировании. Исходя из морфологии бляшек, вариант C1 не был аттенуированным по сравнению с ChimeriVax -WN02, в то время как вариант C2 оказался аттенуированным, поскольку он образовывал небольшие бляшки, подтверждая значение спирали I. Обе мутантных формы достигали высоких титров в клетках Vero (~7 log₁₀ БОЕ/мл). Не существует опубликованных ранее данных, указывающих на то, что такие небольшие делеции могут аттенуировать флавивирус или обладают практической значимостью. Успешное получение жизнеспособных мутантов C1 и C2 в исследовании авторов настоящего изобретения является доказательством того, что вирус YF17D или вакцинные вирусы ChimeriVax могут быть толерантными к небольшим делециям выше центрального гидрофобного участка и в начале -спирали I.

Таблица 2 Характеристики мутантных форм ChimeriVax -WN04-C in vitro
Мутация	Жизнеспособность мутантной формы	Титр Р2, БОЕ/мл	Морфология бляшек	Последовательность при Р22	Последовательность при Р52
С1	жизнеспособна	1,9×107	большие, прозрачные	делеция ОК; других мутаций нет	делеция ОК, 20% М14 N на Н, 40% Е313 G на R
C2	жизнеспособна	1,5×107	небольшие	делеция ОК; 80% М71 А на Т	делеция ОК; 80% М71 А на Т
С3	нежизнеспособна	N/A	нет бляшек	нет продукта RT-PCR	нет продукта RT-PCR
С4	нежизнеспособна	N/A	нет бляшек	нет продукта RT-PCR	нет продукта RT-PCR
С5	нежизнеспособна	N/A	нет бляшек	нет продукта RT-PCR	нет продукта RT-PCR
Контроль WN021			большие, прозрачные
1 Контрольный вирус WN02 (используемый для сравнения морфологии бляшек в анализе бляшкообразования) представлял собой образец P1, полученный посредством трансфекции клеток транскриптами РНК in vitro ChimeriVax -WN02 2 Целый участок структурного белка (гены C-prM-E) секвенировали консенсусным способом для подтверждения намеченной делеции и для проверки наличия любых других аминокислотных замен/гетерогенности

Конструирование кандидатов ChimeriVax -WN04-E посредством внесения дополнительных специфичных для SA14-14-2 замен в оболочечный белок (E)

Остатки белка E, которые отличаются в вирусе JE дикого типа (Nakayama) и вакцинном штамме SA14-14-2, а также остатки в соответствующих положениях в WN NY99 представлены в таблице 3. Как описано выше, требуемого уровня аттенуации вакцинного варианта ChimeriVax -WN02 первоначально достигали посредством внесения трех специфичных для SA14-14-2 остатков, E107, E316 и E440, в исходно сконструированную химеру YF17D/WN, которая содержала специфичные для штамма NY99 дикого типа гены prM-E (вирус WN01). ChimeriVax -WN02 (и WN01) также содержит остаток Ser E227, совпадающий в вирусах SA14-14-2 и NY99.

Таблица 3 Специфичные для вакцины JE SA14-14-2 остатки в оболочечном белке E, предназначенные для объединения в ChimeriVax -WN04 для снижения висцеротропизма ChimeriVax -WN021
Аминокислота2	JE дикого типа (Nakayama)	Вакцина JE SA14-14-2	WN дикого типа (NY99)
107	L	F	L
138	E	K	E
176	I	V	Y
177	T	A	T
227	P	S	S
244	E	G	E
264	Q	H	Q
280	K	M	K
316	A	V	A
440	K	R	K
1 Специфичные для SA-14-14-2 остатки, уже имеющиеся в ChimeriVax-WN02, показаны жирным цветом; следует отметить, что остаток E227 является одинаковым (Ser) в SA14-14-2 и WN NY99 и, таким образом, не требует замены посредством специфичного мутагенеза 2 Номера аминокислот соответствуют нумерации в белке E вируса WN

Все плазмиды, сконструированные ранее в процессе селекции вакцины-кандидата WN02 (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004), и плазмиды, которые позднее сконструировали авторы настоящего изобретения (две нижних конструкции pYWN5'3' и pYWN5.2), изображены на фиг.4. Требуемый набор мутаций SA14-14-2 в белке E химерного вируса получали посредством лигирования in vitro определенных пар фрагментов ДНК из соответствующих плазмид pYWN5'3' и pYWN5.2 через участок рестрикции EagI в гене E, например, ChimeriVax -WN02 был получен посредством лигирования pYWN5'3'NF3 2 и pYWN5.2 316/440#2. Некоторые из сочетаний тестировали ранее у мышей и обезьян, что привело к селекции кандидата WN02 для дальнейшего тестирования у человека (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004). Мутация M66 (замена Leu на Pro в остатке белка 66 белка M), которую авторы настоящего изобретения вносили в две новых плазмиды pYWN5'3', представляла собой адаптацию к клеточной культуре, которая накапливалась в вакцине ChimeriVax -WN02 в процессе крупномасштабного изготовления. Она снижала размер бляшек, но не оказывала эффекта на нейровирулентность у мыши (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004). В соответствии с полученными недавно результатами авторов настоящего изобретения испытаний I фазы у человека и дополнительных экспериментов на обезьянах, она снижала висцеротропизм вируса у приматов и, таким образом, по-видимому, является преимущественной мутацией для производства вакцины, повышая безопасность. Вследствие того, что современная вакцина ChimeriVax -WN02 представляет собой смесь больших и небольших бляшек, индуцирующих немного более высокую, по сравнению с ожидаемой, виремию у некоторых людей, проводили дополнительную работу для снижения висцеротропизма. Например, вариант небольшой бляшки недавно был очищен из бляшек и в настоящее время проходит тестирование на обезьянах. Новые сконструированные варианты с не тестированными ранее сочетаниями мутаций описаны ниже.

Таблица 4 Новые варианты ChimeriVax -WN04-E: внесенные мутации и охарактеризация вирусов in vitrо
Вирус1	Намеченные мутации	Титр Р2	Видимая морфология бляшек3	Последовательность при Р24	Последовательность при Р55
3	WN02+E138	6,1×106	<L+S	ОК, однако возможна Е166 R/L	95% T166 R на L, 80% E313, E138 K/T
4	WN02+E138+M66	4,0×104	Маленькие	n.d.	n.d.
5	WN02+E176, 177, 280	6,8×107	<L+S	ОК, но Е313 G/R (80%R)	E313, M63 F на S, 50% E167 F на V
5A	WN02+E176, 177, 280	6,75×10 7	<L+S	n.d.	n.d.
6R	WN02+E176, 177, 244, 264, 280	2,15×10 7	<L+S	Не ожидавшаяся Е244; Е167 F на L, возможна E221 L/F, молчащая нуклеотидная замена	n.d.
6А	WN02+E176, 177, 244, 264, 280	4,0×10 6	<L+S		Е244 V вместо ожидаемой G, E313, 50% М67 (L на S)
7	WN02+E138, 176, 177, 280	1,18×10 7	<L+S	ОК, но отчетливая Е313 G на R	E313, E166 R на Q, возможные следовые количества Е138 wt E
7A	WN02+E138, 176, 177, 280	6,95×106	<L+S	n.d.	n.d.
11	Все десять остатков SA14-14-2	нет	нет	Нет продукта RT-PCR	Нет продукта RT-PCR
1R контроль	WN02	2,45×107	L+S	ОК	n.d.
2 контроль	WN02+M66	2,95×10 6	S	ОК, но Е313 G/R (~20%R)	Е313, только 20% М66 (реверсия)
1 Все вирусы получали посредством трансфекции клеток Vero; в обозначениях вирусов, "A" указывает на изменение при получении полноразмерной матрицы ДНК (лигирование 3 фрагментов) и "R" указывает на вирус, полученный после повторной трансфекции; вирусы, обозначенные затемнением, отбирали для дальнейшего тестирования у хомяков 2 Специфичные для WN02 SA14-14-2 остатки: E107, 227, 316 и 440; замена M66 представляет собой адаптацию к клеточной культуре, о которой известно, что она приводит к уменьшению размера бляшек вируса WN02 3 L+S, наблюдаемая смесь больших и маленьких бляшек (в вирусе 1R); S, небольшие бляшки; <L+S, бляшки, имевшие вид смеси больших и маленьких бляшек, однако общий размер был немного меньше, чем для вируса 1R (L+S) 4 Целый участок структурного белка (гены C-prM-E) секвенировали консенсусным способом для подтверждения намеченных мутаций (подтверждали каждую, если нет иных указаний); другие выявленные аминокислотные замены/гетерогенность перечислены

Обобщенные данные по жизнеспособности и охарактеризации in vitro новых конструкций ChimeriVax -WN04-E представлены в таблице 4. Вирус 11, в котором авторы настоящего изобретения пытались объединить все десять специфичных для SA14-14-2 остатков, оказался нежизнеспособным, поскольку он не индуцировал CPE после трансфекции, не образовывал бляшек в последующих пассажах в анализе бляшкоообразования, и его геномная РНК не выявлялась в супернатантах клеток посредством чувствительной реакции RT-PCR. Другие новые вирусы, содержащие от 5 до 9 замен SA14-14-2, представленные в таблице 4, были жизнеспособными (все из образцов 3, 4, 5, 6 и 7). Большинство из них оказались слабоаттенуированными, поскольку их бляшки были немного меньше, чем бляшки контроля WN02 (вирус 1R), в то время как они достигали относительно высоких титров, превышающих 6-7 log₁₀ БОЕ/мл; единственным исключением был вирус 4, который оказался сверхаттенуированным (маленькие бляшки и очень низкий титр) вследствие одновременного внесения мутаций E138 и M66.

Намеченные изменения SA14-14-2 подтверждали посредством консенсусного секвенирования в вирусах 3, 5 и 7. Вирус 6 представлял интерес, поскольку в его образце 6R отсутствовала одна из намеченных мутаций при секвенировании на уровне P2: он имел остаток Glu дикого типа в остатке E244 вместо Gly (в нем также отсутствовали две молчащие нуклеотидные замены, преднамеренно внесенные ниже триплета E244 для создания участка рестрикции SphI). Другой образец, 6A, имел Val в положении E244, который отличается от последовательности как WN дикого типа, так и SA14-14-2 (он обладал предусмотренным участком SphI). Эти замены в вирусных последовательностях были неожиданными, поскольку наличие целого специфичного для вируса участка в препарате плазмиды pYWN5,2/8mut, используемой для получения транскриптов РНК 6R, 6A и 11 in vitro, было подтверждено посредством секвенирования. Возможно, что специфичная для SA14-14-2 замена E244 является летальной для ChimeriVax -WN, отдельно или в сочетании с некоторыми другими заменами, такими как E264, что может объяснить причину того, что вирус 11 не восстанавливался. Выявленные модификации этого остатка в образцах 6R и 6A, в которых восстановилась жизнеспособность, могут быть следствием ошибки вирусной полимеразы в процессе репликации вируса (наиболее вероятно, в случае вируса 6A), нестабильности плазмиды pYWN5,2/8mut в бактериях или небольших примесей другого бактериального клона, который не был выявлен при секвенировании плазмиды. Отсеквенированные вирусы P2 были относительно гомогенными, за исключением того, что некоторые вирусы начали демонстрировать накопление дополнительных мутаций, некоторые из которых можно было ожидать (например, замена E313 G на R, которая представляет собой известную адаптацию ChimeriVax -WN к культивированию клеток без сыворотки, которая не влияет на биологический фенотип). Более разнообразные мутации накапливались в процессе выращивания до уровня P5. Исходя из этих наблюдений, вирусы 3, 5, 6A и 7 на уровне P2 (затемненные в таблице 4) были выбраны для дальнейшего тестирования на висцеротропизм/иммуногенность у хомяков.

Анализ висцеротропизма и иммуногенности вариантов ChimeriVax -WN04 у хомяков

Мышей используют в качестве чувствительной модели на небольших животных с целью показать сниженную нейровирулентность, которая является признаком аттенуации, и высокую иммуногенность вакцин-кандидатов ChimeriVax -WN (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004).

Однако эту модель нельзя использовать для предсказания уровня висцеротропизма у обезьян и людей, который является другим важным признаком аттенуации, поскольку химеры не индуцируют поддающейся выявлению виремии у мышей. Некоторые флавивирусы индуцируют высокий уровень виремии у хомяков, как недавно было показано для вируса WN дикого типа (Tesh et al., Emerg. Inf. Dis. 8:1392-1397, 2002). Проведенные недавно авторами настоящего изобретения исследования с использованием вакцины ChimeriVax -WN02 (смесь вирусов, образующих большие и небольшие бляшки) и очищенных из бляшек вариантов LP и SP показали высокую корреляцию между виремией, вызванной этими вирусами у самок сирийских хомяков, и виремией, наблюдаемой у людей-добровольцев и явянских макак. Конкретно, вариант LP, который является менее аттенуированным для людей, индуцирует легко выявляемую виремию у хомяков, в то время как более аттенуированный вирус SP индуцировал очень низкую или не поддающуюся выявлению виремию. Авторы настоящего изобретения использовали эту новую модель на животных для изучения наличия снижения висцеротропизма посредством описанных выше мутаций WN04 без нарушения развития эффективного иммунного ответа против WN.

Все способы выполняли в соответствии с требованиями NIH, касающимися гуманного обращения с лабораторными животными согласно протоколу, одобренному Acambis IACUC. Самкам сирийских хомяков в возрасте четырех недель подкожно инокулировали (SC) 5 log₁₀ БОЕ выбранных кандидатов ChimeriVax -WN04, а также контрольных вирусов WN02 LP и SP или ~4 log₁₀ БОЕ YF17D, с последующим определением виремии на 1, 3, 5, 7 и 9 сутки (проводили забор крови у животных под анестезией и титры вирусов в полученной сыворотке определяли посредством анализа бляшкообразования) и антительных ответов на 30 сутки, определяемых посредством стандартного теста нейтрализации по 50% снижению бляшек (PRNT₅₀), у отдельных животных. Результаты представлены в таблице 5.

1 Объемы инокуляции: 100 мкл; дозы инокуляции: 5 log10 БОЕ для вирусов ChimeriVax -WN04 и контролей WN02 LP и SP, и ~4 log10 БОЕ для YF17D (YF-VAX); животным с имитирующей инокуляцией вводили 100 мкл разбавленной среды (MEM, 50% ЭТС). 2 Уровень выявления: 25 БОЕ/мл. 3 Титры нейтрализующих антител определяли посредством PRNT50 на 30 сутки против: ChimeriVax -WN02 для всех групп, в которых инокулировали варианты ChimeriVax -WN, или YF17D для группы YF-VAX, или против обоих из них в группах с имитирующей инокуляцией. 4 В отдельном эксперименте с хомяками тестировали образец пассажа 5 (P5) мутантной формы dC, в которой делеция спонтанно увеличилась до 24 нуклеотидов (см. текст выше). Вирус оставался высокоаттенуированным (средняя пиковая виремия 25 БОЕ/мл, средняя длительность 3,5 суток) и иммуногенным (PRNT50 GMT равен 452 на 33 сутки). Также тестировали вирусы P2 CS2d5 и CS2d16 и было выявлено, что они являются высокоаттенуированными и иммуногенными (средняя пиковая виремия (БОЕ/мл)/средняя длительность виремии (сутки)/PRNT 50 GMT на 33 сутки составляют 137/2,75/127 и 343/2,25/905, соответственно). Все животные, которых иммунизировали этими вариантами WN04, включая P5 dC, были высокозащищенными, в противоположность контролю WN02 с небольшими бляшками, при контрольном заражении через ~10 месяцев после иммунизации посредством WN дикого типа.

Контроль ChimeriVax -WN02 LP (вакцинный вариант со сниженной аттенуацией) индуцировал высокую пиковую виремию у 5 инокулированных им хомяков в диапазоне от 1650 до 2925 БОЕ/мл (среднее значение 2285 БОЕ/мл). Эти животные обладали наивысшими титрами нейтрализующих антител против WN на 30 сутки в диапазоне 5120-10240 (GMT 6760). Контроль WN02 SP не индуцировал поддающейся детекции виремии у 4 из 5 животных; низкий уровень виремии, выявленный у одного хомяка на 3 сутки, находился на границе чувствительности, составляющей 25 БОЕ/мл. Специфичный в отношении WN антительный ответ был очень низким у этих животных. Он не поддавался выявлению у двух хомяков (титр <10); другие три имели низкие титры антител, составляющие 40-320. Интересно, что инокуляция YF-VAX не вызвала поддающейся детекции виремии, однако привела к высокому специфичному в отношении YF антительному ответу (титры 320-10240 PRNT₅₀; GMT 2150). Как и ожидали, животные после имитирующей инокуляции не имели специфичных в отношении WN или YF нейтрализующих антител на 30 сутки.

Для достижения небольшого снижения висцеротропизма у приматов теоретически авторы настоящего изобретения хотели идентифицировать в модели на хомяках ряд вариантов ChimeriVax -WN04, вызывающих виремию в диапазоне, который является более низким по сравнению с диапазоном для вируса LP, однако в тоже время индуцирует более высокий иммунный ответ, чем вирус SP. Среди 11 тестированных вирусов ChimeriVax -WN04, большинство из них оказались по меньшей мере в некоторой степени аттенуированными in vivo по сравнению с вирусом LP (таблица 5), исходя из уровней виремии после инокуляции (средние титры пиковой виремии варьировали от <25 до 1460 БОЕ/мл). Среди менее аттенуированных вариантов были мутантная форма C1 с делецией в белке C, мутантная форма dRS с делецией в 3'UTR и варианты WN04-E № 3 и № 5. Эти вирусы индуцировали высокие нейтрализующие антительные ответы (GMT 1110-2560). Один вирус, вариант WN04-E #6A, был явно сверхаттенуированным, что было показано как по очень низкой виремии, так и по слабому антительному ответу. Несомненно, последний вариант может быть исключен из дальнейшего тестирования у обезьян/людей. Кандидаты ChimeriVax -WN04, обладающие особенно пригодными характеристиками, представляют собой мутантную форму C2 с делецией в капсидном белке, мутантные формы d7, dB, dC и dD3 с небольшими делециями в 'UTR, и вариант E#7. Эти вирусы вызывали от умеренно сниженной до значительно сниженной виремию у хомяков (средние титры пиковой виремии в диапазоне <25-680 БОЕ/мл), которая, тем не менее, не предотвращала появления сильного иммунного ответа (GMT нейтрализующего антитела 370-2940).

Чтобы показать эффективность в отношении защиты, всех животных заражали внутрибрюшинно на 62 сутки после иммунизации посредством 4×10⁵ БОЕ вирулентного вируса WN дикого типа (штамм NY382/99). Все животные, которые имели высокие титры нейтрализующих антител против WN (на 30 сутки), конкретно в группах WN04-C1, C2, dRS, d7, dB, dC, dD, E#3, E#5, E#7 и контроля WN02 LP (см. в таблице 5), были полностью защищены, исходя из отсутствия после заражения виремии (определяемой в сыворотке, полученной на 1, 3, 5, 7 и 9 сутки), снижения массы тела, симптомов или гибели. По меньшей мере, несколько животных в других группах, конкретно E#6A, контроля WN02 SP, YF-VAX и имитации, которые не имели высоких титров нейтрализующих антител против WN, не были защищенными, исходя, по меньшей мере, из одного из указанных выше параметров. У всех животных YF-VAX и с имитирующей иммунизацией была высокая виремия на 1-5 сутки (пиковый титр виремии составлял вплоть 9,75×10⁵ БОЕ/мл). У большинства из этих животных возникло заболевание, произошло снижение массы и 2 животных в группе YF-VAX погибли. У двух животных в группе E#6 и 1 животного в группе WN02 SP был показан низкий уровень виремии на 1-2 сутки.

Эффекты мутаций в вариантах ChimeriVax -WN04 на рост вируса в клетках печени

Для получения дополнительного доказательства сниженного вследствие мутаций WN04 висцеротропизма, авторы настоящего изобретения провели анализ кинетики роста некоторых из наиболее перспективных вариантов ChimeriVax -WN04 (выбранных на основе данных, представленных выше, например, на основе низкой виремии и высокой иммуногенности у хомяков; см. в таблице 5) в клеточной линии гепатомы человека HepG2. Поскольку вирус YF представляет собой гепатотропный вирус, авторы ожидали увидеть снижение репликации вариантов WN04 по сравнению с вирусом ChimeriVax -WN02 LP (вакцина со сниженной аттенуацией). Монослои клеток HepG2 инфицировали с MOI 0,005 БОЕ/мл, аликвоты содержащих вирус супернатантов собирали каждые сутки (вплоть до 10 суток), а затем определяли титры вируса с помощью анализа бляшкообразования в клетках Vero. Аттенуированные варианты WN04, включенные в этот эксперимент, представляли собой мутантные формы d7, dB, dC и dD с делецией в 3'UTR, мутантную форму C2 с делецией в капсидном белке (а также менее аттенуированную мутантную форму C1 в качестве дополнительного контроля) и E#7 с мутантным оболочечным белком. За исключением мутантной формы C1, все другие вирусы WN04 реплицировались менее эффективно по сравнению с вирусом WN02 LP (фиг.5), однако большинство из них (за исключением dD) росли лучше, чем вариант WN02 SP, который предположительно представлял собой сверхаттеруированный вакцинный вариант для людей. Это указывает на то, что некоторые мутации WN04 могут снизить гепатотропизм вакцин у человека, что является высоко желательным качеством. Этот эксперимент далее показывает преимущества кандидатов E#7, d7, dC и dD, обладающих наиболее заметным снижением репликации по сравнению с WN02 LP, над мутантой формой dD, вероятно являющейся менее гепатотропной.

Двойные мутантные формы ChimeriVax -WN04; анализ висцеротропизма и иммуногенности у хомяков

Сочетание различных типов аттенуирующих мутаций должно привести к дополнительной аттенуации и более надежному фенотипу вакцины с меньшей вероятностью восстановления патогенности. Для этого было получено четыре варианта с двойной мутацией ChimeriVax -WN04, в которых делеция C2 сочеталась с делециями в 3'UTR d7, dB или dD или с сочетанием мутаций E#5 в оболочечных белках (дополнительные E176, 177 и 280 специфичные для SA14-14-2 изменения). Матрицы ДНК для транскрипции in vitro получали посредством стандартного лигирования двух или трех фрагментов с использованием соответствующих участков плазмид 5'3' и 5.2, сконструированных ранее для мутантных форм WN04 с одной мутацией. Их транскрибировали с помощью РНК-полимеразы SP6 и вирусы выделяли после электропорации клеток Vero с транскриптами РНК. Вирусы P2 титровали в клетках Vero. Все четыре двойных мутантных формы оказались высокоаттенуированными в клеточной культуре, поскольку они образовывали маленькие бляшки меньших размеров, чем бляшки контролей WN02 LP и SP. Мутантная форма C2+E5 имела высокий титр, составляющий 1,3×10 ⁷ БОЕ/мл, в то время как другие три вируса (C2+d7, C2+dB и C2+dD) имели промежуточные титры, составляющие 4,2-6,1×10 ⁵ БОЕ/мл (таблица 6).

Таблица 6 Характеристики двойных мутантных форм ChimeriVax -WN04 in vitro
Вирус	Титр Р2, БОЕ/мл	Морфология бляшек на 5 сутки
С2+Е5 Р2	1,3×10 7	маленькие (в среднем ~ 0,5 мм)
С2+d7 Р2	4,2×10 5	маленькие
С2+dB P2	6,1×105	маленькие
С2+dD P2	6,1×105	маленькие
Контроль WN02 LP	9×106	большие/небольшие, прозрачные
Контроль WN02 SP	5,8×107	небольшие, прозрачные

Для оценки аттенуации и иммуногенности самкам сирийских хомяков в возрасте четырех недель подкожно (SC) инокулировали 5 log ₁₀ БОЕ двойных мутантных форм, а также контрольные вирусы WN02 LP и SP или разбавитель (имитация). Виремию определяли на 1-10 сутки и антительные ответы определяли на 35 сутки посредством PRNT₅₀. Результаты представлены в таблице 7. Четыре двойных мутантных формы были способны к репликации, вызывая поддающийся выявлению низкий уровень виремии у большинства животных, за исключением C2+d7, в случае которого виремия была выявлена только у одного животного. Эти вирусы были значительно более аттенуированными по сравнению с вирусом WN02 LP (средняя пиковая виремия ~7000 БОЕ/мл) и оказались более аттенуированными по сравнению с соответствующими формами с одной мутацией (например, сравнить средние титры пиковой виремии с титрами в таблице 5). Хотя виремия не была выявлена у каждого животного, у всех животных развивался нейтрализующий антительный ответ на высоком уровне. Значения PRNT₅₀ GMT для C2+E5, C2+d7, C2+dB и C2+dD составляли 1:640, 1:840, 1:1280 и 1:640, соответственно.

1Предел выявления виремии 50 БОЕ/мл; сутки 8-10 также тестировали, виремии выявлено не было. 2Вследствие того, что разведение сыворотки, вызывающее 50% нейтрализацию, не было получено для всех животных, это значение может быть значительно выше, чем показано.

Для того чтобы показать наличие защиты, животным проводили контрольное заражение внутрибрюшинно на 36 сутки посредством высоколетального вируса WN дикого типа, штамм NY385/99, который является более патогенным, чем NY382/99, использованный в приведенных выше экспериментах, в количестве 2×10⁵ БОЕ/доза. Животные, иммунизированные мутантными формами с двойной мутацией WN04, а также контроль WN02 LP были полностью защищены, поскольку у них после заражения не происходило виремии (определенной на 2, 4 и 6 сутки) и снижения массы тела, которые являются признаками заболевания. Напротив, контрольные животные с иммунизацией посредством WN02 SP и имитирующей иммунизацией не были защищены. У них развивалась виремия (пиковые титры 250-3000 и 2000 БОЕ/мл для животных с иммунизацией посредством WN02 SP и имитирующей иммунизацией, соответственно), были выявлены симптомы заболевания и снижение массы тела. Одно из 5 и 4 из 5 животных в группах с иммунизацией посредством WN02 SP и имитирующей иммунизацией, соответственно, погибли. Двое выживших животных из группы WN02 SP и 1 выжившее животное из группы с имитирующей иммунизацией были парализованы.

Таким образом, авторы настоящего изобретения успешно получили несколько кандидатов ChimeriVax -WN04, которые являются более аттенуированными по сравнению с предшествующей вакциной ChimeriVax -WN02, однако не являются сверхаттенуированными, с использованием уникальных модификаций трех различных способов аттенуации флавивируса и внесения различных типов аттенуирующих мутаций по отдельности или в сочетаниях.