способ определения степени цитопатогенности вирусов

Формула изобретения

1. Способ определения степени цитопатогенности вирусов, включающий отбор первичной клеточной культуры, ее заражение при постоянной величине дозы различающимися по цитопатогенности штаммами, инкубирование зараженного материала и определение степени цитопатогенности возбудителя, отличающийся тем, что, в качестве первичной клеточной культуры используют взвесь клеток перитонеального экссудата лабораторных животных, а степень цитопатогенности вирусов определяют по изменению цитохимической ферментативной активности для ферментов 5'-нуклеотидазы, АТФазы, сукцинатдегидрогеназы и содержанию метаболитов оксида азота (NO) зараженных клеток, в динамике, через - 0,5; 1; 2; 3; 5 и 6 ч, путем измерения оптической плотности субстратного раствора для каждого фермента, затем рассчитывают среднеарифметический показатель активации клеток (ПАК_ср) по формуле:

ПАКcp=ПАК_0,5+ПАК₁+ПАК₂+ПАК ₃+ПАК₅+ПАК₆/N;

где N количество временных промежутков,

определяют индекс реактивности клеток (ИРК) по формуле:

ИРК=ПАКср/ПАК_{интактных клеток} ·100,

вычисляют ее среднюю и если показатели ИРК_ср меньше 100 - степень цитопатогенности вирусов высокая, а если значения ИРК_ср больше 100 - степень цитопатогенности вирусов низкая.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве контроля используют взвесь клеток без внесения вирусов (интактные клетки).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре при длине волны в соответствии для субстратного раствора для каждого фермента.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области вирусологии и вирусной цитопатологии, в частности к способам выявления патогенности возбудителей вирусных инфекций, и может быть использовано в вирусологических исследованиях для ускоренного определения степени проявления цитопатогенных свойств вирусов.

Способность вируса вызывать специфические морфологические и функциональные изменения зараженных клеток перевиваемых культур, которые впоследствии приводят к деструкции этих клеток, называется цитопатогенным действием вируса. Различают три типа цитопатогенного действия вирусов: цитолитический, трансформирующий, индуктивный. Цитолитический эффект характеризуется общей деструкцией или растворением (лизисом) клетки, которому предшествуют морфологические изменения клеток и разрушение их митохондрий. При трансформирующем эффекте зараженная вирусом клетка не гибнет, а приобретает способность к неограниченному размножению. Индуктивное цитопатогенное действие характеризуется способностью вируса изменять метаболизм инфицированных клеток, например, стимулируя продукцию цитокинов этими клетками.

Феномен цитопатогенного действия вирусов на культуру клеток используют для диагностики, идентификации и титрования вирусных частиц. При сравнении в строго контролируемых условиях нескольких штаммов вирусов их цитопатогенное действие может иметь количественное выражение, а его степень измеряется количеством вирусных частиц (титр вируса). При поддержании штаммов вирусов в лабораторных условиях их свойства могут изменяться, что необходимо учитывать при постановке различных научных экспериментов.

Существует способ определения цитопатогенности вирусов путем определения их инфекционной активности по отношению к чувствительным перевиваемым клеточным культурам. Учет результатов ведется визуально под оптическим микроскопом, также регистрируется изменение цвета среды, в которой культивируются зараженные клетки, и выражается в виде титра цитопатогенного действия вируса (ТЦПД) в условных единицах (Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / Коротяев А.И., Бабичев С.А. - СпБ: СпецЛит, 2008, 767 с.).

Недостатками данного способа являются необходимость использования дорогостоящих перевиваемых клеточных культур, его трудоемкость, т.к. требуется многочасовое наблюдение до 3-х и более суток за клетками под микроскопом, кроме того, точность оценки цитопатогенного воздействия вируса на клетки является субъективной, т.к. она может зависеть от опыта исследователя.

Применяется способ определения цитопатогенного действия вирусов методом бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественный учет воздействия вирусов на клетки. При этом монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Флаконы инкубируют при температуре 37°C. Через 48-96 ч выявляют неокрашенные пятна-бляшки диаметром 1-3 мм, которые возникают за счет цитопатогенного действия вируса на клеточный монослой. Показателем цитопатогенного действия вируса является количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) (Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. А.А.Воробьева, А.С.Быкова. - М.: Мед. инф. Агентство, 2003, 236 с.).

Недостатками данного способа является его трудоемкость, высокая стоимость, требуется большой расход питательных сред, т.к. для каждого исследуемого штамма вируса и его дозы готовится отдельный флакон со слоем агара, а также его длительность, результаты эксперимента снимаются только спустя 3-7 дней.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению относится способ оценки цитопатогенного действия штаммов вирусов, где по количеству вируса, содержащегося в клетках крови, судят о его вирулентности. Это включает подготовку первичной культуры мононуклеарных клеток из крови доноров, ее заражение различающимися по цитопатогенному действию штаммами полиовируса, инкубирование монослоя инфицированных клеток в термостате при 37°C в течение 1, 2 и 3 с, определение инфекционного титра вирусов путем внесения в различных разведениях надосадочной жидкости из опытных образцов (монослой зараженных вирусом клеток) в перевиваемую культуру клеток HeLa, ее инкубирование в термостате при 37°C в течение 24 ч и последующее выявление цитопатогенного действия вируса на клетки, выражаемое в виде ТЦПД усл. ед. (Freistadt M.S., Eberle K.E. Correlation between Poliovirus Type 1 Mahoney Replication in Blood Cells and Neurovirulence // Journal of Virology, 1996, p.6486-6492).

Недостатком этого способа является:

- во-первых - использование крови доноров, что связано с определенными этическими проблемами;

- во-вторых - длительность проведения эксперимента -1, 2, 3-е суток инкубирования зараженных клеток и дополнительно 1 сутки инфицированной культуры клеток, итого - 4 суток;

- в-третьих - достоверность полученных результатов низкая, так как используют недостаточное количество параметров, позволяющих объективно оценить реакцию клеток;

- в-четвертых - отсутствует числовое выражение степени цитопатического эффекта вируса;

- в-пятых - использование дорогостоящих сред для культивирования перевиваемой культуры клеток.

Задача изобретения - повышение оперативности, информативности и достоверности оценки степени цитопатогенности вирусов на основе определения цитохимических параметров активности зараженных клеток.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения степени цитопатогенного действия вирусов, включающем отбор первичной клеточной культуры, ее заражение при постоянной величине дозы, различающимися по цитопатогенности штаммами вирусов, инкубирование зараженного материала и определение степени цитопатогенности возбудителя, ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ тем, что в качестве первичной клеточной культуры используют взвесь клеток перитонеального экссудата лабораторных животных, а степень цитопатогенности вирусов определяют по изменению цитохимической функциональной активности зараженных клеток, в динамике, через - 0.5, 1, 2, 3, 5 и 6 ч, путем измерения оптической плотности субстратного раствора для каждого фермента, затем рассчитывают среднеарифметический показатель активации клеток (ПАК) по формуле:

ПАК=ПАК_0,5+ПАК₁+ПАК₂ +ПАК₃+ПАК₅+ПАК₆/N;

где N - количество временных промежутков,

определяют индекс реактивности клеток (ИРК) по формуле:

ИРК=ПАК/ПАК _{интактных клеток}·100,

затем по 4 значениям ИРК вычисляют ИРК среднее (ИРК_ср), и если полученные показатели меньше 100 - указывает на высокую степень цитопатогенности вирусов, а значения больше 100 на низкую степень цитопатогенности.

В качестве контроля используют монослой клеток без внесения вирусов (интактные клетки).

Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре при длине волны в соответствии для субстратного раствора для каждого фермента.

Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций.

Способ используется для определения цитопатогенности вируса по воздействию на клетки. В качестве показателей используют величину оптической плотности при определении цитохимических изменений ферментативной активности клеток. Это позволяет оперативно и достоверно определить степень воздействия вируса на эти клетки в числовом выражении.

Для этого взвесь клеток перитонеального экссудата лабораторных животных в концентрации 2×10⁶ на мл в количестве 100 мкл на лунку в иммунологических плоскодонных планшетах инкубируют в термостате при 37°C в течение 45 мин для адгезии клеток. Для удаления неприкрепившихся клеток их монослой дважды промывают теплой средой 199, затем к нему добавляют среду 199, включающую 5% эмбриональной сыворотки крови, 2 µМ глутамина и 0,2 µM гентамицина и содержащую вирус в количестве 2 lg ТЦД_50. Инкубируют зараженный вирусами монослой клеток в термостате при 37°C в течение 60 мин, удаляют внеклеточно расположенный вирус путем двойного промывания монослоя клеток теплой средой 199 и продолжают инкубировать в термостате при 37°C в течение 6 ч. В образцах на иммунологических планшетах, в динамике, определяют цитохимические показатели ферментативной активности клеток. Ферментативную активность элементов клеток организма определяют для ферментов 5'-нуклеотидазы, АТФазы, сукцинатдегидрогеназы и метаболиты оксида азота (NO).

Контролем служат интактные клетки - монослой макрофагов без внесения вируса.

Для увеличения достоверности определения степени цитопатогенности вирусов цитохимическую активность клеток определяют по четырем показателям: активности ферментов плазматической мембраны (АТФ-аза, 5' нуклеотидаза) и показателей активации сукцинатдегидрогеназы и продукции метаболитов оксида азота по разработанной нами методике (Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Кондрашова Н.М., Запорожец Т.С. Определение функциональной активности лейкоцитов периферической крови в качестве показателя неспецифической защиты организма. Методические рекомендации. Владивосток, 2005, 24 с.), через шесть временных промежутков. Количество продуктов реакции выявляют по величине оптической плотности на спектрофотометре "Labsystem Multiscan RC" (Финляндия) при соответствующих для определяемых субстратов длинах волн.

Затем рассчитывают среднеарифметический показатель активации клеток (ПАК_ср) по формуле:

ПАК_ср=ПАК_0,5+ПАК₁ +ПАК₂+ПАК₃+ПАК₅+ПАК₆ /N;

где N - количество временных промежутков.

Затем ПАК_ср делят на средний показатель оптической плотности раствора для интактных клеток и умножают на 100, что составляет индекс реактивности клеток - ИРК. Полученные значения ИРК суммируют, при этом используют только целую часть значений и делят на их количество.

Значения ИРК _ср меньше 100 отражают высокую степень цитопатогенности вирусов, а значения больше 100 - низкую степень цитопатогенности.

Данные представлены в таблицах 1-4.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна», так как цитопатогенность вирусов определяют по реакции клеток в ответ на заражение с привлечением инструментального объективного подсчета данных, что позволяет оценить цитопатогенные свойства вирусов в условных единицах.

При этом испытуемые вирусы на уровне целого индивидуального организма имеют действие то же, что и на уровне клеток. Таким образом, изобретение позволяет сделать объективные выводы о цитопатогенности вирусов в отношении организма.

Простота выполнения, возможность одновременного исследования в одном образце ряда параметров, а также объективность учета результатов с помощью спектрофотометрии позволяет дать комплексную оценку функционального состояния клеток, инфицированных вирусами, и с помощью показателя ИРК_ср судить о степени цитопатогенности конкретного вируса.

Данная модель проста в постановке, легко воспроизводима и позволяет в короткие сроки - до 6 ч, определить патогенные свойства вирусов.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1

Для заражения клеток были использованы следующие вирусы сем. Пикорновирусы: вакцинный штамм LSc2ab вируса полиомиелита типа 1 (полиовирус); вирус ECHO типа 11, вариант В, штамм «Каримов», сибирский, увеатропный (вирус ECHO 11) и вирус Коксаки В типа 1, штамм Conn. 5, протипный (вирус Коксаки В1). Эти вирусы отличались по цитопатогенности, определенной по цитопатическому действию на чувствительные к ним культуры клеток. Наиболее цитопатогенным был полиовирус (LD₁₀₀), затем вирус Коксаки В1 (LD ₇₀) и последний по степени цитопатогенности - энтеровирус ECHO 11 (LD₁₀).

Клетки собирают путем промывания перитонеальной полости беспородных белых мышей 5 мл холодной среды RPMI, включающей гепарин в концентрации 5 ед/мл. Концентрацию взвеси клеток доводят до 2·10⁶ кл/мл в среде 199 с 5% эмбриональной сыворотки крови коровы (НПО "Вектор", пос.Кольцово), инактивированной при +50°C в течение 30 мин. Взвесь клеток разносят в лунки иммунологического плоскодонного планшета в количестве 100 мкл, помещают в термостат при 37°C на 45 мин для адгезии клеток.

Удаляют неприкрепившиеся клетки путем промывания монослоя, дважды, теплой средой 199, затем в монослой добавляют среду 199, включающую 5% эмбриональной сыворотки крови коровы, 2 µМ глутамина и 0,2 µM гентамицина, и среду, содержащую вирус в количестве 2 lg ТЦД_50.

Зараженный вирусами монослой клеток инкубировали в термостате при 37°С в течение 60 мин, затем удаляли внеклеточно расположенный вирус путем двойного промывания монослоя клеток теплой средой 199 и продолжали инкубировать в термостате при 37°C в течение 6 ч.

В образцах на иммунологических планшетах, в динамике, определяли цитохимические показатели ферментативной активности клеток.

Метаболическую активность клеток определяли по четырем показателям: активности ферментов плазматической мембраны (АТФ-аза, 5' нуклеотидаза) и показателей активации сукцинатдегидрогеназы и продукции метаболитов оксида азота через шесть временных промежутков: 0,5, 1, 2, 3, 5, 6 ч.

1). определение активности 5'-нуклеотидазы: в лунки планшета с фиксированным монослоем добавляли по 50 мкл субстрата для 5'-нуклеотидазы (4 мг adenosine-5'-mono phosphate (ICN) на 1 мл субстратного раствора, который готовится на основе 0,05 М трис-HCl-буфера (pH=7,8) путем растворения в 100 мл этого буфера 87 мг NaCl и 70 мг MgCl₂). Образцы оставляли в термостате при 37°C на 60 мин. Затем добавляли по 100 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1:1. Через 20 мин измеряли оптическую плотность полученных субстратов на спектрофотометре "Labsystem Multiscan RC" (Финляндия) при длине волны 620 нм. Бланкирование производится по смеси кислот.

В качестве контроля используют образцы с растворами субстратов интактных клеток.

2). определение активности АТФазы. К монослою клеток добавлялось по 50 мкл субстрата для АТФазы (8 мг adenosine-5'-triphosphate (ICN) на 1 мл на основе трис-НС1-буфера рН=7,8, содержавшего 87 мг NaCl, 28,7 мг КСl, 5,2 мг MgCl₂ на 6 Н₂ О). Образцы оставлялись в термостате при 37° с субстратом на 30 мин. Реакция останавливалась добавлением 100 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1:1. Через 20 мин измеряли оптическую плотность полученных субстратов с помощью спектрофотометра "Labsystem Multiscan RC" (Финляндия) при длине волны 620 нм. Бланкирование производится по смеси кислот.

В качестве контроля используют образцы с растворами субстратов интактных клеток.

3). определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Определение активности фермента проводили в МТТ-тесте, где в качестве субстрата использовали 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (метилтиазолилтетразолий бромид, МТТ, производства ICN).

В лунки к фиксированным клеткам добавляли по 100 мкл МТТ (2 мг/мл) на основе 0,1 М фосфатного буфера (pH 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора MnCl₂. Монослой клеток вместе с раствором МТТ инкубировали при 37°C в течение 30 мин, после чего надосадок удаляли, монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса и высушивали на воздухе.

Для подсчета гранул бромида диформазана клетки разрушали добавлением 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,4 М HCl.

Оптическую плотность определяли на микроплатном рейдере при длине волны 540 нм. Бланкирование производится по подкисленному изопропиловому спирту.

В качестве контроля использовали образцы с раствором субстрата интактных клеток.

4). Определение NO-образующей активности по содержанию метаболитов оксида азота (NO) - нитритов (NO ^- ₂). После инкубации в течение указанных выше временных промежутков при 37°C зараженных вирусами отбирали надосадок и монослой клеток замораживали и хранили при -20°C. К клеткам добавляли по 100 мкл Гриесс реактива, который состоял из равных объемов 0,1% 1-нафтил-этилендиамина дигидрохлорида и 1% сульфаниламида п-аминобензидина («ICN», Бельгия), на основе 2,5% раствора фосфорной кислоты. После 10 мин контакта определялась оптическая плотность полученных субстратов на спектрофотометре "Labsystem Multiscan RC" (Финляндия) при 540 нм. Бланкирование производится по Гриесс реактиву.

В качестве контроля используют образцы с растворами субстратов интактных клеток.

Для каждого параметра реактивности клеток рассчитывают показатель активации клеток (ПАК) - среднеарифметическое значение показателей оптической плотности растворов, содержащих продукты реакции клеток, зараженных вирусами в условных единицах, затем получают среднеарифметическое значение ПАК:

ПАК _ср=ПАК_0,5+ПАК₁+ПАК₂+ПАК ₃+ПАК₅+ПАК₆/N;

где N - количество временных промежутков.

Затем ПАК _ср делят на средний показатель оптической плотности раствора для интактных клеток и умножают на 100, что составляет индекс реактивности клеток - ИРК в условных единицах.

Данные представлены в таблицах 1, 2.

Таблица 1
Среднеарифметическое значение показателей оптической плотности растворов (ПАКср), содержащих продукты ферментативной реакции клеток
Ферменты и метаболиты оксида азота	ПАК в усл. eд. интактных клеток	ПАК в усл. ед. клеток, зараженных полиовирусом	ПАК в усл. ед. клеток, зараженных энтеровирусом Коксаки В1	ПАК в усл. ед. клеток, зараженных энтеровирусом Echo 11
АТФ-аза	0,044±0,005	0,044±0,003	0,049±0,002	0,046±0,005
5'нуклеотидаза	0,044±0,003	0,041±0,002	0,049±0,003	0,039±0,005
Сукцинатдегирогеназа	0,056±0,005	0,052±0,005	0,059±0,004	0,052±0,004
Содержание метаболитов оксида азота NO	0,056±0,004	0,059±0,006	0,065±0,006	0,06±0,005

Таблица 2
Показатели индекса реактивности клеток (ИРК), инфицированных пикорновирусами
Ферменты и метаболиты оксида азота	ИРК, зараженных полиовирусом	ИРК, зараженных энтеровирусом Коксаки В1	ИРК, зараженных энтеровирусом Echo 11
АТФ-аза	97	94	120
5'нуклеотидаза	91	91	114
Сукцинатдегидрогеназа	93	100	122
Содержание метаболитов оксида азота NO	93	100	109
ИРК ср, усл. ед.	93	96	116

Значения ИРК_ср меньше 100 отражают высокую степень цитопатогенности вирусов, а значения больше 100 - низкую степень цитопатогенности. Сравнение отдельных показателей ИРК, зараженных различными видами вирусов, не позволяет судить о степени их цитопатогенности. Тогда как суммарное определение ИРК_ср (по шести временным промежуткам и четырем параметрам реактивности клеток) четко показывает различие в степени цитопатогенности вирусов. Из представленной таблицы видно, что наибольшим цитопатогенным действием обладал поливирус (93 усл.ед.), а наименьшей степенью цитопатогенности обладал энтеровирус ECHO 11 (116 усл.ед.).

Пример 2

Для заражения клеток был взят высоковирулентный штамм «Primorye-73» вируса клещевого энцефалита (Р-73 ВКЭ,), выделенный из мозга умершего больного клещевым энцефалитом и два штамма «Primorye-202» и «Primorye-69» (Р-202 и Р-69), выделенные из крови больных иннапарантной формой заболевания. В экспериментах использовали вируссодержащую культуральную жидкость клеток СПЭВ, зараженных вирусом, содержащим 2 lg ТЦД ₅₀. Обработку образцов проводили аналогично примеру 1, данные представлены в таблицах 3, 4.

Таблица 3
Среднеарифметическое значение показателей оптической плотности растворов (ПАКср), содержащих продукты ферментативной реакции клеток
Ферменты и метаболиты оксида азота	ПАК в усл. ед. интактных клеток	ПАК в усл. ед. клеток, зараженных штаммом ВКЭ Р-73	ПАК в усл. ед. клеток, зараженных штаммом ВКЭ Р-202	ПАК в усл. ед. клеток, зараженных штаммом ВКЭ Р-69
АТФ-аза	0,045±0,003	0,049±0,005	0,048±0,004	0,045±0,002
5'нуклеотидаза	0,040±0,002	0,049±0,003	0,045±0,005	0,045±0,001
Сукцинатдегидрогеназа	0,043±0,005	0,047±0,004	0,047±0,004	0,047±0,003
Содержание метаболитов оксида азота NO	0,060±0,005	0,071±0,005	0,066±0,005	0,061±0,005

Полученные ИРК отдельно по каждому параметру реактивности зараженных вирусом клеток суммируют, при этом используют только целую часть значений, и делят на их количество.

Таблица 4
Показатели индекса реактивности клеток (ИРК), инфицированных штаммами ВКЭ различной вирулентности
Ферменты и метаболиты оксида азота	ИРК, зараженных штаммом ВКЭ Р-73	ИРК, зараженных штаммом ВКЭ Р-69	ИРК, зараженных штаммом ВКЭ Р-202
АТФ-аза	99	120	110
5'нуклеотидаза	99	108	109
Сукцинатдегидрогеназа	91	100	101
Содержание метаболитов оксида азота NO	99	116	109
ИРК со, усл.ед.	97	111	107

Таким образом, сравнение показателей ИРК, зараженных различными видами вирусов, не позволяет судить о степени цитопатогенности штаммов вируса клещевого энцефалита. Тогда как суммарное определение ИРК _ср (по шести временным промежуткам и четырем параметрам реактивности клеток) четко показывает различие в степени цитопатогенности штаммов вирусов. Из представленной таблицы видно, что наибольшим цитопатическим эффектом обладал штамм Р-73 ВКЭ (97 усл.ед.), а наименьшей степенью цитопатогенности обладал штамм ВКЭ Р-69 (111 усл.ед.).