последовательности пептидов и пептидные композиции

Классы МПК:	A61K38/01 продукты гидролиза белков; их производные
Автор(ы):	СТОЛОФФ Грегори Алан (GB), КАПАРРОС-ВАНДЕРЛЕЙ Уилсон Ромеро (GB)
Патентообладатель(и):	ПЕПТСЕЛЛ ЛИМИТЕД (GB)
Приоритеты:	подача заявки: 2008-09-05 публикация патента: 20.11.2012

Группа изобретений относится к полипептидной композиции, содержащей один или несколько полипептидов, которые являются иммуногенными у позвоночного, так что они вызывают у позвоночного продукцию клеток иммунной системы, способных к распознаванию по меньшей мере одного эпитопа в белковой фракции слюны членистоногих, причем белковая фракция слюны членистоногих имеет массу, составляющую 20 кДа или меньше, а полипептиды независимо выбирают из последовательностей полипептидов SEQ ID NO:1-44 или имеющих 7 аминокислот или более подпоследовательностей, способам ее получения, применению для получения лекарственного средства. Группа изобретений эффективна при лечении и профилактике распространяемой членистоногими болезни. 9 н. и 35 з.п. ф-лы, 10 ил., 21 табл., 4 пр.

последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737

Формула изобретения

1. Полипептидная композиция, содержащая один или несколько полипептидов, которые являются иммуногенными у позвоночного, так что они вызывают у позвоночного продукцию клеток иммунной системы, способных распознавать по крайней мере один эпитоп в белковой фракции слюны членистоногих, причем белковая фракция слюны членистоногих имеет массу, составляющую <20 кДа, а полипептиды независимо выбраны из:

полипептидных последовательностей SEQ ID NO:1-28, 33-39 и 44 или подпоследовательностей этих последовательностей, имеющих 7 аминокислот или более:

SEQ ID NO:1 HLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPP

SEQ ID NO:2 PLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCL

SEQ ID NO:3 KNVFFALLLWLVCCLVSVQGNEI

SEQ ID NO:4 KLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGV

SEQ ID NO:5 FLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCL

SEQ ID NO:6 NDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKA

SEQ ID NO:7 FYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPL

SEQ ID NO:8 MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAA

SEQ ID NO:9 DGASAITKIVLELTPEQAAAV

SEQ ID NO:10 TLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILA

SEQ ID NO:11 GRVMCLLRLMSTLLWLSIVGK

SEQ ID NO:12 LYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTL

SEQ ID NO:13 MYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD

SEQ ID NO:14 NAEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKR

SEQ ID NO:15 ALIGLLLCSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRL

SEQ ID NO:16 SKLFVLAFLCLALWWQSAPQYARGDVPT

SEQ ID NO:17 SMLVAFATLSVALWWAIPANFNYGGGGGYFINGTGQ

SEQ ID NO:18 IYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQ

SEQ ID NO:19 EMKLAKVALVTISLWFMAWTPYLVINFTGI

SEQ ID NO:20 LLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLV

SEQ ID NO:21 FYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAG

SEQ ID NO:22 VLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGD

SEQ ID NO:23 KLTPTWWLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATT

SEQ ID NO:24 SLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEV

SEQ ID NO:25 TYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLI

SEQ ID NO:26 RYFWIALICPLIIVETLAV

SEQ ID NO:27 LLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFV

SEQ ID NO:28 VLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMP

SEQ ID NO:33 KFYRLISTLLWWIAPRHQCSPFFFQYNRPYL

SEQ ID NO:34 NYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIWQL

SEQ ID NO:35 QYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQC

SEQ ID NO:36 EYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKL

SEQ ID NO:37 KLFLTLLSTLSVAMVFALPAHHHSRG

SEQ ID NO:38 ELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAV

SEQ ID NO:39 SYFLTVCLLALVQSETVQD

SEQ ID NO:44 LLLAMVLLPLLLLESWPYAAAEKVW.

2. Полипептидная композиция по п.1, где композиция

дополнительно содержит одну или несколько последовательностей, независимо выбранных из:

полипептидных последовательностей SEQ ID NO:29-32 или 40-43 или подпоследовательностей этих последовательностей, имеющих 7 аминокислот или более:

SEQ ID NO:29 VLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYM

SEQ ID NO:30 VLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMWRMLKFVRLLP

SEQ ID NO:31 RVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHET

SEQ ID NO:32 ELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKI

SEQ ID NO:40 AMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSS

SEQ ID NO:41 SFAWLLYGIILRSNFLWQNLMALALSAVQLSLFII

SEQ ID NO:42 AFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSAL

SEQ ID NO:43 GLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIR.

3. Полипептидная композиция по п.1 или 2, которая содержит 2-12 полипептидов или более предпочтительно 2-6 полипептидов.

4. Полипептидная композиция по п.1, в которой один или несколько полипептидов являются эпитопами цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), и/или один или несколько полипептидов являются эпитопами Т-лимфоцитов-хелперов (Th), и/или один или несколько полипептидов являются эпитопами В-лимфоцитов.

5. Полипептидная композиция по п.1, содержащая 2, 3, 4, 5, 6 или более эпитопов, как определено в п.1.

6. Полипептидная композиция по п.1, которая является иммуногенной в отношении множества белков слюны членистоногих.

7. Полипептидная композиция по п.1, в которой белковой фракцией слюны членистоногих является белковая фракция слюны любого вида комаров, предпочтительно Anopheles gambiae.

8. Полипептидная композиция по п.1, дополнительно содержащая одну или несколько дополнительных последовательностей из белка слюны членистоногих.

9. Полипептидная композиция по п.1, в которой подпоследовательность содержит 8, 9, 10 или 11 аминокислот или больше.

10. Полипептидная композиция по п.1, по существу, состоящая из двух или нескольких полипептидов, имеющих последовательность из последовательностей SEQ ID NO:1-28, 33-39, 44.

11. Полипептидная композиция по п.1, в которой присутствуют все полипептиды, имеющие последовательности SEQ ID NO:1-6, и/или в которой присутствуют все полипептиды, имеющие последовательности SEQ ID NO:20, 28, 30-32 и 35, и/или в которой присутствуют все полипептиды, имеющие последовательности SEQ ID NO:6, 9, 29, 31 и 35, и/или в которой присутствуют все полипептиды, имеющие последовательности SEQ ID NO:6, 9 и 35.

12. Полипептидная композиция по п.1, использующаяся в медицине.

13. Полипептидная композиция по п.1, использующаяся в ветеринарии.

14. Полипептидная композиция, которая содержит полипептидную композицию по любому из пп.1-13 и носитель.

15. Полипептидная композиция по п.14, в которой носитель включает адъювант и/или наполнитель.

16. Способ получения полипептидной композиции по любому из пп.1-13, включающий смешивание или объединение одного или нескольких полипептидов, определенных в любом из пп.1-13, с одним или несколькими дополнительными полипептидами, определенными в любом из пп.1-13, и/или с одним или несколькими дополнительными компонентами, такими как носитель, наполнитель, адъювант, буфер или стабилизатор.

17. Способ получения полипептидной композиции по п.16, который включает связывание, объединение или смешивание полипептидной композиции по любому из пп.1-13 с носителем.

18. Способ по п.17, в котором носитель включает адъювант и/или наполнитель.

19. Лекарственное средство против распространяемой членистоногими болезни, содержащее полипептидную композицию по любому из пп.1-13 и, необязательно, подходящий наполнитель и/или адъювант.

20. Лекарственное средство по п.19, где членистоногим является кровососущее членистоногое.

21. Лекарственное средство по п.20, где кровососущее членистоногое выбирают из комаров, кровососущих клещей, песчаных москитов, клещей подкласса Acarina и блох.

22. Лекарственное средство по п.20, где членистоногое выбирают из Anopheles sp., Aedes sp., Culex sp., Mansonia sp., Chrysops sp., Simulium sp., Tnatoma sp., Rhodnius sp., Panstrongylus sp., Glossina sp., Tabanus sp., Phlebotomus sp., Lutzomyia sp., Pediculus sp., Ornithodoros sp., Ixodes sp., Pediculus sp., Pulex sp., Hemagogous spegazzani, Ochlerotatus sp. и Coquillettidia sp.

23. Лекарственное средство по любому из пп.19-22, где распространяемой членистоногими болезнью является болезнь, выбираемая из малярии, филяриатоза, трипаносомоза, лейшманиоза, онхоцеркоза, лихорадки денге, болезни Лаима, туляремии, эпидемического возвратного тифа, эпидемического сыпного тифа, чумы, желтой лихорадки, лихорадки долины Рифт и энцефалита, в том числе энцефалита Сент-Луис, энцефалита Западного Нила, восточного энцефалита лошадей, энцефалита Ла-Кросс и восточного энцефалита лошадей.

24. Способ получения лекарственного средства по п.19, который включает связывание, объединение или смешивание композиции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13 с подходящим наполнителем и/или адъювантом.

25. Композиция вакцины против распространяемой членистоногими болезни, содержащая композицию по любому из пп.1-13 и, необязательно, подходящий наполнитель и/или адъювант.

26. Композиция вакцины по п.25, где членистоногим является кровососущее членистоногое.

27. Композиция вакцины по п.26, где кровососущее членистоногое выбирают из комаров, кровососущих клещей, песчаных москитов, клещей подкласса Acarina и блох.

28. Композиция вакцины по п.26, где членистоногое выбирают из Anopheles sp., Aedes sp., Culex sp., Mansonia sp., Chrysops sp., Simulium sp., Triatoma sp., Rhodnius sp., Panstrongylus sp., Glossina sp., Tabanus sp., Phlebotomus sp., Lutzomyia sp., Pediculus sp., Ornithodoros sp., Ixodes sp., Pediculus sp., Pulex sp., Hemagogous spegazzani, Ochlerotatus sp. и Coquillettidia sp.

29. Композиция вакцины по любому из пп.25-28, где распространяемой членистоногими болезнью является болезнь, выбираемая из малярии, филяриатоза, трипаносомоза, лейшманиоза, онхоцеркоза, лихорадки денге, болезни Лайма, туляремии, эпидемического возвратного тифа, эпидемического сыпного тифа, чумы, желтой лихорадки, лихорадки долины Рифт и энцефалита, в том числе энцефалита Сент-Луис, энцефалита Западного Нила, восточного энцефалита лошадей, энцефалита Ла-Кросс и восточного энцефалита лошадей.

30. Способ получения композиции вакцины по п.25, который включает связывание, объединение или смешивание композиции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13 с подходящим наполнителем и/или адъювантом.

31. Способ лечения или профилактики распространяемой членистоногими болезни, включающий введение позвоночному полипептидной композиции по любому из пп.1-15, лекарственного средства по любому из пп.19-23 или вакцины по любому из пп.25-29.

32. Способ по п.31, в котором позвоночное выбирают из млекопитающего, птицы, пресмыкающегося и рыбы, и предпочтительно из человека, домашнего животного или сельскохозяйственного животного, крупного рогатого скота, или птицы.

33. Способ по п.31 или 32, где членистоногим является кровососущее членистоногое.

34. Способ по п.33, где кровососущее членистоногое выбирают из комаров, кровососущих клещей, песчаных москитов, клещей подкласса Acarina и блох.

35. Способ по п.33, где членистоногое выбирают из Anopheles sp., Aedes sp., Culex sp., Mansonia sp., Chrysops sp., Simulium sp., Triatoma sp., Rhodnius sp., Panstrongylus sp., Glossina sp., Tabanus sp., Phlebotomus sp., Lutzomyia sp., Pediculus sp., Omithodoros sp., Ixodes sp., Pediculus sp., Pulex sp., Hemagogous spegazzani, Ochlеrоtatus sp. и Coquillettidia sp.

36. Способ по любому из пп.31-35, где распространяемой членистоногими болезнью является болезнь, выбираемая из малярии, филяриатоза, трипаносомоза, лейшманиоза, онхоцеркоза, лихорадки денге, болезни Лайма, туляремии, эпидемического возвратного тифа, эпидемического сыпного тифа, чумы, желтой лихорадки, лихорадки долины Рифт и энцефалита, в том числе энцефалита Сент-Луис, энцефалита Западного Нила, восточного энцефалита лошадей, энцефалита Ла-Кросс и восточного энцефалита лошадей.

37. Применение полипептидной композиции по любому из пп.1-15 для производства лекарственного средства или вакцины, эффективных для лечения или профилактики распространяемой членистоногими болезни.

38. Применение по п.37, где членистоногим является кровососущее членистоногое.

39. Применение по п.38, где кровососущее членистоногое выбирают из комаров, кровососущих клещей, песчаных москитов, клещей подкласса Acarina и блох.

40. Применение по п.38, где членистоногое выбирают из Anopheles sp., Aedes sp., Culex sp., Mansonia sp., Chrysops sp., Simulium sp., Triatoma sp., Rhodnius sp., Panstrongylus sp., Glossina sp., Tabanus sp., Phlebotomus sp., Lutzomyla sp., Pediculus sp., Ornithodoros sp., Ixodes sp., Pediculus sp., Pulex sp., Hemagogous spegazzani, Ochlerotatus sp. и Coquillettidia sp.

41. Применение по любому пп.37-40, где распространяемой членистоногими болезнью является болезнь, выбираемая из малярии, филяриатоза, трипаносомоза, лейшманиоза, онхоцеркоза, лихорадки денге, болезни Лайма, туляремии, эпидемического возвратного тифа, эпидемического сыпного тифа, чумы, желтой лихорадки, лихорадки долины Рифт и энцефалита, в том числе энцефалита Сент-Луис, энцефалита Западного Нила, восточного энцефалита лошадей, энцефалита Ла-Кросс и восточного энцефалита лошадей.

42. Композиция нуклеиновой кислоты, содержащая одну или несколько нуклеиновых кислот, включающих последовательность, кодирующую один или несколько полипептидов в полипептидной композиции по любому из пп.1-13.

43. Композиция нуклеиновой кислоты по п.42, которая является композицией ДНК или РНК.

44. Композиция нуклеиновой кислоты по п.42 или 43, которая содержит плазмиду или рекомбинантный вирус.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к последовательностям пептидов, композициям, содержащим последовательности пептидов, в частности вакцинам против распространяемых членистоногими болезней, включающим указанные последовательности и композиции, и применениям последовательностей. Настоящее изобретение имеет, в частности, отношение к вакцинам, которые защищают от любой одной или нескольких распространяемых комарами болезней, в том числе, одного или нескольких малярийных штаммов.

Защита от болезни важна для выживания всех животных, и используемым для этой цели защитным механизмом является иммунная система животного. Поэтому понимание иммунной системы является ключом к осознанию разработки новых или более современных лечений одинаково для людей и животных.

Механизм функционирования иммунной системы исследовался на протяжении многих лет. Система состоит из ряда типов клеток и множества молекул, что делает ее чрезвычайно сложной. Даже после многих лет исследования весь объем компонентов иммунной системы и их взаимодействие друг с другом поняты не полностью.

Много лет назад признавалось, что субъект, выздоровевший от конкретной болезни, может приобрести в будущем некоторый иммунитет к этой болезни, но не к болезни, которой субъект еще не заболел. В то время этот фундаментальный аспект иммунной системы интерпретировали, считая, что иммунная система приобретает что-то вроде «памяти» в отношении некоторых патогенов после подвергания воздействию таких патогенов, при этом память является специфической для конкретной болезни.

Мало-помалу стало известно, что подвергание воздействию менее опасных вариантов патогена может вызвать защиту от более опасных вариантов (например, подвергание воздействию вируса осповакцины - защитить от вируса натуральной оспы или подвергание воздействию инактивированной сибиреязвенной бациллы - защитить от живой сибиреязвенной бациллы). Так возникла идея вакцинации против болезни.

В настоящее время известно, что иммунная система имеет по меньшей мере две части: врожденный иммунитет и приобретенный иммунитет. Врожденный иммунитет является полностью функциональным до проникновения патогена в систему, в то время как приобретенный иммунитет включается после проникновения патогена в систему. Она затем проявляет специфичную для патогена атаку. Врожденная иммунная система включает ряд компонентов, в том числе фагоциты, такие как макрофаги, которые (в соответствии с названием) «пожирают» или поглощают чужеродные тела, такие как патогены.

Обычно, но не исключительно, настоящее изобретение имеет отношение к приобретенной иммунной системе, и, кроме особо оговоренных случаев, «иммунная система» в контексте настоящего изобретения относится к приобретенной иммунной системе.

Для более полного понимания того, каким образом функционирует иммунная система, должна быть подвергнута тщательному рассмотрению роль ее отдельных компонентов. В отношении приобретенной иммунной системы хорошо известно, что иммунитет к патогенам обеспечивается действием лимфоцитов, которые являются типом самых распространенных клеток в иммунной системе. Существует два типа лимфоцитов: В-лимфоциты и Т-лимфоциты. Их обычно называют В-клетками и Т-клетками соответственно.

В-клетки обладают способностью к преобразованию в плазматические клетки, которые продуцируют антитела. Антитела являются очень важными компонентами иммунной системы животных. Они продуцируются в ответ на некую отличительную часть инвазивного патогена (антиген патогена - при этом антигены определяют здесь как любое чужеродное вещество, распознаваемое иммунной системой) и являются, как правило, специфичными для этого патогена. Однако если два патогена являются очень схожими или по меньшей мере содержат одинаковый антиген, антитела, продуцированные против одного патогена, могут, тем не менее, быть эффективными против другого патогена (они могут давать «перекрестную реакцию»). Это объясняет, почему вакцинация вирусом осповакцины может защитить от вируса натуральной оспы. Важно понимать, что антитела «распознают» только небольшую часть антигенной молекулы патогена, а не весь патоген. Эти части называют эпитопами.

Т-клетки не обладают антителами или не продуцируют их. Вместо этого они распознают фрагменты (т.е. эпитопы) чужеродного антитела, образующие комплекс с главным комплексом гистосовместимости (MCH) (или в случае людей главным комплексом гистосовместимости человека (HLA)), через посредство специализированного рецептора, известного как TCR (рецептор Т-клеток). Сами Т-клетки делятся на субпопуляции, которые обладают или регуляторной функцией, или эффекторной функцией. Клетки-эффекторы связаны с «осуществлением» удаления чужеродных веществ. Например, цитотоксические Т-клетки (CTL) являются клетками-эффекторами, которые способны к уничтожению инфицированных клеток, а также других нежелательных разновидностей, таких как опухолевые клетки. С другой стороны, регуляторные Т-клетки играют роль в оказании помощи эффекторным Т- и В-клеткам стать более эффективными. Вследствие этой функции эти регуляторные Т-клетки часто называют Т-клетками-«хелперами». Полагают, что другие регуляторные Т-клетки, называемые Т-клетками-«супрессорами», подавляют иммунные ответы, но они менее хорошо изучены. Регуляторные Т-клетки могут также взаимодействовать с компонентами врожденной иммунной системы для усиления их активности.

У нормального здорового индивидуума лимфоциты в иммунной системе остаются в неактивном состоянии «покоя» до вызова иммунного ответа. При необходимости иммунного ответа лимфоциты становятся активированными, подвергаются пролиферации и начинают выполнять отведенные им функции. Например, любая покоящаяся Т-клетка, представляющая на своей поверхности TCR, который распознает эпитоп инвазивного патогена, образующий комплекс с молекулой МНС, активируется, подвергается пролиферации (это называют «размножением клона»), и получаемое в результате потомство начинает активно выполнять отведенные им эффекторные функции, требуемые для борьбы с инвазивными организмами.

После завершения иммунного ответа (т.е. удаления патогенов и/или инфицированных клеток) лимфоциты снова возвращаются к состоянию покоя. Однако это состояние покоя не эквивалентно исходному неактивному состоянию покоя. Активированные, но покоящиеся лимфоциты могут быть быстро подвергнуты рекрутингу и стимуляции для пролиферации в ответ на инфицирование тем же самым, или близко родственным, патогеном впоследствии.

Эта способность активированных покоящихся лимфоцитов к созданию более быстрого и более сильного ответа после второго столкновения с инвазивным патогеном эффективно снабжает «памятью» иммунную систему. Эксплуатация памяти иммунной системы является основой для всех долговременных иммунопрофилактических лекарственных средств (например, вакцин) и остается целью разработки многих долговременных иммунопрофилактических лекарственных средств.

Для выполнения клетками своих функций внутри сложных систем животного на поверхности клеток должны быть «рецепторы». Эти рецепторы способны к «распознанию» специфических веществ, которые контролируют различные весьма важные процессы, такие как активация, пролиферация и адгезия к другим клеткам или веществам. Например, в случае иммунной системы рецепторы на Т- и В-клетках позволяют им не только распознавать антиген, но также взаимодействовать друг с другом и, следовательно, регулировать свои активности. Без этих рецепторов клетки утратили бы весьма важное средство связи и не были бы способны к эффективному согласованному действию, которое является весьма важным для иммунной системы многоклеточного организма.

Для того чтобы иммунная система была способна к специфическому распознанию широкого ряда патогенов, присутствующих в окружающей среде, и началу действий в отношении такого ряда, в ней были созданы два типа в высокой степени вариабельных рецепторов антигенов на лимфоцитах: антитела в В-клетках и рецепторы Т-клеток, или TCR, в Т-клетках.

Для способствования в распознавании широкого ряда инвазивных агентов иммунной системой в организме существует огромное множество различных рецепторов возможных антигенов. В действительности у индивидуума существует приблизительно 10¹² различных В-клеток и рецепторов Т-клеток. Каждая отдельная В-клетка имеет только один тип рецептора, и значит, для начала действий в отношении конкретного патогена должна быть отобрана В-клетка, имеющая «максимально соответствующий» рецептор для антигена этого патогена. Этот процесс называют «отбором клона». Теоретически может отвечать только один клон (моноклональный ответ), или несколько клонов (олигоклональный ответ), или множество клонов (поликлональный ответ) в зависимости от числа антигенов/эпитопов, экспонированных патогеном, и специфичности различных отобранных В-клеток в отношении этих антигенов/эпитопов.

Между типами антигенов, которые могут быть распознаны В-клетками и Т-клетками, существует основное различие. Насколько известно, только рецепторы на поверхности В-лимфоцитов (т.е. антитела) способны к прямому распознаванию антигенов, таких как белки вирусов и бактерий или чужеродные молекулы, растворенные в жидкости организма. Антитела могут также продуцироваться в растворимой форме В-клетками, когда они активируются и преобразуются в плазматические клетки. Антитела также называют иммуноглобулинами (сокращенно Ig). С другой стороны, рецепторы Т-клеток распознают только короткие пептиды, также известные как Т-клеточные эпитопы, на поверхности клеток организма. Эти Т-клеточные эпитопы создаются при деградации больших белков, которые являются или внутренними (т.е. встречающими в природе белками организма), или не внутренними (т.е. происходящими из чужеродных организмов, инфицирующих организм). Только эпитопы, происходящие из чужеродных белков, т.е. антигены, обычно способны к вызову иммунного ответа в организме. После создания эти эпитопы связываются со специальным типом молекулы, МНС (главным комплексом гистосовместимости), и получаемый в результате комплекс затем презентируется на поверхности клетки для связывания с рецептором Т-клеток.

Должно быть понятно, что из-за деструктивной природы иммунного ответа он должен быть направлен только против чужеродных патогенов, а не против собственных клеток или белков организма. Таким образом, иммунной системе необходимо проводить различие между «внутренними» и «не внутренними» белками или клетками. Было сделано предположение, что, хотя действующие против внутренних белков или клеток клоны лимфоцитов продуцируются, они подвергаются делеции до того, как может возникнуть какой-либо ответ. Этот процесс называют «делецией клона». Также было сделано предположение, что любые действующие против внутренних белков или клеток лимфоциты могут сохраняться, но только в «выключенном» состоянии. Этот механизм называют «клональной толерантностью». Какой бы не рассматривался процесс, остается неясным точный, лежащий в основе механизм, который позволяет лимфоидным тканям, таким как вилочковая железа, идентифицировать отдельные клоны Т-клеток, действующие против внутренних белков или клеток, из пула Т-лимфоцитов, действующих только против не внутренних белков или клеток.

На протяжении многих лет было известно, что главный комплекс гистосовместимости (МНС) играет ключевую роль в иммунной системе животных. Молекулы МНС способствуют распознаванию антигенов Т-клетками, как уже обсуждалось выше. Существует три основных типа молекул МНС, класса I, класса II и класса III. Молекулы МНС класса I и класса II являются гликопротеинами, которые присутствуют на поверхности клетки, в то время как молекулы МНС класса III обычно являются растворимыми молекулами, присутствующими внутри клетки. Существует большое число различных типов молекул МНС. Например, у людей (у которых MHC называют HLA, главным комплексом гистосовместимости человека) существует несколько сотен различных аллелей генов, кодирующих молекулы МНС, что означает, что в популяции людей существует множество различных типов HLA. МНС различных видов обычно присваивают различные условные обозначения, так МНС мыши называют Н-2, крысы - RT1, а кролика - RLA. Различные области генов, кодирующие различные молекулы МНС у индивидуума, обычно называют в индивидуальном порядке, например HLA-A, HLA-C и т.п. у людей.

Молекула МНС является крайне важной молекулой иммунной системы, поскольку она является именно той молекулой, которая осуществляет презентацию эпитопов антигенов иммунной системе. Например, если Т-клетка должна отвечать на конкретный патоген, патоген должен обладать по меньшей мере одним антигеном (например, белком), который имеет по меньшей мере один эпитоп (например, пептидный участок белка), который может связываться с молекулой МНС на поверхности клетки и, следовательно, взаимодействовать с Т-клеткой, которая связывается с комплексом МНС-пептид. Следовательно, иммунный ответ зависит от способности МНС связываться с эпитопом. В отсутствие эпитопа, с которым будет связываться МНС, или в отсутствие Т-клетки, с которой будет связываться комплекс МНС-пептид, иммунный ответ возникать не будет.

Что касается «внутренних» белков, один из нескольких эпитопов, однако, может быть способен к связыванию с молекулой МНС и, следовательно, к возможному вызову иммунного ответа. В этих случаях должен быть предусмотрен специфический «сигнал» для делеции или «выключения» клонов лимфоцитов, действующих против внутренних белков.

Несмотря на растущую сумму знаний о работе иммунной системы позвоночных вакцины против многих болезней остаются труднодостижимыми. Некоторые патогены (например, ВИЧ и вирус гриппа) подвергаются быстрому мутированию, так что эпитопы, которые могут быть пригодными мишенями для создания вакцины против одного штамма, не пригодны после возникновения мутации, поскольку эпитоп в новом штамме изменился. Были тщательно исследованы другие патогены, такие как плазмодий (патоген, ответственный за малярию), но мишени на патогене, которые можно использовать для разработки вакцины, оказалось трудно идентифицировать или просто не обеспечивали эффективную вакцину in vivo.

Патогены, прогресс в исследовании которых особенно необходим, являются патогенами, которые распространяются членистоногими и вызывают так называемые «распространяемые членистоногими болезни». Такие болезни являются основной причиной смерти по всему миру и включают, в числе других, малярию и лихорадку денге - некоторые из наиболее значительных средств уничтожения популяции на сегодняшний день, в частности, в более бедных областях мира. Примеры включают, но без ограничения, болезни, перечисленные ниже в таблице 1.

Таблица 1 Распространяемые членистоногими болезни, с их патогенами и переносчиками инфекции
Болезнь	Патоген (паразит/вирус)	Являющийся членистоногим переносчик инфекции
Малярия	Plasmodium sp.	Anopheles sp.
Филяриатоз	Wuchereria sp. Brugia sp. Loa sp. Mansonella sp.	Anopheles sp. Aedes sp. Culex sp. Mansonia sp. Chrysops sp.
Онхоцеркоз	Onchocerca sp.	Simulium sp.
Болезнь Чагаса Африканский трипаносомоз	Trypanosoma sp.	Triatoma sp. Rhodnius sp. Panstrongylus sp. Glossina sp. Tabanus sp.

Лейшманиоз	Leishmania sp.	Phlebotomus sp. Lutzomyia sp.
Туляремия	Franciscella tulariensis	Tabanus sp.
Эпидемический возвратный тиф Болезнь Лайма	Borrelia sp.	Pediculus sp Ornithodoros sp. Ixodes sp.
Эпидемический сыпной тиф	Rickettsia sp.	Pediculus sp. Pulex sp.
Чума	Yersinia sp.	Pulex sp.
Лихорадка денге	DEN-1 - -4 flavivirus	Aedes sp.
Желтая лихорадка	Yellow fever flavivirus	Aedes sp. Hemagogous spegazzani.
Лихорадка долины Рифт	Rift valley virus	Aedes sp.
Энцефалит, в том числе энцефалит Сент-Луис, энцефалит Западного Нила, восточный энцефалит лошадей, энцефалит Ла-Кросс, восточный энцефалит лошадей	Flavi-, Alpha- и Bunyaviruses	Culex sp. Ochlerotatus sp. Aedes sp. Coquillettidia sp. Anopheles sp.

Ранее попытки обеспечить вакцины против распространяемых членистоногими болезней включали идентификацию существующих штаммов патогенов и затем получение вакцины, специфичной в отношении этого патогена. Как правило, вакцины основывались на В-клеточном ответе (образовании антител) (и изредка на Т-клеточном ответе), при этом антитело реагировало с поверхностными антигенами конкретного штамма патогена, против которого оно разрабатывалось. Как правило, включающие антигены поверхностные белки меняются от одного вызывающего болезнь штамма к последующему штамму и полностью отличны для различных патогенов. Результатом этого является то, что обычные вакцины обычно защищают только от одного конкретного патогена или штамма патогена (если они вообще эффективны) и не будут защищать от других штаммов или нового штамма, который является следствием мутации. Поэтому особая вакцина требуется для защиты от каждой болезни и часто от различных и/или новых штаммов, вызывающих одну и ту же болезнь.

На протяжении некоторого периода времени известно, что иммунизация против слюны членистоногих или против антигенов, экспрессируемых в кишке членистоногих, может защитить индивидуума от инфицирования. Статьи, в которых это обсуждается, включают выделенные ниже статьи.

R.G. Titus et al. последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737 The immunomodulatory factors of arthropod saliva and the potential for these factors to serve as vaccine targets to prevent pathogen transmission , Parasite Immunology, 2006, 28, 131-141. В статье приводится обзор известных иммуномодуляторов в слюнных железах членистоногих. Иммуномодулирующие факторы могут усилить передачу патогена членистоногими. Слюна переносчика инфекции содержит большое число веществ, активности которых включают способность к ингибированию гемостаза, сужения кровеносных сосудов и развития воспаления и иммунного ответа. У комаров существует несколько ингибиторов Т-клеток. Если слюна членистоногих усиливает инфицирование патогенами, которые передают членистоногие, должен быть возможен контроль передачи патогена с помощью вакцинации хозяина против молекулы (молекул) в слюне, которые усиливают инфицирование, блокируя, тем самым, усиливающие эффекты слюны и, следовательно, предотвращая укоренение инфекции - патогена у хозяина. Был клонирован ген максадилана или МАХ, который кодирует сильный вазодилататор в слюне песчаного москита, и были исследованы активности белкового продукта гена. Эффекты МАХ песчаного москита проявляются через первичные воздействия на фагоциты, и это приводит к последующим иммуномодулирующим/ингибиторным эффектам на Т-клеточные ответы. Мышей вакцинировали против МАХ путем инъецирования МАХ в полном адъюванте Фрейнда, а затем МАХ в неполном адъюванте Фрейнда и затем бустер-инъецирования растворимого МАХ до достижения титра антител против МАХ в крови между 1/10000 и 1/20000. Вакцинированные мыши были явно защищены от инфекции.

G.A.T. Targett, последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737 Parasites, arthropod vectors, and immune responses , Parasite Immunology, 2006, 28, 117-119. В этой статье демонстрируется, что отсасывание крови комарами вызывает иммунные реакции на слюну насекомых. Они включают как реакции гиперчувствительности, так и образование антител против комаров. Определение образований этих антител может иметь эпидемиологическое значения для контролирования популяций переносчиков инфекции, а применение таких образований - для оценки эффективности стратегий вмешательства. Получение вакцин, которые бы уменьшали отсасывание крови, развитие и/или выживание являющихся членистоногими переносчиков инфекции или эктопаразитов, является привлекательной, хотя и амбициозной идеей. Одной важной целью является контролирование самих членистоногих-эктопаразитов, в то время как второй целью является использование вакцины против членистоногих в качестве средства для нанесения ущерба паразитам, которых членистоногое распространяет или внутри самого себя, или когда происходит передача являющемуся позвоночным хозяину.

M.M.A. Whitten et al., последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737 Mosquito midguts and malaria: cell biology, compartmentalization and immunology , Parasite Immunology, 2006, 28, 121-130. Средняя кишка комара представляет собой одну из самых трудных сред для выживания и развития плазмодия. Во время их попыток преодолеть эпителий средней кишки по пути в слюнные железы подвижные оокинеты быстро выявляются и метятся распознающими факторами комаров и делаются мишенью для разрушения рядом иммунных ответов, которые осуществляют рекрутинг вызывающих гибель факторов как из средней кишки, так и из других тканей в окружающей брюшной полости. Точное взаимодействие этих факторов и паразита является в высокой степени специфическим для вида и штамма, как и выбор времени и пути инвазии паразита. Средняя кишка образует физический барьер, отделяющий и защищающий ткани гемоцеля от пищеварительных ферментов и инфекционных агентов. Она состоит из одного слоя поляризованных эпителиальных клеток, при этом на одном из двух полюсов обнаруживаются различные морфологические адаптации для увеличения площади поверхности, вовлеченной в обмен молекул. Отличная микроворсинчатая апикальная поверхность экспонирована в просвет кишечника, и ее основной ролью является секреция пищеварительных ферментов и абсорбция питательных веществ. Структурные изменения, инициируемые отсасыванием крови, включают образование плотного неклеточного, хитинового перитрофического матричного материала (РМ), который секретируется эпителием средней кишки и который подвергается полимеризации под действием расщепленной пищи в виде крови. РМ окружает комок крови и образует барьер для паразитов и попыток бактерий пройти через эпителий средней кишки.

P.F. Billingsley et al. последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737 Immune interactions between mosquitoes and their hosts , Parasite Immunology, 2006, 28, 143-153. Антитела, направленные на среднюю кишку комаров, также важны при разработке вакцин против комаров. Секреция слюны комаром во время отсасывания крови важна для успешного определения местонахождения кровеносных сосудов хозяина и воздействия на гемостатические и иммунные реакции хозяина. Методы иммуноблоттинга использовались для характеристики распознавания антигенов слюны антителами против комаров хозяина. Во время отсасывания крови комар заглатывает иммунные факторы хозяина как растворимые, так и клеточные, которые остаются активными в средней кишке. В противоположность антигенам слюны, хозяин обычно не будет подвергаться воздействию антигенов из внутренних органов комара, что наводит на мысль об использовании этих «скрытых» антигенов в качестве мишеней для создания вакцины. Наилучшим источником скрытых антигенов является средняя кишка, поскольку после отсасывания крови в ней содержится пища в виде крови с составляющими ее иммунными эффекторными молекулами и клетками. Средние кишки и препараты всего тела Ae. aegypti индуцировали высокие титры антител у мышей, и была установлена связь увеличенной гибели комаров, которые питались их кровью, с антителом, которое связывается с микроворсинками средней кишки. Образования IgG индуцировали у мышей, которым инъецировали библиотеку кДНК средней кишки An. Gambiae, и высокие титры антител получали после бустер-иммунизации белками средней кишки. Для комаров, кормящихся кровью этих мышей, демонстрировались воспроизводимые снижения выживания и фертильности, но, что интересно, клеточные, а не гуморальные ответы, по-видимому, были ответственны за москитоцидные эффекты. Эти исследования столкнулись с проблемами. Даже в пределах экспериментов нестабильность может быть высокой, и трудно достичь воспроизводимости эффекта. Иммунизация сложной смесью или белковых экстрактов средней кишки, или библиотекой кДНК средней кишки означала, что протективные, являющиеся мишенями антигены не были идентифицированы.

Однако несмотря на эту сумму знаний все еще не разработана эффективная вакцина против распространяемых членистоногими болезней, в которой используется этот механизм действия. Дальнейшей значительной проблемой, связанной с существующими вакцинами против распространяемых членистоногими болезней, основывающимися или на В-клеточных, или Т-клеточных ответах, является то, что каждая из них защищает только от одного патогена или самое большое от одного существующего штамма патогена и не обеспечивает защиту от возможных будущих патогенов или от множества патогенов. Существует отчаянная необходимость в вакцине, защищающей от множества распространяемых членистоногими болезней, включающего средства крупномасштабного уничтожения, такие как малярия и лихорадка денге.

В настоящее время авторы настоящего изобретения смогли идентифицировать последовательности специфических иммуногенных пептидов, присутствующие в белках слюны членистоногих, которые могут обеспечить защиту от всех распространяемых членистоногими патогенов, и разработали вакцины против болезней, которые они вызывают, используя идентифицированные последовательности. Таким образом, авторы настоящего изобретения разработали пептиды, применимые в вакцинах, индуцирующих иммунный ответ и, в частности, быстрый вторичный иммунный ответ против распространяемых членистоногими болезней.

Соответственно, целью настоящего изобретения является разрешение проблем, связанных с известным уровнем техники, представленным выше. Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение полипептидной композиции, которая способна индуцировать у позвоночных иммунный ответ (например, клеточный ответ, включающий Т-клеточный ответ и/или В-клеточный ответ) против множества распространяемых членистоногими болезней, т.е. болезней, вызываемых множеством патогенов или штаммов патогенов. Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение вакцины против распространяемых членистоногими болезней, используя полипептидные композиции настоящего изобретения.

Соответственно, настоящим изобретением обеспечивается полипептидная композиция, включающая один или несколько полипептидов, которые являются иммуногенными у позвоночного, так что они вызывают у позвоночного продукцию клеток иммунной системы (или активируют продукцию таких клеток), способных к распознаванию по меньшей мере одного эпитопа в белковой фракции слюны членистоногих, причем белковая фракция слюны членистоногих имеет массу, составляющую 40 кДа или меньше, а полипептиды независимо выбирают из:

(а) последовательностей полипептидов SEQ ID NO:1-44 или имеющих 7 аминокислот или более подпоследовательностей из этих последовательностей:

SEQ ID NO:1 HLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPP

SEQ ID NO:2 PLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCL

SEQ ID NO:3 KNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEI

SEQ ID NO:4 KLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGV

SEQ ID NO:5 FLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCL

SEQ ID NO:6 NDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKA

SEQ ID NO:7 FYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPL

SEQ ID NO:8 MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAA

SEQ ID NO:9 DGASAITKIVLELTPEQAAAV

SEQ ID NO:10 TLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILA

SEQ ID NO:11 GRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGK

SEQ ID NO:12 LYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTL

SEQ ID NO:13 MYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD

SEQ ID NO:14 NAEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKR

SEQ ID NO:15 ALIGLLLCSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRL

SEQ ID NO:16 SKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPT

SEQ ID NO:17 SMLVAFATLSVALVVVVAIPANFNYGGGGGYFINGTGQ

SEQ ID NO:18 IYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQ

SEQ ID NO:19 EMKLAKVALVTISLWFMAWTPYLVINFTGI

SEQ ID NO:20 LLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLV

SEQ ID NO:21 FYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAG

SEQ ID NO:22 VLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGD

SEQ ID NO:23 KLTPTVVVVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATT

SEQ ID NO:24 SLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEV

SEQ ID NO:25 TYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLI

SEQ ID NO:26 RYFVVIALICPLIIVETLAV

SEQ ID NO:27 LLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFV

SEQ ID NO:28 VLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMP

SEQ ID NO:29 VLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYM

SEQ ID NO:30 VLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMVVRMLKFVRLLP

SEQ ID NO:31 RVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHET

SEQ ID NO:32 ELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKI

SEQ ID NO:33 KFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFFQYNRPYL

SEQ ID NO:34 NYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIVVQL

SEQ ID NO:35 QYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQC

SEQ ID NO:36 EYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKL

SEQ ID NO:37 KLFLTLLSTLSVAMVFALPAHHHSRG

SEQ ID NO:38 ELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAV

SEQ ID NO:39 SYFLTVCLLALVQSETVQD

SEQ ID NO:40 AMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSS

SEQ ID NO:41 SFAWLLYGIILRSNFLVVQNLMALALSAVQLSLFII

SEQ ID NO:42 AFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSAL

SEQ ID NO:43 GLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIR

SEQ ID NO:44 LLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVW

(b) последовательностей, ограниченных следующими аминокислотными остатками белка слюны членистоногих или имеющих 7 аминокислот или более подпоследовательностей из этих последовательностей:

остатками 2-33 >gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1 гипотетического белка 16 [Anopheles gambiae]

остатками 2-26 >gi|18389909|gb|AAL68791.1|AF457561_1 гипотетического белка 14 [Anopheles gambiae]

остатками 2-25 >gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1 гипотетического белка 13 [Anopheles gambiae]

остатками 10-36 >gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1 гипотетического белка 11 [Anopheles gambiae]

остатками 2-26 >gi|62546227|gb|AAX86005.1|hyp3.5-предшественника [Anopheles gambiae]

остатками 14-42 gi|18389899|gb|AAL68786.1|AF457556_1 7-подобного белка слюнных желез [Anopheles gambiae]

остатками 3-33 >gi|18389911|gb|AAL68792.1|AF457562_1 гипотетического белка 15 [Anopheles gambiae]

остатками 1-30 >gi|62546225|gb|AAX86004.1|hyp6.3- предшественника [Anopheles gambiae]

остатками 34-54 >gi|62546225|gb|AAX86004.1|hyp6.3- предшественника [Anopheles gambiae]

остатками 38-70 >gi|17026153|emb|CAD12038.1|Sec61-белка [Anopheles gambiae]

остатками 2-23 >gi|62546223|gb|AAX86003.1|hyp6.2- предшественника [Anopheles gambiae]

остатками 17-54 >gi|18389915|gb|AAL68794.1|AF457564_1 гипотетического белка 17 [Anopheles gambiae]

остатками 57-93 >gi|87080391|gb|ABD18596.1|дефенсина [Anopheles gambiae]

остатками 22-57 >gi|18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1 гипотетического белка 10 [Anopheles gambiae]

остатками 7-43 >gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1 гипотетического белка 12 [Anopheles gambiae]

остатками 3-32 >gi|4127344|emb|CAA76832.1|cE5-белка [Anopheles gambiae]

остатками 3-40 >gi|4210617|emb|CAA10259.1|SG2-белка [Anopheles gambiae]

остатками 91-121 >gi|4127309|emb|CAA76820.1|гипотетического белка [Anopheles gambiae]

остатками 65-94 >gi|4375824|emb|CAA76825.1|опсина [Anopheles gambiae]

остатками 41-71 >gi|62546233|gb|AAX86008.1|неизвестного белка [Anopheles gambiae]

остатками 117-143 >gi|3378531|emb|CAA03872.1|D7r2-белка [Anopheles gambiae]

остатками 63-93 >gi|3378529|emb|CAA03871.1|D7r3-белка [Anopheles gambiae]

остатками 23-67 >gi|18389893|gb|AAL68783.1|AF457553_1 муциноподобного белка [Anopheles gambiae]

остатками 43-80 >gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1 селенопротеина [Anopheles gambiae]

остатками 6-42 >gi|18389879|gb|AAL68776.1|AF457546_1 белка с М.м. 30 кДа [Anopheles gambiae]

остатками 4-23 >gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 D7-родственного белка 5 [Anopheles gambiae]

остатками 20-55 >gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1 1-подобного белка 4 слюнных желез [Anopheles gambiae]

остатками 59-95 >gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548_1 антигена - 5-родственного белка 1 [Anopheles gambiae]

остатками 158-184 >gi|83016748|dbj|BAE53441.1|DsRed [синтетической конструкции]

остатками 37-76 >gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1 1-подобного белка 3 слюнных желез [Anopheles gambiae]

остатками 191-222 >gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1 1-подобного белка 3 слюнных желез [Anopheles gambiae]

остатками 113-149 >gi|18389891|gb|AAL68782.1|AF457552_1 длинной формы D7-белка [Anopheles gambiae]

остатками 1-37 >emb|CAC35527.1|gSG9-белка [Anopheles gambiae]

остатками 81-120 >sp|Q9U9L1|RS17_ANOGA белка S17 40S-субъединицы рибосомы

остатками 111-142 >emb|CAC35523.1|gSG7 белка [Anopheles gambiae]

остатками 32-67 >gb|AAD47075.1|AF164151_1 фактора 4С (1А) инициации трансляции [Anopheles gambiae]

остатками 1-29 >emb|CAC35519.1|gSG2-подобного белка [Anopheles gambiae]

остатками 106-142 >emb|CAC35451.1|гипотетического белка [Anopheles gambiae]

остатками 6-28 >emb|CAC35524.1|D7r4-белка [Anopheles gambiae]

остатками 70-104 >ref|XP_001230998.1|ENSANGP00000014906 [Anopheles gambiae штамм PEST]

остатками 174-213 >ref|XP_316361.2|ENSANGP00000012984 [Anopheles gambiae штамм PEST]

остатками 41-80 >ref|XP_314140.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae штамм PEST]

остатками 126-153 >ref|XP_314140.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae штамм PEST]

остатками 5-34 >emb|CAC35522.1|gSG6-белка [Anopheles gambiae]

(c) и из последовательностей полипептидов, которые гомологичны на 85% или более одной или нескольким последовательностям (а) или (b) и содержатся в одной или нескольких следующих базах данных: GeneBank, Банке данных по структуре белка (PDB), SwissProt, Информационном белковом ресурсе (PIR), Фонде по исследованию белков (PRF) или трансляциях кодирующих последовательностей (CDS) из этих баз данных.

CDS является сокращением для «кодирующей последовательности», т.е. области нуклеотидов, которая соответствует последовательности аминокислот в предсказанном белке. CDS включает инициирующий кодон и стоп-кодон, следовательно, кодирующие последовательности начинаются с «ATG» и заканчиваются стоп-кодоном. Неэкспрессируемые последовательности, включающие 5'-UTR, 3'-UTR, интроны или основания, не экспрессируемые вследствие сдвига рамки считывания, не включены в CDS. Обратите внимание, что CDS не соответствует фактически существующей последовательности мРНК. В результате, трансляцией CDS является белок, который мог бы быть получен, если бы были транслированы все кодоны между инициирующим кодоном и стоп-кодоном.

PDB означает Банк данных по структуре белка. Эта база данных (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) поддерживается Коллаборацией по изучению структурной биоинформатики (RCSB), не извлекающий прибыль консорциум, специализирующийся на улучшении понимания функционирования биологических систем через изучение трехмерной структуры биологических макромолекул.

Информационный белковый ресурс (PIR) (http://pir.georgetown.edu/) является интегральным общим биоинформационным ресурсом, созданным в 1984 Национальным фондом биомедицинских исследований (NBRF) в качестве ресурса, помогающего исследователям идентифицировать и интерпретировать информацию о последовательности белка (Wu C.H., Yeh L.S., Huang G., Arminski L., Castro-Alvear J., Chen Y., Hu Z., Kourtesis P., Ledley R.S., Suzek B.E., Garrett L., Vinayaka C.R., Zhang J., Backer W.C. (2003) последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737 The Protein Information Resource , Nucleic Acids Res. 31(1): 345-7).

PRF является оперативной базой данных, поддерживаемой Фондом по исследованию белков (PRF) (http://www.prf.or.jp/en/index.shtml). База данных содержит информацию, относящуюся к аминокислотам, пептидам и белкам, собранную из научных журналов, данные по последовательностям пептидов и белков, данные по синтетическим соединениям и молекулярным аспектам белков.

GenBank является базой данных по последовательностям генов NIH (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), снабженной комментариями коллекцией всех общедоступных последовательностей ДНК. Новая версия создается каждые два месяца. GenBank является частью Международной коллаборации по созданию базы данных, касающихся нуклеотидных последовательностей, которая состоит из Банка данных по ДНК Японии (DDBJ), Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) и GenBank при Национальном центре биотехнологической информации.

Swissprot (также называемая UniProtKB/Swiss-Prot) является курируемой базой данных по последовательностям белков (http://expasy.org/sprot), поддерживаемой Институтом биоинформатики Швейцарии (SIB). База данных стремится предоставить на высоком уровне комментарии (такие, как описание функции белка, его доменная структура, посттрансляционные модификации, варианты и т.п.), обеспечить дублирование на минимальном уровне и интеграцию с другими базами данных на высоком уровне.

Эти базы данных обновляются еженедельно или ежемесячно, и указанные выше последовательности распространяются на последовательности в базах данных в момент подачи этой заявки. При отыскании в базах данных последовательностей, имеющих требуемую степень гомологии, можно использовать любой способ, в зависимости от критериев соответствия. Однако предпочтительно может быть использована программа BLASTP [BLAST и являющиеся ее производными программы (например, BLASTP) являются бесплатным программным обеспечением].

В другом варианте осуществления вместо упоминаемой выше в части (с) гомологии на 85% (или дополнительно к ней) также включены последовательности полипептидов в составе указанных выше баз данных, которые имеют по крайней 85% аминокислот, являющихся общими (на основании как идентичности аминокислот, так и положения в последовательности) с аминокислотами части последовательности в (а) или (b), длина которой составляет 8 аминокислот или более и предпочтительно от 8 аминокислот вплоть до одной трети длины последовательности в (а) или (b). Другими словами, для последовательности в (а) или (b), длина которой составляет 30 аминокислот, также включена последовательность базы данных, если она разделяет 85% или более своих аминокислот с любой частью последовательности в (а) или (b), имеющей длину 8 аминокислот или больше, предпочтительно 8-10 аминокислот. Аналогично, если длина последовательности в (а) или (b) составляет 60 аминокислот, также включена последовательность базы данных, если она разделяет 85% или более своих аминокислот с любой частью последовательности в (а) или (b), имеющей длину 8 аминокислот или больше, предпочтительно 8-20 аминокислот. Соответствие аминокислот необязательно является последовательным. Например, в случае последовательности длиной 20 аминокислот в (а) или (b), если соответствующая последовательность базы данных разделяет 17 или более аминокислот в соответствующих положениях, ее включают, даже если не все эти положения являются последовательными.

Как правило, полипептиды в композиции не являются полноразмерными (или целыми) белками слюны членистоногих. Под полноразмерными (или целыми) подразумевается, что полипептиды действительно содержат все аминокислотные остатки, присутствующие в любом из встречающихся в природе белков слюны членистоногих.

Таким образом, полипептидом является полипептид, который может включать любую из указанных выше последовательностей целиком (или может включать части любой из указанных выше последовательностей длиной по меньшей мере 7 или более остатков). Полипептид должен быть также иммуногенным у позвоночного. Обычно эта иммуногенность такова, что полипептиды вызывают у позвоночного продукцию клеток иммунной системы, способных к распознанию по меньшей мере одного эпитопа в белковой фракции слюны членистоногих. Следовательно, если полипептид индуцирует Т-клеточный или В-клеточный ответ, он является иммуногенным у позвоночного. В альтернативном случае полипептид может быть эпитопом Т-лимфоцита-хелпера (Th) или может быть эпитопом В-лимфоцита.

Один способ определения того, обладает ли полипептид иммуногенностью, представлен ниже в эксперименте 2. Однако настоящее изобретение не ограничивается такими способами, и квалифицированный специалист может выбрать любой известный способ определения иммуногенности, по желанию.

Особенно предпочтительно, когда полипептиды полипептидной композиции независимо выбирают из SEQ ID NO:1-6, 20, 28, 30-32 и 35 или имеющих 7 аминокислот или более подпоследовательностей из этих последовательностей или последовательностей полипептидов, которые гомологичны на 85% или более одной из этих последовательностей и содержатся в одной или нескольких следующих базах данных: GeneBank, Банке данных по структуре белка (PDB), SwissProt, Информационном белковом ресурсе (PIR), Фонде по исследованию белков (PRF) или трансляциях кодирующих последовательностей (CDS) из этих баз данных.

Обычно, но не исключительно, полипептидная композиция настоящего изобретения включает 2 или более полипептидов, предпочтительно от 2 до 10 полипептидов или более предпочтительно 2-6 полипептидов. Однако композиция может включать один полипептид и дополнительные не являющиеся полипептидами компоненты, если желательно.

Как правило, в полипептидной композиции в соответствии с настоящим изобретением белковая фракция слюны членистоногих имеет массу, составляющую 40 кДа или меньше, 30 кДа или меньше или более предпочтительно 20 кДа или меньше. Фракция может также иметь массу, составляющую 20-40 кДа, 20-30 кДа или 10-20 кДа.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения полипептидная композиция настоящего изобретения включает SEQ ID NO:131 или включает одну или несколько подпоследовательностей SEQ ID NO:131, имеющих 7 аминокислот или более, или включает последовательности полипептидов, которые гомологичны на 85% или более одной из этих последовательностей и содержатся в одной или нескольких следующих базах данных: GeneBank, Банке данных по структуре белка (PDB), SwissProt, Информационном белковом ресурсе (PIR), Фонде по исследованию белков (PRF) или трансляциях кодирующих последовательностей (CDS) из этих баз данных.

SEQ ID NO:131

FLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCLFYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPLMKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAAGRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGKLYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTLALIGLLLCSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRLSKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPTLLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLVRYFVVIALICPLIIVETLAVVLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMPVLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMVVRMLKFVRLLPRVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHETELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKIQYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQCSFAWLLYGIILRSNFLVVQNLMALALSAVQLSLFIIAFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSAL

В другом варианте осуществления настоящего изобретения полипептидная композиция настоящего изобретения включает одну или несколько последовательностей, выбираемых из SEQ ID NO:1-4, 6, 9, 10, 13, 14, 17-19, 21-25, 27, 29, 33, 34, 36-40, 43 и 44, или включает одну или несколько имеющих 7 аминокислот или более аминокислот подпоследовательностей этих последовательностей или включает последовательности полипептидов, которые гомологичны на 85% или более одной из этих последовательностей и содержатся в одной или нескольких следующих базах данных: GeneBank, Банке данных по структуре белка (PDB), SwissProt, Информационном белковом ресурсе (PIR), Фонде по исследованию белков (PRF) или трансляциях кодирующих последовательностей (CDS) из этих баз данных.

В дальнейшем варианте осуществления полипептидная композиция настоящего изобретения включает SEQ ID NO:132 или включает одну или несколько подпоследовательностей SEQ ID NO:132, имеющих 7 аминокислот или более, или включает последовательности полипептидов, которые гомологичны на 85% или более одной из этих последовательностей и содержатся в одной или нескольких следующих базах данных: GeneBank, Банке данных по структуре белка (PDB), SwissProt, Информационном белковом ресурсе (PIR), Фонде по исследованию белков (PRF) или трансляциях кодирующих последовательностей (CDS) из этих баз данных.

SEQ ID NO:132

HLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPPPLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCLKNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEIKLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGVNDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKADGASAITKIVLELTPEQAAAVTLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILAMYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKDNAEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKRSMLVAFATLSVALVVVVAIPANFNYGGGGGYFINGTGQIYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQEMKLAKVALVTISLWFMAWTPYLVINFTGIFYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAGVLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGDKLTPTVVVVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATTSLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEVTYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLILLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFVVLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMKFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFFQYNRPYLNYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIVVQLEYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKLKLFLTLLSTLSVAMVFALPAHHHSRGELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAVSYFLTVCLLALVQSETVQDAMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSSGLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIRLLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVW

Во все еще дальнейшем варианте осуществления полипептидная композиция настоящего изобретения включает SEQ ID NO:133 или включает одну или несколько подпоследовательностей SEQ ID NO:133, имеющих 7 аминокислот или более, или включает последовательности полипептидов, которые гомологичны на 85% или более одной из этих последовательностей и содержатся в одной или нескольких следующих базах данных: GeneBank, Банке данных по структуре белка (PDB), SwissProt, Информационном белковом ресурсе (PIR), Фонде по исследованию белков (PRF) или трансляциях кодирующих последовательностей (CDS) из этих баз данных.

SEQ ID NO:133

HLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPPPLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCLKNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEIKLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGVFLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCLNDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKA

Во все еще дальнейшем варианте осуществления полипептидная композиция настоящего изобретения включает SEQ ID NO:134 или включает одну или несколько подпоследовательностей SEQ ID NO:134, имеющих 7 аминокислот или более, или включает последовательности полипептидов, которые гомологичны на 85% или более одной из этих последовательностей и содержатся в одной или нескольких следующих базах данных: GeneBank, Банке данных по структуре белка (PDB), SwissProt, Информационном белковом ресурсе (PIR), Фонде по исследованию белков (PRF) или трансляциях кодирующих последовательностей (CDS) из этих баз данных.

SEQ ID NO:134

LLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLVVLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMPVLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMVVRMLKFVRLLPRVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHETELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKIQYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQC

Важно, что во всех вариантах осуществления настоящего изобретения может использоваться, или отдельно, или в комбинации, любая комбинация перечисленных последовательностей. Особенно предпочтительными полипептидами являются полипептиды, имеющие последовательности SEQ ID NO:1-6, и/или последовательности, имеющие последовательности SEQ ID NO:20, 28, 30-32 и 35. Особенно предпочтительно, когда присутствует любая одна или несколько этих последовательностей, и особенно предпочтительно, когда присутствуют все из SEQ ID NO:1-6 и/или все из SEQ ID NO:20, 28, 30-32 и 35.

Авторы настоящего изобретения установили, что указанные выше последовательности включают эпитоп или множество эпитопов, которые могут предоставить защиту от распространяемых членистоногими болезней для широкого ряда позвоночных в популяции. Укусы членистоногих вызывают у хозяина иммунный ответ на компоненты слюны, который характеризуется фенотипом Th2 (т.е. ингибированием продукции IFN- последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737 и активацией продукции IL-4) (Mbow et al., 1998). Установлено, что этот иммунный ответ, вместе с антигемостатическим эффектом многих из этих молекул слюны, способствует передаче паразитов и усиливает ее в общем (Dhar and Kumar, 2003) и, в частности, содействует инфицированию Leishmania (Kamhawi et al., 2000). Установлено, что, напротив, усиление клеточного иммунного ответа, характеризующегося увеличенной продукцией IFN- последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737 и IL-12, оба из которых являются цитокинами типа Th1, в месте инфицирования (т.е. в месте укуса) вызывает защиту от инфицирования Leishmania major при укусе инфицированными песчаными москитами (Kamhawi et al., 2000).

Без ограничения какой-либо теорией полагают, что иммунизация белками слюны, приводящая к активации ответа типа Th1, будет приводить к быстрому распознаванию антигенов слюны в месте укуса клетками иммунной системы (такими, как активированные цитотоксические Т-клетки (CTL) и Т-клетки-хелперы типа 1) и продукции IFN- последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737 . Этот цитокин (1) стимулирует большую продукцию IFN- как Т-, так и NK-клетками, (2) усиливает бактерицидную активность макрофагов, (3) индуцирует переключение изотипа на IgG2a и увеличенную продукцию IgG2a В-клетками и (4) продукцию множества цитокинов (например, TNF- последовательности пептидов и пептидные композиции, патент № 2466737 , интерлейкина (IL)-12 и IL-18), которые совместно запускают каскад иммунных реакций, которые приводят к гибели внутриклеточных паразитов. Ниже представлены ссылки, в которых это детализируется.

Mbow M.L., Bleyenberg J.A., Hall L.R. & Titus R.G. 1998. Phlebotomus papatasi sandfly salivary gland lysate down-regulates a Th1, but up-regulates a Th2, response in mice infected with Leishmania major, J. Immunol., 161; 5571-5577.

Dhar R., Kumar N. 2003. Role of mosquito salivary glands. Cur. Sci., 85, 1308-1313.

Kamhawi S., Belkaid Y., Modi G., Rowton E., Sacks D., 2000. Protection against cutaneous leishmaniasis resulting from bites of uninfected sand flies. Science 290, 1351-1354.

Malaguarnera L., Musumeci S. 2002. The immune response to Plasmodium falciparum malaria, Lancet Infect. Dis. Aug; 2(8): 472-8.

Как обсуждалось выше, указанные выше последовательности были идентифицированы после анализа последовательностей слюны Anopheles gambiae. Для квалифицированного специалиста будет очевидно, что настоящее изобретение распространяется не только на эти последовательности и их эпитопы, но также на большие последовательности в белках слюны членистоногих, содержащих эти последовательности, и на последовательности, которые гомологичны этим последовательностям, а значит, обладают иммуногенной активностью. Таким образом, в объеме настоящего изобретения также находятся последовательности, гомологичные в некоторой степени консенсусным последовательностям. Такая гомология допускает замену, например, вплоть до 3 аминокислот в 8-мерном эпитопе (гомология на 62,5%) или в 9-мерном, 10-мерном или 11-мерном эпитопе. Предпочтительно, когда не более 10 таких замен идентифицируются в последовательности настоящего изобретения, соответствующей полноразмерным последовательностям SEQ ID NO:1-44 (гомология на 66,6% для 30-мера). Предпочтительно такие замены являются консервативными заменами в соответствии с известными схемами замен.

Настоящим изобретением также обеспечивается полипептид, содержащий одну или более последовательностей, определяемых следующими последовательностями SEQ ID NO:1-44 или ограниченных следующими аминокислотными остатками белка слюны членистоногих, или содержащих одну или более имеющих 7 аминокислот или более подпоследовательностей из этих последовательностей, или содержащий последовательности полипептидов, которые гомологичны на 85% или более одной из этих последовательностей и содержатся в одной или нескольких следующих базах данных: GeneBank, Банке данных по структуре белка (PDB), SwissProt, Информационном белковом ресурсе (PIR), Фонде по исследованию белков (PRF) или трансляциях кодирующих последовательностей (CDS) из этих баз данных.