бактерия escherichia coli - продуцент янтарной кислоты и способ получения янтарной кислоты

Формула изобретения

1. Бактерия Escherichia coli - продуцент янтарной кислоты, модифицированная за счет изменения нуклеотидной последовательности промотора и сайта связывания рибосом, контролирующих экспрессию генов aceEF-lpdA оперона в хромосоме бактерии, таким образом, что экспрессия генов асеЕ, aceF и lpdA в указанной бактерии усилена.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная экспрессия усилена за счет замены в хромосоме бактерии нуклеотидной последовательности природного промотора, контролирующего экспрессию генов aceEF-lpdA оперона, на более сильный промотор.

3. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что приобретает активность пируваткарбоксилазы за счет введения в бактерию молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий фермент, обладающий активностью, классифицируемой как К.Ф.6.4.1.1.

4. Способ получения янтарной кислоты путем культивирования бактерии по любому из пп.1-3 в питательной среде и выделения янтарной кислоты из культуральной жидкости.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к способу получения янтарной кислоты с использованием бактерии рода Escherichia, модифицированной таким образом, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов aceEF-lpdA оперона, кодирующих белки компоненты NAD⁺-восстанавливающего пируватдегидрогеназного ферментативного комплекса.

Описание предшествующего уровня техники

Янтарная кислота, традиционно получаемая нефтехимическим синтезом, является одним из соединений, продукция которых из возобновляемого сырья является наиболее востребованной в связи с ростом цен на нефть и ограниченностью ее запасов. Янтарная кислота служит одним из важнейших "строительных блоков" для получения широкого спектра химических веществ с высокой добавленной стоимостью, также синтезируемых в настоящее время из нефтепродуктов. Ожидаемый рынок янтарной кислоты составляет более 300000 тон/год.

Наиболее эффективным процессом микробиологического получения янтарной кислоты и ее солей является анаэробное сбраживание сахаров, в частности глюкозы, с формированием целевого вещества в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот. В данном процессе максимально возможный коэффициент конверсии субстрата в продукт в расчете на углерод составляет 2 моль/моль. Это обуславливается фиксацией CO₂ на стадии образования из гликолитических интермидиатов оксалоацетата - предшественника в анаэробном пути сбраживания глюкозы в янтарную кислоту. Однако практической реализуемости данного процесса препятствует его окислительно-восстановительная несбалансированность. Конверсия каждой из двух молекул оксалоацетата, полученных из интермедиатов гликолитической утилизации глюкозы, в янтарную кислоту требует 2-х восстановленных эквивалентов (NADH), в то время как в ходе гликолиза формируется лишь половина необходимых эквивалентов (1 NADH на одну молекулу оксалоацетата).

Этим обуславливается то, что лучшие показатели продукции янтарной кислоты специально полученными рекомбинантными штаммами достигаются в процессах биосинтеза, представляющих сочетание двух биохимических путей - восстановительной части цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта. Соотношение вкладов каждого из путей в биосинтез янтарной кислоты определяет конечный выход целевого вещества.

Глиоксилатный шунт, потребляющий меньшее количество NADH на каждую синтезируемую молекулу янтарной кислоты, выступает в данном случае как донор "остаточных" гликолитических NADH для высокопродуктивного формирования целевого вещества в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот. Однако, поскольку в глиоксилатный шунт, наряду с оксалоацетатом, вовлечены 2 молекулы Ацетил-СоА, формирующиеся из гликолитического предшественника с потерей СО₂, вклад этого процесса в общий биосинтез янтарной кислоты приводит к снижению суммарного выхода продукта.

Баланс потоков углерода в сторону биосинтеза янтарной кислоты по указанным путям определяется как метаболическим статусом клетки, так и эффектом направленных модификаций, вносимых в биохимический аппарат целевого микроорганизма.

Рациональное конструирование рекомбинантных микробных продуцентов янтарной кислоты предполагает необходимость инактивации конкурентных, по отношению к целевым, биохимических путей утилизации ключевых метаболических предшественников и восстановленных эквивалентов NADH. Эти конкурентные пути представляют собой:

A) конверсию, под действием лактатдегидрогеназы, пировиноградной кислоты, являющейся предшественником биосинтеза Ацетил-СоА и потенциальным предшественником в биосинтезе оксалоацетата, в молочную кислоту с расходом восстановленного эквивалента NADH;

Б) конверсию, под действием пируватоксидазы, пировиноградной кислоты в уксусную кислоту;

B) конверсию, под действием альдегид/алкоголь дегидрогеназы, Ацетил-СоА, субстрата глиоксилатного шунта, в этанол с расходом двух восстановленных эквивалентов NADH;

Г) конверсию, под действием фосфотрансацетилазы и ацетаткиназы, Ацетил-СоА в уксусную кислоту.

Следует отметить, что инактивация соответствующих путей не только "сберегает" метаболические предшественники и восстановленные эквиваленты для целевых путей биосинтеза янтарной кислоты, но и исключает возможность накопления в среде побочных веществ (уксусной и молочной кислот, а также этанола), являющихся, наряду с янтарной кислотой, основными продуктами микробного смешаннокислотного брожения. В результате янтарная кислота становится основным продуктом ферментационного процесса, что облегчает в дальнейшем ее выделение и очистку.

Изученность метаболизма клеток Escherichia coli и доступность мощного генно-инженерного инструментария обусловили тот факт, что лучшие на сегодняшний день микробные продуценты янтарной кислоты получены на основе именно данного микроорганизма.

Изменения в функционировании метаболического узла фосфоенолпируват-оксалоацетат-пируват-Ацетил-СоА, ключевой точки ветвления, обуславливающей распределение потоков углерода между восстановительной частью цикла трикарбоновых кислот и глиокислатным шунтом в клетках E. coli, могут быть осуществлены различными способами.

В данной связи следует отметить, что в E. coli конверсия пировиноградной кислоты в Ацетил-СоА, в анаэробных условиях не сопровождающаяся под действием пируватформатлиазы формированием NADH, в аэробных условиях, при действии пируватдегидрогеназы, приводит к формированию дополнительной молекулы NADH на каждый образующийся Ацетил-СоА. Однако экспрессия генов пируват дегидрогеназного комплекса в анаэробных условиях у этого микроорганизма репрессирована (см., например, Soini J. et al., Norvaline is accumulated after a down-shift of oxygen in Escherichia coli W3110. Microb Cell Fact., 2008, 7:30, doi: 10.1186/1475-2859-7-30).

Один из стандартных подходов к модификации функционирования метаболического узла фосфоенолпируват-оксалоацетат-пируват-Ацетил-СоА заключается в инактивации пируватформатлиазы. В данном случае блокируется основной анаэробный путь формирования Ацетил-СоА, остаточный биосинтез которого происходит за счет базальной активности пируватдегидрогеназного комплекса. В результате этого создаются условия для потенциально доминирующего участия в биосинтезе янтарной кислоты восстановительной части цикла трикарбоновых кислот за счет искусственного снижения активности глиоксилатного шунта. Однако окислительно/восстановительный баланс клетки не претерпевает значительных изменений, способных обеспечить восстановительную часть цикла трикарбоновых кислот недостающими для эффективного биосинтеза янтарной кислоты восстановленными эквивалентами NADH. Кроме того, данный подход имеет ряд недостатков. Инактивация основного анаэробного пути биосинтеза Ацетил-СоА в рекомбинантных продуцентах в большинстве случаев приводит к невозможности их роста в анаэробных условиях и обуславливает необходимость использования двухстадийного аэробно/анаэробного процесса ферментации. Также, невозможность эффективной конверсии пировиноградной кислоты в Ацетил-СоА у ряда подобных рекомбинантных продуцентов приводит к нежелательному накоплению данного вещества в среде культивирования.

Данный подход использован при конструировании таких рекомбинантных продуцентов янтарной кислоты, как E. coli KJ060 (Jantama К. et al., Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of Escherichia coli С that produce succinate and malate. Biotechnol Bioeng., 2008, 99 (5), 1140-1153), E. coli AFP184 (Andersson С. et al., Effect of different carbon sources on the production ofsuccinic acid using metabolically engineered Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2007, 23 (2), 381-388), E. coli NZN111 (Stols L, Donnelly MI., Production of succinic acid through overexpression of NAD(+)-dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant. Appi Environ Microbiol. 1997, 63(7), 2695-2701) и других.

Альтернативным подходом к регуляции распределения потоков углерода между двумя путями биосинтеза янтарной кислоты в результате направленного вмешательства в функционирование метаболического узла фосфоенолпируват-оксалоацетат-пируват-Ацетил-СоА является обеспечение в клетках целевого рекомбинанта повышенной активности пируваткарбоксилазы на фоне интактной пируватформатлиазы. Оба фермента используют в качестве субстрата пировиноградную кислоту, однако карбоксилирующее действие первого приводит к формированию оксалоацетата, в то время как действие второго приводит к образованию Ацетил-СоА, при этом в результате декарбоксилирования. Таким образом, за счет конкурентного по отношению к пируватформатлиазе действия пируваткарбоксилазы в клетке создается повышенная отностительно Ацетил-СоА концентрация оксалоацетата. Это, в свою очередь, способствует возможности предпочтительного биосинтеза янтарной кислоты в восстановительной ветви цикла трикарбоновых кислот.

Однако и в этом случае окислительно/восстановительный баланс клетки не претерпевает значительных изменений, обеспечивающих генерацию дополнительных NADH эквивалентов для сукцинат-формирующей восстановительной части цикла трикарбоновых кислот.

С использованием данного подхода был получен, например, рекомбинантный продуцент янтарной кислоты E. coli SBS550MG/pyc (Sanchez AM et al., Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng. 2005, 7 (3), 229-239.). При конструировании штамма E. coli AFP111/pyc (Vemuri GN et al., Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli. Appi Environ Microbiol. 2002, 68 (4), 1715-1727) были применены оба вышеописанных подхода.

В рамках данных подходов не применялись направленные модификации метаболизма, способные обеспечить дополнительную к гликолитической анаэробную генерацию восстановленных эквивалентов NADH. Однако такую генерацию можно обеспечить на стадии конверсии пировиноградной кислоты в Ацетил-СоА, если осуществлять ее под действием ферментов NAD⁺-восстанавливающего пируватдегидрогеназного комплекса, чья активность практически не проявляется в анаэробных условиях за счет сниженной экспрессии соответствующих генов. Перераспределение потоков углерода между двумя путями биосинтеза янтарной кислоты будет осуществляться при этом под действием эффекта прецизионной метаболической регуляции с отрицательной обратной связью, поскольку сама активность пируватдегидрогеназного комплекса является NADH-репрессируемой (Schmincke-Ott, E. and Bisswanger H. Dihydrolipoamide dehydrogenase component of the pyruvate dehydrogenase complex from Escherichia coli K12. Comparative characterization of the free and the complex-bound component. Eur. J. Biochem. 1981, 114, 413-420; Shen L. С.and Atkinson D.E. Regulation of pyruvate dehydrogenase from Escherichia coli. Interactions of adenylate energy charge and other regulatory parameters. J. Biol. Chem. 1970, 245, 5974-5978). Генерация NADH, в результате действия пируватдегидрогеназного комплекса, будет способствовать возможности эффективного биосинтеза янтарной кислоты именно в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот, при снижении, за счет NADH-ингибируемого синтеза Ацетил-СоА, вклада глиоксилатного шунта. Исчерпание дополнительно сгенерированных NADH эквивалентов в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот вновь приведет к временной активации пируватдегидрогеназного комплекса, формированию эквивалентов и относительному повышению вклада в биосинтез янтарной кислоты глиоксилатного шунта. Таким образом, процесс перераспределения потоков углерода между путями биосинтеза янтарной кислоты в данном случае становится циклическим, динамическим и авторегулируемым. В результатате, сочетание эффекта метаболической регуляции и адаптивных возможностей биохимического аппарата клетки может способствовать достижению выгодного баланса двух путей биосинтеза янтарной кислоты и обеспечить его высокую эффективность.

Ферменты NAD⁺-восстанавливающего пируватдегидрогеназного комплекса кодируются генами aceEF-lpdA оперона. Таким образом, активность NAD⁺-восстанавливающего пируватдегидрогеназного комплекса можно повысить за счет усиления экспресии генов aceEF-lpdA оперона.

Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих использование усиления экспрессии генов aceEF-lpdA оперона для получения янтарной кислоты.

Описание изобретения

Цели настоящего изобретения включают повышение продуктивности штаммов-продуцентов янтарной кислоты и предоставление способа получения янтарной кислоты с использованием этих штаммов.

Вышеуказанные цели были достигнуты благодаря обнаружению того факта, что усиление экспрессии генов aceEF-lpdA оперона может приводить к увеличению продукции янтарной кислоты.

Объектом настоящего изобретения является бактерия рода Escherichia, обладающая способностью к повышенной продукции янтарной кислоты.

Также объектом настоящего изобретения является бактерия рода Escherichia -продуцент янтарной кислоты, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия генов aceEF-lpdA оперона в указанной бактерии усилена.

Также объектом настоящего изобретения является описанная выше бактерия, в которой указанная экспрессия усилена путем модификации последовательности, контролирующей экспрессию генов aceEF-lpdA оперона.

Также объектом настоящего изобретения является описанная выше бактерия, при этом указанная бактерия принадлежит к виду Escherichia соli.

Также объектом настоящего изобретения является бактерия, описанная выше, при этом указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что приобретает активность пируваткарбоксилазы.

Также объектом настоящего изобретения является бактерия, описанная выше, при этом активность пируваткарбоксилазы обеспечивается присутствием в бактерии молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий пируваткарбоксилазу.

Также объектом настоящего изобретения является способ получения янтарной кислоты, включающий стадии культивирования бактерии, описанной выше, в питательной среде; и выделения произведенной и накопленной янтарной кислоты из культуральной жидкости.

Также объектом настоящего изобретения является, описанный выше способ, в котором процесс культивирования бактерии включает в себя аэробную стадию накопления биомассы и анаэробную стадию продукции янтарной кислоты.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

1. Бактерия

Бактерия - это бактерия-продуцент янтарной кислоты рода Escherichia, модифицированная таким образом, что экспрессия генов aceEF-lpdA оперона в указанной бактерии усилена.

Термин «бактерия-продуцент янтарной кислоты» может означать бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению янтарной кислоты в питательную среду, когда бактерия выращивается в указанной питательной среде.

Способность к продукции янтарной кислоты может быть придана бактерии в результате селекции, мутагенеза или же генно-инженерных манипуляций.

Термин «бактерия-продуцент янтарной кислоты» также может означать бактерию, которая способна к продукции янтарной кислоты и вызывает накопление янтарной кислоты в ферментационной среде в количествах, больших по сравнению с природным или родительским штаммом Е. coli, таким, как штамм Е. coli К-12, и, может означать, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде янтарную кислоту в количестве не менее чем 0.4 г/л.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coli).

Термин "усиление экспрессии гена" может означать, что экспрессия гена выше, чем в немодифицированном штамме, например, в штамме дикого типа. Примеры таких модификаций могут включать увеличение числа копий экспрессируемого гена в клетке, усиление экспрессии гена и т.д. Количество копий экспрессируемого гена определяют, например, путем рестрикции хромосомной ДНК с последующим блоттингом по Саузерну с использованием зонда, сконструированного на основе последовательности гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), и т.п. Уровень экспрессии гена можно определить различными известными методами, включая Нозерн-блоттинг, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Кроме того, штаммы, которые могут быть использованы в качестве контроля, включают, например, Escherichia coli К-12.

Гены aceE, aceF и lpdA (синонимы: b0114, ЕСК0113; b0115, ЕСК0114; b0116, ЕСК0115) кодируют белки АсеЕ, AceF и LpdA - компоненты ферментативного комплекса NAD⁺-восстанавливающей пируватдегидрогеназы. Гены aceEF-lpdA оперона (нуклеотиды, гомологичные нуклеотидам с 123017 по 129336; в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990) расположены между генами pdhR и уасН на хромосоме Е. coli К-12. Нуклеотидные последовательности генов aceEF-lpdA оперона и аминокислотные последовательности белков АсеЕ, AceF и LpdA, кодируемых генами асеЕ, aceF и lpdA представлены в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, соответственно.

Поскольку у представителей различных штаммов рода Escherichia возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, гены aceEF-lpdA оперона - асеЕ, aceF и lpdA не ограничиваются генами, последовательности которых приведены в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, но также могут включать и гены, гомологичные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. Следовательно, варианты белков, кодируемых генами aceEF-lpdA оперона - асеЕ, aceF и lpdA, могут иметь гомологию не менее 80%, или не менее 90%, или не менее 95% по отношению к полным аминокислотным последовательностям, приведенным в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, при условии, что они имеют активности белков АсеЕ, AceF и LpdA. Термин "вариант белка" может означать белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, или от 1 до 15 в другом примере, или от 1 до 5 в другом примере, в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру.

Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков являются консервативной(-ыми) мутацией(-ями), если сохраняется активность. Типичным примером консервативной мутации является консервативная замена. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Туr, замену Ilе на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Туr, замену Туr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu.

В связи с этим гены aceEF-lpdA оперона - асеЕ, aceF и lpdA могут быть вариантами, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, представленными в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что они кодируют функциональные белки АсеЕ, AceF и LpdA. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например, гибриды с гомологией не менее 60%, 70%, 80%, 90% или 95% в разных примерах, образуются, а неспецифические гибриды, например, гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная или многократная отмывка, или двух- или трехкратная в другом примере, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond N⁺ (Amersham) в жестких условиях - 15 минут. Отмывка может быть выполнена два или три раза. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, в данном конкретном случае она может быть около 100-1000 п.н.

Методы, которые могут быть использованы для усиления экспрессии гена, включают увеличение числа копий гена. Введение гена в вектор, способный функционировать в бактерии рода Escherichia, может увеличивать число копий гена. Могут использоваться низкокопийные векторы. Примеры низкокопийных векторов включают, но не ограничиваются ими, pSC101, pMW118, pMW119, и т.п. Термин "низкокопийный вектор" используется для векторов, число копий которого в клетке достигает пяти. Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения множества копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и т.п. Например, один акт Мu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3 копий гена.

Число копий гена также может быть увеличено путем введения множества копий гена в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множества копий гена в бактериальную хромосому может быть выполнена гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Последовательности с множеством копий в хромосомной ДНК включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы на концах транспонируемых элементов. Также возможно включить ген в состав транспозона и обеспечить его перенос для введения множества копий гена в хромосомную ДНК.

Усиление экспрессии гена также может быть достигнуто путем подстановки фрагмента ДНК под контроль сильного промотора. Примерами сильных промоторов являются lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P_L промоторы фага . Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением копий гена.

С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением в промотор мутации, ведущей к увеличению уровня транскрипции локализованного за промотором гена. Кроме того, известно, что замена нескольких нуклеотидов в области между сайтом связывания рибосомы (ribosome binding site - RBS) и стартовым кодоном, особенно в последовательности непосредственно перед стартовым кодоном, существенно влияет на трансляционную способность мРНК. Например, обнаружен 20-кратный разброс в уровне экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих стартовому кодону (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J, 3, 623-629, 1984).

Кроме того, возможно ввести нуклеотидную замену в область промотора гена на бактериальной хромосоме, результатом чего является усиление функции промотора. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, можно осуществить, например, таким же способом, что и замена гена с использованием чувствительной к температуре плазмиды, как раскрыто в международной заявке WO 00/18935 и заявке Японии JP 1-215280 А.

Бактерией согласно настоящему изобретению также является бактерия, описанная выше, дополнительно модифицированая таким образом, что приобретает активность пируваткарбоксилазы. Активность пируваткарбоксилазы может обеспечиваться, в частности, присутствием в бактерии молекулы ДНК, содержащей ген, кодирующий пируваткарбоксилазу.

Пируваткарбоксилаза - фермент, способный катализировать реакцию карбоксилирования пировиноградной кислоты с образованием щавелеуксусной кислоты: АТФ + пируват+НСО₃ ^-=АДФ + фосфат + оксалоацетат. Указанную активность классифицируют как Е.С.6.4.1.1. Наличие активности пируваткарбоксилазы может быть установлено, например, с использованием метода, описанного Peters-Wendisch P.O. et al. (Pyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum: characterization, expression and inactivation of the рус gene. Microbiology, 1998; 144; 915-927). Примером фермента, обладающего активностью пируваткарбоксилазы, может являться белок РусА из Bacillus subtilis (последовательность с инвентарным номером NP_389369.1 в базе данных GenBank, gi: 16078550), кодируемый геном русА (нуклеотиды с 1554185 по 1557631 в последовательности с инвентарным номером NC_000964.3 в базе данных GenBank, gi: 255767013). Нуклеотидная последовательность гена русА и аминокислотная последовательность кодируемого им белка РусА представлены в SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, соответственно.

Понятие "вариант белка" также применимо для пируваткарбоксилазы. Термин "вариант белка" трактуется аналогично тому, как это описано выше.

В связи с этим ген русА также может существовать в виде вариантов, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:7, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что они кодируют функциональный белок РусА. Термин "жесткие условия" трактуется аналогично тому, как это описано выше.

Молекула ДНК, содержащая ген, кодирующий пируваткарбоксилазу, может быть введена в бактерию в составе плазмидного вектора или же интегрированна в хромосому бактерии методом гомологичной рекомбинации или Мu интеграции. Ген русА может быть получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомы организма, природно содержащего данный ген, и праймеров, синтезированных в соответствии с целевой нуклеотидной последовательностью.

Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия-продуцент янтарной кислоты

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия генов aceEF-lpdA оперона в указанной бактерии усилена, может быть использована бактерия, способная к продукции янтарной кислоты.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем усиления экспрессии генов aceEF-lpdA оперона в бактерии, уже обладающей способностью к продукции янтарной кислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой экспрессия генов aceEF-lpdA оперона уже усилена, способности к продукции янтарной кислоты.

Аналогично, в качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия генов aceEF-lpdA оперона в указанной бактерии усилена и при этом указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что приобретает активность пируваткарбоксилазы, может быть использована бактерия, способная к продукции янтарной кислоты.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем усиления экспрессии генов aceEF-lpdA оперона в бактерии, уже обладающей способностью к продукции янтарной кислоты и обладающей активностью пируваткарбоксилазы. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем обеспечения активности пируваткарбоксилазы в бактерии, уже способной к продукции янтарной кислоты и модифицированной таким образом, что экспрессия генов aceEF-lpdA оперона в ней усилена.

Способность к продукции янтарной кислоты может быть придана бактерии в результате селекции, мутагенеза или же генно-инженерных манипуляций, а также в результате комбинации данных подходов. Результатами данных манипуляций могут являться, но не исчерпываться ими, инактивация генов, кодирующих компоненты фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы транспорта сахаров - ptsG, ptsH, pstI, crr; инактивация генов pta и ackA, кодирующих фосфотрансацетилазу и ацетаткиназу, которые катализируют реакции преобразования Ацетил-СоА в уксусную кислоту; инактивация гена рохВ, кодирующего пируватоксидазу, катализирующую реакцию превращения пировиноградной кислоты в уксусную кислоту; инактивация гена ldhA, кодирующего лактатдегидрогеназу, катализирующую превращение пировиноградной кислоты в молочную кислоту; инактивация гена adhE, кодирующего СоА-зависимую альдегид/алкоголь дегидрогеназу, катализирующую конверсию Ацетил-СоА в этанол; инактивация гена pflB, кодирующего пируватформатлиазу, катализирующую конверсию пировиноградной кислоты в Ацетил-СоА и муравьиную кислоту; инактивация генов iclR и fadR, кодирующих белки репрессоры экспрессии генов, кодирующих ферменты глиоксилатного шунта; повышение уровня экспресси гена ррс, кодирующего фосфоенолпируваткарбоксилазу, катализирующую реакцию преобразования фосфоенолпирувата в оксалоацетат; повышение уровня экспресси гена pckA, кодирующего фосфоенолпируваткарбоксикиназу, катализирующую обратимую реакцию интерконверсии фосфоенолпирувата и оксалоацетата, в любых комбинациях.

В данном изобретении в качестве модельного продуцента янтарной кислоты был использован штамм E. coli SGM0.1, сконструированный в результате генно-инженерных манипуляций, таким образом, что в нем были инактивированны гены pta, ackA, poxB и ldhA, кодирующие белки, катализирующие реакции образования уксусной и молочной кислот.

Способ получения янтарной кислоты

Способ согласно настоящему изобретению включает в себя продукцию янтарной кислоты путем выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, обеспечивающей продукцию янтарной кислоты, накопление янтарной кислоты в культуральной жидкости и выделение янтарной кислоты или ее соли из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка янтарной кислоты или ее соли из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых янтарная кислота продуцируется с использованием микроорганизмов. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические полиолы, такие как глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, зерновые или бобовые гидролизаты, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. При необходимости в питательную среду могут быть добавлены дополнительные питательные вещества. Также питательная среда может содержать дополнительные источники CO₂ и иона НСО₃ ^-, вводимые в среду за счет газообмена или же растворения соответствующих солей.

Выращивание и инкубация осуществляются при температуре в пределах от 30°С до 37°С, предпочтительно в пределах от 35°С до 37°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1-го до 5-ти дней приводит к накоплению янтарной кислоты в культуральной жидкости.

Процесс культивирования микроорганизма в способе согласно настоящему изобретению может включать в себя аэробную и анаэробную стадии.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем янтарная кислота или ее соль может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, обращеннофазовой хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие неограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Конструирование бактериальных штаммов и плазмид

1. Конструирование штамма SGM0.1

Штамм SGM0.1 был получен на основе штамма E. coli MG1655 в результате инактивации генов ackA-pta, poxB и ldhA с помощью рекомбинационной инженерии, основанной на методе, использующем Red-зависимую гомологичную рекомбинацию. Принцип метода детально описан, например, в (Sawitzke J. et al., Recombineering: In Vivo Genetic Engineering in E. coli, S. enterica, and Beyond. Methods in Enzymology. 2007, 421, 171-199), а примеры его практического применения, например, в (RU 2330883).

2. Конструирование штамма SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA

1. Получение штамма E. coli MG1655 attR-cat-attL-P_L-aceEF-lpdA

Для усиления экспрессии генов aceEF-lpdA оперона промотор P_L, соединенный с последовательностью Shine-Dalgarno (последовательность SD) гена aceF, являющейся более эффективной, нежели SD последовательность гена асеЕ, был интегрирован перед кодирующим участком гена асеЕ, расположенного первым в составе соответствующего оперона, в хромосоме штамма E. coli MG1655 с использованием методики, разработанной Datsenko, K.A. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". Также, искусственный фрагмент ДНК, интегрированный в хромосому, содержал маркер Cm ^R, кодируемый геном cat.

Конструирование вышеупомянутого искусственного фрагмента ДНК, интегрированного в соответствующий участок бактериальной хромосомы, осуществлялось в несколько стадий. На первой стадии, с помощью ПЦР был получен фрагмент ДНК, содержащий в начале участок узнавания BglII, промотор P_L, последовательность SD гена aceF и, наконец, 36 нуклеотидов комплементарных 5'-концу кодирующей области гена асеЕ. Фрагмент получали в два этапа. На первом этапе, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК фага лямбда (последовательность с инвентарным номером NC_001416.1 в базе данных GenBank, gi: 9626243), был получен фрагмент ДНК, содержащий в начале участок узнавания BglII, промотор P_L и последовательность SD гена aceF. ПЦР проводили с использованием праймеров P1 (SEQ ID NO:9) и Р2 (SEQ ID NO:10). Праймер Р1 содержит участок узнавания BglII и область, гомологичную 5'-концу промотора P_L . Праймер Р2 содержит последовательность SD гена aceF и область, комплементарную 3'-концу промотора P_L. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 51°С, 60 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Pfu ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Полученный ПЦР-продукт, очищенный в агарозном геле и выделенный в соответствии с рекомендациями производителя с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, был использован в качестве матрицы в следующем раунде ПЦР. Использовали праймеры P1 (SEQ ID NO:9) и Р3 (SEQ ID NO:11). Праймер Р3 содержит область, комплементарную 3'-концу промотора P_L , последовательность SD гена aceF и 36 нуклеотидов из рамки считывания гена асеЕ. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 53°С, 60 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Pfu ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Параллельно осуществляли вторую стадию конструирования фрагмента ДНК. Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров P4 (SEQ ID NO:12) и Р5 (SEQ ID NO:13) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (Каташкина Ж.И. и др., 2005. Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Мол. Биол., 39 (5), 823-831) в качестве матрицы. Праймер Р4 содержит 36 нуклеотидов, гомологичных участку ДНК, предшествующему непосредственно кодирующей области гена асеЕ, и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце области attR. Праймер Р5 содержит участок узнавания BglII и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, гомологичный участку ДНК, расположенному на 5'-конце области attL. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Полученные фрагменты ДНК очищали в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, с последующим осаждением этанолом.

Два полученных фрагмента ДНК были обработаны эндонуклеазой рестрикции BglII с последующим лигированием с использованием Т4 ДНК-лигазой (Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Продукт лигирования амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров Р3 (SEQ ID NO:11) и Р4 (SEQ ID NO:12). Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 98°С в течение 1 мин; последующие 30 циклов: 15 сек при 98°С, 15 сек при 55°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Phusion ДНК полимеразу и соответствующий буфер производства Finnzymes; дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Полученный ПЦР-продукт длиной 1970 п.н., очищенный в агарозном геле и выделенный, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, был использован для электропорации в штамм Е. coli MG1655, содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12): 6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага длиной 2154 п.н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены Red-гомологичной системы рекомбинации (гены , , ехо) под контролем промотора P_araB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.

Электрокомпетентные клетки штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали следующим образом: ночную культуру штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 10 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин и L-арабинозу (10 мМ), Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀ 0.8, после чего делали клетки электрокомпетентными, путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н₂О. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и 300 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm^R -рекомбинантов. Затем, для удаления плазмиды pKD46 проводили рассев клонов до отдельных колоний на агаризованной LB при 37°С, и проводили селекцию Cm^RAp^S вариантов.

Факт соответствия предполагаемой и полученной экспериментально структуры хромосом отобранных Cm^RAp^S колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р6 (SEQ ID NO:14) и Р7 (SEQ ID NO:15). Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляет 201 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляет 2099 п.н.

В хромосомах полученных клонов соответствие запланированной и экспериментально полученной нуклеотидной последовательности нового регуляторного элемента, введенного перед кодирующей областью гена асеЕ, было подтверждено секвенированием. Таким образом, был получен штамм MG1655 attR-cat-attL-P_L-aceEF-lpdA.

2. Получение штамма Е. coli SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA

Фрагмент ДНК из хромосомы описанного ранее штамма MG1655 attR-cat-attL-P_L-aceEF-lpdA, содержащий область aceEF-lpdA оперона, с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) был перенесен в штамм Е. coli SGM0.1 с получением штамма SGM0.1 attR-cat-attL-P_L-aceEF-lpdA.

Далее ген устойчивости к Cm (ген cat) был элиминирован из хромосомы штамма SGM0.1 attR-cat-attL-P_L-aceEF-lpdA с использованием int-xis системы. С этой целью штамм SGM0.1 attR-cat-attL-P _L-aceEF-lpdA был трансформирован плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005 123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 30°С. Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^S Ap^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов было подтверждено ПЦР с помощью локус-специфичных праймеров Р6 (SEQ ID NO:14) и Р7 (SEQ ID NO:15). Условия проведения ПЦР были такими же, как описано выше. Длина продукта ПЦР, полученного в случае клеток с удаленным геном cat, составляла 502 п.н.

Излечивание штамма от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, содержащей термочувствительный репликон, из Cm^SAp^R вариантов проводилась с помощью повторного рассева до отдельных колоний при 37°С и селекции Cm^SAp^S-клонов.

В хромосомах полученных клонов соответствие запланированной и экспериментально полученной нуклеотидной последовательности нового регуляторного элемента, введенного перед кодирующей областью гена асеЕ, было подтверждено секвенированием. Таким образом, был получен штамм SGM0.1 attB-P_L-aceEF-lpdA, сокращенно - SGM0.1 P _L-aceEF-lpdA.

3. Получение плазмиды pPYC

1. Получение штамма Е. coli MG1655 ppc

Плазмида pPYC содержала ген русА из Bacillus subtilis, кодирующий пируваткарбоксилазу. Для отбора вариантов плазмиды, содержащих ген русА, кодирующий функционально активную пируваткарбоксилазу, был предварительно получен штамм E. coli MG1655 ррс, в котором ген ррс, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу, инактивирован. Известно, что ррс мутанты E. coli не способны к синтезу оксалоацетата и являются ауксотрофами по интермедиатам цикла трикарбоновых кислот, в результате чего не способны к росту на средах, содержащих в качестве источников углерода сахара или глицерин [Sauer U. and Eikmanns В. 2005 The PEP-pyruvate-oxaloacetate node as the switch point for carbon flux distribution in bacteria. FEMS Microbiol. Rew., 29, 765-794]. Таким образом, присутствие в штамме E. coli MG1655 ppc плазмиды pPYC, содержащей ген русА, кодирующий функционально активную пируваткарбоксилазу, катализирующую реакцию образования оксалоацетата из пировиноградной кислоты, должно было восстанавливать способность роста штамма на минимальной среде, содержащей качестве источников углерода, например, глюкозу.

Делецию гена ррс осуществляли с использованием методики, разработанной Datsenko, К.А. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". Фрагмент ДНК, содержащий маркер Сm^R, кодируемый геном cat, был получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р8 (SEQ ID NO:16) и Р9 (SEQ ID NO:17) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR в качестве матрицы. Праймер Р8 содержит участок ДНК размером в 36 п.н., гомологичный участку ДНК, расположенному на 5'-конце гена ррс, и участок ДНК размером 28 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце области attR. Праймер Р9 содержит участок ДНК размером в 36 п.н., комплементарный участку ДНК, расположенному на 3'-конце гена ррс, и участок ДНК размером 28 п.н., гомологичный участку ДНК, расположенному на 5'-конце области attL. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 55°С, 40 сек при 72°С; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С. Полученный ПЦР-продукт длиной 1700 п.н., очищенный в агарозном геле и выделенный, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, был использован для электропорации в штамм E. coli MG1655, содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительньш репликоном. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.

Электрокомпетентные клетки штамма E. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали, как описано выше. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и 300 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm^R-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили рассев клонов до отдельных колоний на агаризованной LB при 37°С, и проводили селекцию Cm^RAp^S вариантов.

Факт соответствия предполагаемой и полученной экспериментально структуры хромосом отобранных Cm^RAp^S колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р10 (SEQ ID NO:18) и PI 1 (SEQ ID NO:19). Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 53°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляет 3003 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляет 2050 п.н. Мутантный штамм был назван MG1655 ppc::attR-cat-att.

Далее ген устойчивости к Cm (ген cat) был элиминирован из хромосомы штамма MG1655 ppc::attR-cat-att с использованием int-xis системы. С этой целью штамм MG1655 ppc::attR-cat-att был трансформирован плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005 123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 30°С. Ген cat был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SAp^R . Удаление гена cat из хромосомы штаммов было подтверждено ПЦР с помощью локус-специфичных праймеров Р10 (SEQ ID NO:18) и P11 (SEQ ID NO:19). Условия проведения ПЦР были такими же, как описано выше. Длина продукта ПЦР, полученного в случае клеток с удаленным геном cat, составляла 453 п.н.

Излечивание штамма от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, содержащей термочувствительный репликон, из Cm^SAp^R вариантов проводилась с помощью повторного рассева до отдельных колоний при 37°С и селекции Cm^SAp^S-клонов.

Таким образом, был получен штамм MG1655 ppc:: attB, сокращенно - MG1655 ppc.

2. Конструирование плазмиды pPYC*

В качестве базового вектора для создания pPYC была использована плазмида pMW119 (последовательность с инвентарным номером АВ005476.2 в базе данных GenBank, gi: 67968376).

Фрагмент ДНК, содержащий ген русА с собственной регуляторной областью, был получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомы штамма B. subtilis 168 и праймеров Р12 (SEQ ID NO:20) и Р13 (SEQ ID NO:21). Праймер Р12 содержит участок узнавания XbaI и последовательность нуклеотидов, гомологичную области, лежащей выше 5'-конца кодирующей последовательности гена русА B.subtilis. Праймер Р13 содержит участок узнавания KpnI и последовательность нуклеотидов, гомологичную области, располагающейся ниже 3'-конца кодирующей последовательности гена русА B. subtilis. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 98°С в течение 1 мин; последующие 30 циклов: 15 сек при 98°С, 15 сек при 53°С, 3 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Phusion ДНК полимеразу и соответствующий буфер производства Finnzymes; дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).

Полученный ПЦР-продукт длиной 4438 п.н., очищенный в агарозном геле и выделенный, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, был, в дальнейшем, последовательно обработан эндонуклеазами рестрикции XbaI и KpnI. Параллельно эндонуклеазами рестрикции XbaI и KpnI была обработана плазмида pMW119. Полученные линейные фрагменты ДНК, содержащие ген русА и больший XbaI-KpnI фрагмент плазмиды pMW119, очищенные в агарозном геле и выделенные, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, были лигированны с помощью Т4 ДНК-лигазы (Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Полученной лигазной смесью был трансформирован штамм E. coli MG1655 с последующим отбором Ар ^R трансформантов на агаризованной среде LB, содержащей 100 мг/л ампициллина.

Выделенная по стандартной методике из соответствующих трансформантов плазмида была названа pPYC*.

3. Отбор плазмиды pPYC, содержащей ген русА, кодирующий функционально активную пируваткарбоксилазу

Препаратом плазмиды pPYC* были трансформированны клетки штамма MG1655 ррс. Отбор трансформантов осуществляли на агаризованной минимальной среде М9 (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) в присутствии 0,2% глюкозы в качестве единственного источника углерода. Индивидуальные клоны трансформантов, способные к росту на данной среде, содержали плазмиду, включающую ген русА, кодирующий функционально активную пируваткарбоксилазу. Выделенная по стандартной методике из соответствующих трансформантов плазмида названа pPYC.

4. Получение штаммов SGM0.1 [pPYC] и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pPYC]

Штаммы SGM0.1 [pPYC] и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [рРУС] были получены в результате трансформации штаммов SGM0.1 и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA плазмидой pPYC по стандартной методике. Аналогично, трансформацией штаммов SGM0.1 и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA плазмидой pMW119 по стандартной методике были получены контрольные штаммы SGM0.1 [pMW119] и SGM0.1 P _L-aceEF-lpdA [pMW119].

Пример 2. Продукция янтарной кислоты сконструированными штаммами

Клетки штаммов SGM0.1, SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA, SGM0.1 [pMW119], SGM0.1 R_L-aceEF-lpdA [pMW119], SGM0.1 [pPYC] и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pPYC] выращивали в течение ночи в среде М9, содержащей 2 г/л глюкозы, при 37°С. По 1 мл полученных ночных культур разбавляли в 50 раз, добавляя 49 мл среды М9, содержащей 10 г/л глюкозы. Полученные культуры растили в колбах объемом 750 мл с вентилируемыми пробками при 37°С на роторной качалке при 250 об/мин в течение 6 часов. Полученные клеточные суспензии центрифугировали в течение 15 минут при 4000 об/мин при 4°С. Осадки ресуспендировали в 15 мл среды М9, содержащей 20 г/л глюкозы. В дальнейшем проводили инкубацию полученных клеточных культур в течение 24 часов в пробирках объемом 15 мл, закрытых невентилируемыми пробками, при 37°С на роторной качалке при 250 об/мин. В случае штаммов SGM0.1 [pMW119], SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pMW119], SGM0.1 [pPYC] и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pPYC] использованные среды содержали дополнительно 100 мг/л ампициллина. Концентрацию янтарной кислоты и остаточной глюкозы в культуральных жидкостях, освобожденных от клеточной массы центрифугированием, определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием системы Waters HPLC system (Waters, Milford, MA, USA). Для измерения концентраций янтарной кислоты была использована обращенно-фазовая колонка ReproSil-Pur C18-AQ (4×250 mm, 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany). Детекция осуществлялась при длине волны 210 нм. В качестве подвижной фазы использовался водный раствор фосфорной кислоты (100 мМ) с ацетонитрилом и метанолом (каждый в объемной концентрации 0,5%) со скорость потока 1 мл/мин. Для измерения концентрации глюкозы, система Waters HPLC system была укомплектована рефрактивным детектором Waters 2414 и колонкой Spherisorb-NH2 (4.6×250 mm, 5 µm, Waters, USA). В качестве подвижной фазы использовалась смесь ацетонитрил/этилацетат/вода (объемное соотношение 76/4/20) со скоростью потока 1 мл/мин. Вещества идентифицировались сравнением времен их удерживания с временами удерживания соответствующих стандартов.

Результаты соответствующих пробирочных ферментаций представлены в Таблице 1. Показатели продукции янтарной кислоты штаммами SGM0.1 [pMW119] и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pMW119] не отличались от таковых для штаммов SGM0.1 и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA, соответственно.

Аналогичным образом оценивали способность штаммов SGM0.1, SGM0.1 P_L -aceEF-lpdA, SGM0.1 [pMW119], SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pMW119], SGM0.1 [pPYC] и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pPYC] продуцировать янтарную кислоту в присутствии в среде дополнительного источника иона НСО₃ ^-. Ферментацию проводили, как описано выше, за исключение того, что среда, использованная на финальной стадии, дополнительно содержала 1,5 г/л NaHCO₃. Концентрацию янтарной кислоты и остаточной глюкозы в культуральных жидкостях, освобожденных от клеточной массы центрифугированием, определяли, как описано ранее.

Результаты соответствующих пробирочных ферментаций представлены в Таблице 2. Показатели продукции янтарной кислоты штаммами SGM0.1 [pMW119] и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pMW119] не отличались от таковых для штаммов SGM0.1 и SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA, соответственно.

Как следует из Таблицы 1 и Таблицы 2, штамм SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA с усиленной экспрессией генов aceEF-lpdA оперона в обоих случаях накапливал большее количество янтарной кислоты и с большим молярным выходом, чем родительский штамм SGM0.1. Также из Таблицы 1 и Таблицы 2 следует, что штамм SGM0.1 P_L-aceEF-lpdA [pPYC] с усиленной экспрессией генов aceEF-lpdA оперона и дополнительно обладающей активностью пируваткарбоксилазы в обоих случаях накапливал большее количество янтарной кислоты и с большим молярным выходом, чем контрольные штаммы SGM0.1 P _L-aceEF-lpdA и SGM0.1 [pPYC].

Таблица 1
Штамм	Потребленная глюкоза	Количество янтарной кислоты	Молярный выход янтарной кислоты
г/л	мМ	г/л	мМ	%
SGM0.1	4,50±0,01	24,98±0,01	0,46±0,01	3,85±0,01	15,4±0,1
SGM0.1 PL -aceEF-lpdA	4,60±0,01	25,53±0,01	0,52±0,01	4,42±0,01	17,3±0,1
SGM0.1 [pPYC]	4,30±0,01	23,87±0,01	0,50±0,01	4,19±0,01	17,6±0,1
SGM0.1 PL -aceEF-lpdA [pPYC]	4,30±0,01	23,87±0,01	1,44±0,01	12,22±0,01	51,2±0,1

Таблица 2
Штамм	Потребленная глюкоза	Количество янтарной кислоты	Молярный выход янтарной кислоты
г/л	мМ	г/л	мМ	%
SGM0.1	5,53±0,01	30,69±0,01	0,97±0,01	8,17±0,01	26,6±0,1
SGM0.1 PL -aceEF-lpdA	5,52±0,01	30,64±0,01	1,28±0,01	10,84±0,01	35,4±0,1
SGM0.1 [pPYC]	5,52±0,01	30,64±0,01	1,13±0,01	9,53±0,01	31,1±0,1
SGM0.1 P L-aceEF-lpdA [pPYC]	6,04±0,01	33,53±0,01	2,27±0,01	19,23±0,01	57,3±0,1