способ инактивирования патогенов в донорской крови, плазме крови или концентратах эритроцитов в гибких контейнерах с помощью встряхивания

Формула изобретения

1. Способ инактивации патогенных микроорганизмов в донорской крови, плазме крови и/или концентратах эритроцитов, включающий в себя следующие этапы:

получение одного или множества из следующих препаратов: донорских порций крови, продуктов, полученных из донорской крови, продуктов, полученных посредством машинного афереза;

(а) добавление подходящего фотоактивного вещества и фотодинамическая обработка посредством облучения светом, содержащим или исключительно состоящим из длин волн в области поглощения фотоактивного вещества, и/или

(б) облучение препаратов ультрафиолетовым (УФ-) излучением с длинами волн в диапазоне от 200 до 320 нм,

при этом препараты состоят из многих доз, которые могут использоваться индивидуально и храниться отдельно; и

при этом препараты находятся, соответственно, в гибких, проницаемых для видимого света плоских пакетах для облучения, когда проводится фотодинамическая обработка посредством облучения светом, содержащим или исключительно состоящим из длин волн в области поглощения фотоактивного вещества, или гибких проницаемых для УФ-излучения плоских пакетах для облучения, когда обработка проводится посредством облучения УФ-излучением,

при этом пакеты для облучения заполнены менее чем на 30% от максимальной емкости пакета для облучения, и

пакеты для облучения во время фотодинамической обработки и/или облучения УФ-излучением встряхивают таким образом, что содержимое пакета для облучения перемешивается, и благодаря встряхиванию образуются зоны с переменной толщиной слоев, и эти зоны имеют области, которые время от времени, но достаточно регулярно имеют толщину слоя менее 1 мм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что патогенными микроорганизмами являются вирусы и/или бактерии.

3. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что во время встряхивания зоны имеют области, которые время от времени, но достаточно регулярно имеют толщину слоя менее 0,05 мм.

4. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что встряхивание, в особенности - амплитуду встряхивания, выбирают таким образом, что внутри препарата образуются области, которые время от времени, но достаточно регулярно имеют толщину слоя менее 0,05 мм.

5. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что сумма площадей нижней и верхней сторон пакета для облучения, которые контактируют или могут контактировать с содержимым пакета, составляет более 90%, предпочтительно - более 99%, от общей площади внутренней поверхности содержимого пакета.

6. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что в случае формы осуществления (б) облучение осуществляют излучением УФ-В диапазона с длиной волны от менее чем 320 нм до 280 нм и/или УФ-С диапазона с длиной волны от менее чем 280 нм до 200 нм, в частности излучением УФ-С диапазона с длиной волны от менее чем 260 нм до 220 нм, или излучение включает в себя этот диапазон, а предпочтительно состоит исключительно из излучения с длинами волн указанных выше диапазонов.

7. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что каждая доза происходит от 1-6 доноров, предпочтительно - от одного донора.

8. Способ по меньшей мере по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что облучение осуществляют УФ-В излучением с энергией излучения в диапазоне от 0,3 до 10 Дж/см², предпочтительно - в диапазоне от 0,5 до 5 Дж/см².

9. Способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что облучение осуществляют УФ-С излучением с энергией излучения в диапазоне от 0,01 до 5 Дж/см², предпочтительно - в диапазоне от 0,1 до 2 Дж/см².

10. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что пакеты для облучения имеют объем до 5000 мл.

11. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что пакеты для облучения подвижно закреплены в аппаратуре, в которой они встряхиваются и облучаются, в частности они не зажаты между двумя плоскостями.

12. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что во время как минимум трех четвертей всего времени облучения, более предпочтительно - во время, по меньшей мере, пяти шестых всего времени облучения, пакеты для облучения встряхиваются.

13. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что пакеты для облучения встряхивают посредством качания, раскачивания или вращения.

14. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что продукты крови представляют собой плазму и более чем на 80% по массе состоят из плазмы крови.

15. Способ по одному из пп.1-13, отличающийся тем, что продукты крови представляют собой концентраты эритроцитов и имеют гематокрит от 10 до 75 вес.%, предпочтительно - от 20 до 60 вес.%.

16. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что фотоактивное вещество представляет собой один или более фенотиазиновых красителей, более конкретно - тионин, метиленовый синий, толуидиновый синий и/или азуровые красители А, В и С.

17. Способ по одному из пп.1-15, отличающийся тем, что фотоактивное вещество представляет собой одно или более фталоцианиновых соединений.

18. Способ по одному из пп.1-15, отличающийся тем, что фотоактивное вещество представляет собой одно или более порфириновых соединений.

19. Способ по одному из пп.16-18, отличающийся тем, что фотодинамическая обработка производится исключительно с использованием длин волн в области поглощения (±20 нм) использованного фотосенсибилизатора (или использованных фотосенсибилизаторов).

20. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что пакет для облучения заполняют максимум на 15% от максимальной емкости заполнения.

21. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что плазму крови обрабатывают согласно этапу (а) и в отсутствие фотосенсибилизатора (или фотосенсибилизаторов).

22. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что встряхивание осуществляют с помощью орбитального шейкера, платформенного шейкера, вертикально качающегося шейкера или шейкера, качающегося в горизонтальной плоскости.

23. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что пакеты для облучения укладывают на одну из боковых сторон, так что во время и в результате встряхивания высота пакетов для облучения, выражаемая как расстояние вдоль перпендикуляра к поверхностям между поверхностью, на которую уложены пакеты для облучения, и наивысшей точкой пересечения с верхней поверхностью пакета для облучения по всей верхней поверхности пакета для облучения, постоянно изменяется.

24. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что пакеты для облучения имеют среднюю высоту наполнения менее 5 мм, и в результате встряхивания в них постоянно возникают волны с впадинами, где толщина слоя составляет менее половины от средней высоты наполнения, предпочтительно - толщина слоя составляет менее 1 мм или даже менее 0,05 мм.

25. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что пакеты для облучения во время облучения постоянно встряхиваются с амплитудой более 0,2 мм, предпочтительно более 1 см и особо предпочтительно от 1 до 15 см или от 2 до 8 см как минимум по оси «х» и возможно по оси «у» (ось «у» перпендикулярна оси «х»), и независимо от этого частота изменения направления встряхивания превышает 0,5 Гц, предпочтительно - составляет от 1 до 10 Гц.

26. Способ инактивации патогенных микроорганизмов в донорской крови, плазме крови и/или концентратах эритроцитов, включающий в себя следующие этапы:

получение одного или множества из следующих препаратов: донорских порций крови, продуктов, полученных из донорской крови, продуктов, полученных посредством машинного афереза;

облучение препаратов ультрафиолетовым (УФ-) излучением, которое состоит или включает излучение УФ-В диапазона с длиной волны от менее чем 320 нм до 280 нм с энергией излучения в диапазоне от 0,3 до 10 Дж/см² и/или УФ-С диапазона с длиной волны от менее чем 280 нм до 200 нм,

при этом препараты состоят из многих доз, которые могут использоваться индивидуально и храниться отдельно; и

при этом препараты находятся в гибких, проницаемых для УФ-излучения плоских пактах для облучения,

при этом пакеты для облучения заполнены менее чем на 30% or максимальной емкости пакета для облучения, и

пакеты для облучения во время облучения УФ-излучением встряхивают таким образом, что содержимое пакета для облучения перемешивается, и благодаря встряхиванию образуются зоны с переменной толщиной слоев.

Описание изобретения к патенту

Предметом изобретения является способ инактивации патогенных микроорганизмов, таких как бактерии и вирусы, в донорской крови (кровь), плазме крови (плазма) и/или концентратах эритроцитов (КЭ) посредством фотодинамической обработки и/или облучения ультрафиолетовым излучением.

Известно, что терапевтическое применение продуктов крови таит в себе риск того, что реципиенты будут инфицированы вирусами и бактериями. Можно назвать, например, вирусы гепатита В (HBV) и гепатита С (HCV), а также возбудители СПИДа ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Риск возникает в том случае, если при приготовлении соответствующих продуктов не проводится этап инактивации или устранения патогенных микроорганизмов.

Предпринималось и предпринимается много попыток обеззараживать продукты крови с использованием фотодинамических способов. Принцип состоит в том, что соответствующий продукт облучают в присутствии фотоактивного вещества (фотосенсибилизатора). Свет, используемый для облучения, должен содержать диапазон длин волн, который поглощается фотосенсибилизатором и который может активировать фотосенсибилизатор. Поглощенная энергия или непосредственно передается соответствующей целевой структуре (например, нуклеиновой кислоте или поверхностному белку вируса), которая за счет этого разрушается, или передается растворенным молекулам кислорода, которые за счет этого активируются. Возникает синглетный кислород, который обладает выраженной вируцидной и бактерицидной активностью.

В идеале используемый фотосенсибилизатор должен обладать высоким сродством к важнейшим составным частям вирусов и других патогенных микроорганизмов, например к их нуклеиновым кислотам, но обладать малым сродством или вообще не обладать сродством к составным частям препарата, подлежащего обеззараживанию. В этом случае в результате фотодинамической обработки инактивируются патогенные микроорганизмы, тогда как активность продукта сохраняется. В качестве подходящего фотосенсибилизатора для обработки плазмы описан, например, фенотиазиновый краситель метиленовый синий; для обеззараживания концентратов тромбоцитов используют рибофлавин (витамин В2), а для обеззараживания КЭ опробованы фталоцианины. Тем не менее, способы фотодинамической инактивации патогенных микроорганизмов в КЭ до сих пор еще используются только в лабораторном масштабе.

Это в еще большей степени относится к цельной крови. Причину этого можно искать в том, что подаваемое излучение должно иметь определенную интенсивность для того, чтобы инактивировать используемый фотосенсибилизатор, а кровь и КЭ обладают лишь очень ограниченной способностью пропускать свет каждой длины волны. Проблема, естественно, существует и в случае плазмы, хотя и не в той же степени.

Также известно, что патогенные микроорганизмы также можно инактивировать посредством облучения коротковолновым ультрафиолетовым (УФ-) излучением, то есть излучением в диапазоне длин волн от 200 до 320 нм, более конкретно от 200 до 300 нм (УФ-В и УФ-С диапазоны). При длине волны более 320 нм энергия излучения слишком мала для того, чтобы инактивировать микроорганизмы и вирусы. По сравнению с химическими, фотохимическими и фотодинамическими способами инактивации патогенных организмов облучение УФ-излучением обладает, прежде всего, тем преимуществом, что оно эффективно само по себе и не требует добавления химически активных или фотоактивных веществ.

Наиболее эффективным в отношении прямой инактивации патогенных организмов является УФ-С диапазон. Тем не менее, он обладает недостатком, состоящим в том, что он проникает в растворы, содержащие белки, такие как плазма крови, или в мутные суспензии (например, КТ) лишь на очень небольшую глубину. Во время второй мировой войны и в течение непродолжительного времени после нее УФ-С излучение использовали для стерилизации плазмы крови и растворов альбуминов, прежде всего - с целью инактивации вирусов гепатита. Тогда использовали способ, при котором раствор в проточной аппаратуре пропускали перед источником УФ-С излучения в виде тонкой пленки. Способ показал себя как недостаточно безопасный, и от него отказались (Kallenbach N.R., Cornelius P.A., Negus D. et al. Inactivation of viruses by ultraviolet light. Curr Stud Hematol Blood Transfus 1989, 56, 70-82).

В настоящее время для стерилизации терапевтических продуктов в виде белков плазмы используют усовершенствованные способы, работающие по тому же принципу. Во всех случаях речь шла или идет об обработке больших объемов, то есть пулов плазмы или растворов белков объемом до нескольких сотен литров и более (Hart H., Reid К., Hart W. Inactivation of viruses during ultraviolet light treatment of human intravenous immunoglobulin and albumin. Vox Sang 1993; 64(2): 82-8; и Chin S., Williams В., Gottlieb P. et al. Virucidal short wavelength ultraviolet light treatment of plasma and factor VIII concentrate: protection of proteins by antioxidants; Blood 1995; 86(11): 4331-4336).

Для стерилизации множества отдельных доз донорской крови, плазмы или КЭ с объемами до нескольких сотен мл вышеуказанные проточные аппараты непригодны. Однако именно это необходимо в повседневной практике банков крови.

УФ-В излучение также является микробиоцидным и вируцидным, но не в такой степени, как УФ-С. Оно проникает в белоксодержащие растворы и мутные суспензии немного лучше, чем УФ-С, тем не менее, глубина его проникновения, например, в плазму также остается в пределах нескольких миллиметров.

Плазму и КЭ обычно выделяют из отдельных донорских порций крови или получают посредством машинного афереза от дельных доноров. Объем препаратов обычно лежит в диапазоне от примерно 200 до 350 мл. Объем донорских порций крови обычно лежит в диапазоне от 450 до 500 мл. Препараты, находящиеся в плоских пластиковых пакетах, обычно подвергают глубокой заморозке (плазма) или хранят при температуре, примерно равной 4°С (донорские порции крови, КЭ).

Было бы желательно стерилизовать вышеуказанные препараты, находящиеся в таких пакетах. Однако при этом сохраняется вышеупомянутая проблема, состоящая в том, что препараты почти непроницаемы для УФ-излучения, а кровь и КЭ непроницаемы также для видимого света.

Неожиданно было обнаружено, что вышеуказанная проблема решается посредством использования способа согласно п.1 формулы изобретения. Предпочтительные формы осуществления являются предметом зависимых пунктов формулы изобретения или описаны ниже.

Согласно настоящему изобретению препараты, то есть донорскую кровь (кровь), плазму крови (плазму) и/или концентраты эритроцитов (КЭ), находящиеся в пакетах для облучения, встряхивают подходящим способом, так что в пакете происходит постоянное перемешивание проб. Встряхивание происходит настолько интенсивно, что внутри жидкости или суспензии образуются локальные слои, настолько тонкие, что через них может проникать используемое излучение. При этом встряхивание должно быть таким, чтобы жидкость или суспензия эффективно перемешивалась в пакете. Оба этих условия можно осуществить при наличии следующих предпосылок:

1. Пакеты для облучения являются очень гибкими, и во время облучения их не фиксируют, например не зажимают, между стеклянными или кварцевыми пластинками. Поэтому они приспосабливаются к любому изменению формы плазмы или суспензии (крови, КЭ), которое происходит во время встряхивания пакета.

2. Пакеты для облучения заполнены не более чем на 30%, предпочтительно не более чем на 15%, от максимального объема заполнения.

3. Пакеты встряхивают энергично, например либо по горизонтали (линейно возвратно-поступательно, по круговой или эллипсоидальной траектории), либо по вертикали (раскачивание).

Под энергичным встряхиванием в данном случае (по отдельности или совместно) необходимо понимать следующее:

1. Оно является более интенсивным, чем встряхивание, которое обеспечивает только перемешивание жидкостей или суспензий.

2. Внутри жидкостей или суспензий, которые энергично встряхиваются, по меньшей мере, время от времени в различных местах образуются области, которые являются настолько тонкими, что могут пропускать УФ-излучение или видимый свет (последнее относится к мутным или окрашенным жидкостям или суспензиям, например к КЭ).

3. Изменение направления встряхивания при энергичном встряхивании происходит настолько резко, что большая часть препарата, находящегося в пакете для облучения, вследствие своей инерции продолжает двигаться дальше в первоначальном направлении, а отставшая часть может образовать тонкий слой, проницаемый для используемого излучения.

В сочетании с постоянным перемешиванием, происходящим одновременно, в конечном итоге весь препарат (и содержащиеся в нем патогенные микроорганизмы) подвергается воздействию излучения, и за счет этого он стерилизуется.

Пакет для облучения в лежачем заполненном состоянии имеет толщину, равную всего нескольким миллиметрам, например толщину менее 10 мм, предпочтительно менее 5 мм, и может содержать в себе пробы объемом от 200 до 500 мл. Однако максимальная вместимость (объем) пакета для облучения, по меньшей мере, в 3 раза больше, как правило, в 6,66 раз больше, предпочтительно, по меньшей мере, в 10 или даже 20 раз больше, чем фактический содержащийся в нем объем пробы, подлежащей обработке.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Описанные ниже опыты иллюстрируют эффективность способа и не ограничены инактивацией указанных ниже вирусов. Также нет ограничения в виде использованных в описанных опытах проб плазмы или КЭ, полученных из донорских порций крови; способ согласно настоящему изобретению применим также к препаратам, изготовленным другими способами. Все описанные опыты были проведены от трех до шести раз. Приведенные результаты представляют собой средние значения, полученные в этих опытах.

Дозы плазмы и концентраты эритроцитов

Использованные дозы плазмы и КЭ были получены из отдельных донорских порций крови стандартными способами. Они имели объем от примерно 250 до 300-350 мл и хранились в стандартных пластиковых пакетах для препаратов крови. Остаточные лейкоциты и тромбоциты удаляли посредством фильтрации. КЭ были суспендированы в стабилизирующей среде SAG-M. Образцы плазмы хранили при температурах ниже -30°С и перед проведением опыта размораживали в водяной бане. КЭ хранили в холодильнике при 4-8°С.

Вирусологические исследования

Аликвоты плазмы или КЭ заражали вирусом везикулярного стоматита (VSV, штамм Индиана, АТСС VR 158), вирусом Sinbis (ATCC VR-68) или вирусом герпеса свиней (SHV-1, вирус ложного бешенства, штамм Ауески, АТСС VR-135). Титры вирусов определяли посредством СРЕ-анализа (СРЕ = цитопатический эффект). Их выражали в виде TCID₅₀ (TCID = инфицирующая доза для культур тканей). Индикаторными клетками служили Vero-клетки (клетки почки зеленой мартышки). Начальная концентрация вируса в проведенных опытах составляла примерно 10⁵-10 ⁷ TCID₅₀.

Установки для облучения, пакеты для облучения

Одна из двух использованных установок для облучения была оборудована трубками, которые испускали УФ-С излучение (длина волны: 254 нм). Облучение осуществлялось с обеих сторон помещенного в установку пакета для облучения, то есть сверху и снизу. Вторая установка для облучения была оборудована трубками, которые испускали УФ-В излучение (280-320 нм). Облучение также осуществлялось с обеих сторон. Третья установка была оборудована LED (светодиодами), которые испускали интенсивный красный свет в диапазоне длин волн около 635 нм. Все три установки во время использования размещали на орбитальном шейкере (производитель - фирма Buhler, Тюбинген; Тип SM 25), который осуществлял до 100 оборотов в минуту. Использованные пакеты для облучения состояли из тонкого слоя проницаемого для УФ-излучения и очень гибкого пластика.

Пример эксперимента 1

Инактивация вирусов везикулярного стоматита (VSV) посредством облучения УФ-С: влияние скорости встряхивания и свободной подвижности образцов плазмы во время облучения

Дозы плазмы, находившиеся в пакетах для облучения, заражали VSV и в течение 2 минут облучали УФ-С излучением. Одна проба была подвергнута встряхиванию с частотой 100 об/мин, и во время облучения она была прочно зажата между двумя кварцевыми пластинами. Другие пробы просто лежали на кварцевой пластине, так что во время встряхивания они могли перемещаться внутри пакета. Число оборотов шейкера варьировали в диапазоне от 30 до 100 об/мин. Результаты приведены в Таблице 1. В жестко зафиксированной пробе титр вируса снижался всего примерно на 0,3 log₁₀.

Таблица 1
Частота встряхивания (об/мин)	Титр вируса (log10TCID50)	Примечание
0	6,21±0,69	Контроль
30	5,78±0,27	Свободно размещенная проба
50	4,59±0,04	Свободно размещенная проба
75	0,92±0,24	Свободно размещенная проба
100	0,35±0,52	Свободно размещенная проба
100	5,92±0,11	Зафиксированная проба

В свободно размещенной пробе на степень инактивации вирусов непосредственное влияние оказывало число оборотов: если при 30 или 50 об/мин уровни инактивации по сравнению с необработанными контрольными пробами составили всего примерно 1,1 и 2,4 log₁₀, то при 75 об/мин уровень инактивации увеличился до примерно 1, 1 log ₁₀, а при 100 об/мин - до примерно 6,6 log₁₀ . Результаты этого опыта показывают, что плазму во время обработки необходимо интенсивно встряхивать, чтобы облучение УФ-излучением было эффективным. Кроме того, для того чтобы эффект встряхивания мог проявиться, пробы должны быть свободно размещены, чтобы во время встряхивания образовывались тонкие слои, проницаемые для излучения.

Пример эксперимента 2

Инактивация вирусов везикулярного стоматита (VSV), Sinbis-вирусов и вирусов герпеса свиней (SHV-1) в плазме во время облучения УФ-С: кинетика инактивации

Дозы плазмы заражали VSV, Sindbis-вирусами или SHV-1 и облучали в течение 1-5 минут. Свободно размещенные на орбитальном шейкере пробы встряхивали со скоростью 100 об/мин. Контрольные пробы облучали в течение 5 минут, но не встряхивали. Результаты опытов представлены в Таблице 2. В пробах, подвергавшихся встряхиванию, титр VSV за 3 минуты снижался более чем на 6,5 log₁₀, тогда как уровень инактивации в контрольной пробе, не подвергавшейся встряхиванию, не превышал 1,5 log₁₀. Sindbis-вирусы проявили себя как более устойчивые, чем VSV; однако большое различие между пробами, подвергнутыми встряхиванию и не подвергнутыми встряхиванию, сохранялось и здесь: после облучения в течение 5 минут титр вируса в пробе, подвергнутой встряхиванию, снизился примерно на 5,1 log₁₀, тогда как в пробе, не подвергнутой встряхиванию, - всего на 0,30 log₁₀.

Таблица 2
		Титр вируса (log10TCID50)
УФ-С (мин)	Встряхивание	VSV	Sinbis	SHV-1
Контроль	-	6,74±0,32	7,01±0,24	4,95±0,23
2	+	0,95±0,31	4,68±0,21	2,56±0,25
3	+	0,24±0,00	3,27±0,16	1,67±0,37
4	+	0,24±0,00	2,10±0,12	0,66±0,29
5	+	0,24±0,00	1,86±0,09	0,42±0,21
5	-	5,69±0,18	6,73±0,16	4,65±0,16

Аналогичная картина была обнаружена и при использовании SHV-1: в пробах, подвергнутых встряхиванию, титр вируса за 4-5 минут снижался на 4,3-4,5 log₁₀; в пробе, не подвергнутой встряхиванию, после 5 минут облучения титр вируса снизился всего на 0,3 log₁₀.

Пример эксперимента 3

Инактивация вирусов везикулярного стоматита (VSV) в плазме во время облучения УФ-В: кинетика инактивации

Дозы плазмы заражали VSV и облучали в течение 1-5 минут. Свободно размещенные на орбитальном шейкере пробы встряхивали со скоростью 100 об/мин. Контрольную пробу облучали в течение 5 минут, но не встряхивали. Как видно из Таблицы 3, в пробах, подвергнутых встряхиванию, титр вируса за 5 минут снижался на 6,36 log ₁₀, в контрольной пробе, не подвергнутой встряхиванию, - всего примерно на 1,5 log₁₀. Результаты показывают, что обнаруженный феномен - повышение инактивации патогенных микроорганизмов в свободно размещенных пробах во время интенсивного встряхивания - не ограничен УФ-С диапазоном.

Таблица 3
УФ-В (мин)	Встряхивание	Титр вируса (log 10TCID50)
Контроль	-	7,00±0,16
2	+	4,70±0,08
3	+	3,68±0,12
4	+	2,23±0,23
5	+	0,64±0,08
5	-	5,52±0,08

Пример эксперимента 4

Инактивация вирусов везикулярного стоматита (VSV) в плазме во время фотодинамической обработки метиленовым синим и видимым светом

Дозы плазмы заражали VSV, добавляли 0,25 мкМ/л фотосенсибилизатора метиленового синего (МС) и на орбитальном шейкере при 100 об/мин облучали в течение периода времени до 30 минут красным светом от светодиодов. Контрольные пробы в присутствии той же концентрации МС облучали в течение 20 минут, но во время облучения их не встряхивали.

Как следует из Таблицы 4, уровень инактивации вирусов в пробах, подвергнутых встряхиванию, был гораздо больше, чем в пробах, не подвергнутых встряхиванию. В пробах, подвергнутых встряхиванию, титр вируса через 20 минут снизился примерно на 4,4 log₁₀, через 30 минут - примерно на 5,8 log ₁₀. В пробах, не подвергнутых встряхиванию, уровень снижения титра через 20 минут не превышал примерно 2,7 log₁₀ .

Таблица 4
МС/свет (мин)	Встряхивание	Титр вируса (log 10TCID50)
Контроль	-	6,72±0,24
10	+	4,95±0,68
20	+	2,30±0,88
30	+	0,94±0,87
20	-	4,04±0,54

Пример эксперимента 5

Инактивация вирусов везикулярного стоматита (VSV) в КЭ во время фотодинамической обработки метиленовым синим и видимым светом

Аликвоты КЭ заражали VSV, добавляли 5 мкМ/л фотосенсибилизатора метиленового синего (МС) и на орбитальном шейкере при 100 об/мин облучали в течение периода времени до 30 минут красным светом от светодиодов. Контрольные пробы во время облучения не встряхивали. Таблица 5 демонстрирует однозначные результаты опыта. Очевидно, что инактивация вирусов в пробах, подвергнутых встряхиванию, происходила значительно быстрее, чем в пробах КЭ, не подвергнутых встряхиванию. В пробах, которые встряхивались во время обработки, через 30 минут вирус был почти полностью инактивирован (уровень инактивации 6,7 log ₁₀). Напротив, уровень снижения титра вируса в пробах, которые не встряхивали, через 30 минут составил всего примерно 2,7 log₁₀.

Результаты примеров экспериментов 4 и 5 показывают, что эффективность фотодинамической обработки плазмы или концентратов эритроцитов также резко увеличивается, если пробы во время облучения интенсивно встряхивают.

Таблица 5
МС/свет (мин)	Встряхивание	Титр вируса (log 10TCID50)
Контроль	-	7,04±0,26
10	+	2,62±0,31
20	+	0,89±0,21
30	+	0,30±0,12
10	-	5,07±0,26
20	-	5,25±0,31
30	-	4,35±0,27