композиция для лечения и/или предотвращения желудочно-кишечной инфекции

Формула изобретения

1. Применение композиции, содержащей гидролизат белка гороха, для приготовления композиции для лечения и/или предотвращения инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией указанным желудочно-кишечным патогеном, путем введения млекопитающим.

2. Применение по п.1, где патогеном является Helicobacter.

3. Применение по п.2, где патогеном является Helicobacter pylori (H.pylori).

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где заболевание, связанное с инфекцией, выбирают из группы, состоящей из гастрита, язвы желудка и рака желудка.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где млекопитающим является (i) ребенок в возрасте от 0 до 5 лет или (ii) пациент, страдающий от заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки.

6. Применение по любому из предшествующих пунктов для предотвращения повторной инфекции патогеном после лечения млекопитающего одним или несколькими антибиотиками.

7. Композиция для лечения и/или предотвращения инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией указанными патогенами, содержащая липидную, белковую и углеводородную часть, где липидная часть обеспечивает от 5 до 50% от общего количества калорий, белковая часть обеспечивает от 5 до 50% от общего количества калорий и углеводная часть обеспечивает от 15 до 90% от общего количества калорий, отличающаяся тем, что белковая часть содержит: (i) гидролизат белка гороха, и (ii) по меньшей мере один источник азота, выбранный из группы, состоящей из белков молока, гидролизата молочного белка, яичного белка и гидролизата яичного белка.

8. Композиция по п.7, где источник азота выбран из группы, состоящей из гидролизованной коровьей сыворотки, негидролизованной коровьей сыворотки, гидролизованного коровьего казеина и негидролизованного коровьего казеина.

9. Композиция по пп.7 и 8, содержащая растворимый трудно усваиваемый ферментируемый олигосахарид.

10. Композиция по любому из пп.7-9, имеющая осмоляльность раствора от 50 до 500 мОсм/кг.

11. Применение композиции по любому из пп.7-10 для приготовления смеси для лечения и/или предотвращения инфекции Helicobacter pylori (H.pylori) и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией Helicobacter pylori.

12. Гидролизат белка гороха для лечения и/или предотвращения инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией указанным желудочно-кишечным патогеном.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к лечению и/или предотвращению инфекции, вызванной желудочно-кишечными патогенами, в частности Helicobacter pylori.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Желудочно-кишечные инфекции - острая проблема для многих людей, в частности у детей и больных с ослабленной иммунной системой или желудочно-кишечными заболеваниями. Заболевания, возникающие в результате, могут быть опасны для жизни. Причиной желудочно-кишечных инфекций часто бывают Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter, Clostridium, Enterobacter и Helicobacter, например Helicobacter pylori.

Helicobacter pylori (H. pylori) - грамотрицательная микроаэрофильная жгутиковая бактерия, которая при инфекции проникает в слизистую оболочку желудка человека. Инфекция H. pylori связана с тяжелыми заболеваниями желудка, такими как гастрит, язва желудка и рак желудка. Всемирная Организация Здравоохранения классифицировала H. Pylon как карциноген Группы I. Обычно инфекция H. pylori является хронической и не лечится без особой терапии.

Инфицирование H. pylori обычно происходит в раннем детстве. Большинство детей оказываются инфицированными в течение первых 5 лет жизни [Vandenplas Y, Curr Opin Infect Dis 2001; 14(3): 315-321]. К 10 годам общая распространенность инфекции составляет более 75% в развивающихся странах, тогда как в развитых странах инфицированными оказываются 10%, но у детей более низких социально-экономических групп распространенность инфекции может достигать 30-40%.

Механизм переноса H. pylori до сих пор полностью не выяснен и требует дальнейшего исследования. Сейчас обсуждаются орально-оральный, гастро-оральный (через рвоту), фекально-оральный пути, питье водопроводной воды (в развивающихся странах) или даже плохо очищенное эндоскопическое оборудование.

Для лечения от инфекции Н. pylori требуется от трех до четырех лекарств. Канадские и большинство европейских групп исследователей Н. pylori сейчас рекомендуют (для взрослых) тройной режим: дважды в день ингибитор протонной помпы в сочетании с двумя антибиотиками, к примеру кларитромицином и амоксициллином в течение 1-2 недель. Лечение является весьма дорогостоящим, к тому же существует риск увеличения устойчивости бактериальных штаммов к антибиотикам и риск повторной инфекции после неудачного лечения. Лечение детей, возможно, является самым экономически эффективным методом снижения распространенности инфекции, а также заболеваемости и смертности от заболеваний, связанных с H. pylori. К настоящему моменту не существует методических рекомендаций о необходимости лечения детей. Вакцина для человека пока недоступна. Профилактика и терапевтическая вакцинация оказалась успешной на животных моделях, но перевод в вакцину для человека остается по-прежнему сложным, частично из-за того, что иммунология желудка по-прежнему плохо изучена.

Принимая во внимание проблемы с лечением антибиотиками и профилактикой путем вакцинации, необходимо предотвратить адгезию H. pylori к слизистой оболочке желудка. Без адгезии бактерии риск связанного с ней воспаления, приводящего к гастриту или возможно к раку, может быть минимизирован. Модуляция диеты (пробиотики) доказала свою полезность в поддерживающей терапии при инфекции Н. pylori или профилактике in vivo и in vitro [Michetti P et al. Digestion 1999; 60(3): 203-209 and Midolo PD et al., J Appl Bacteriol 1995; 79(4): 475-479].

WO 94/18986 относится к применению ди- или олигосахаридных гликозидов, содержащих по меньшей мере одну терминальную единицу L-фукозы для приготовления фармацевтических композиций для лечения или профилактики у людей условий, приводящих к инфекции H. pylori в слизистой оболочке желудка человека.

ЕР 0713700 описывает способ ингибирования Helicobacter путем приема С8-С16 моноглицеридов жирных кислот или лауриновой кислоты. Моноглицериды и/или лауриновая кислота просто принимают как питательную композицию.

ЕР 1178104 относится к питательной композиции, содержащей особое эфирное масло и/или особый очищенный компонент, выделенный из эфирного масла для предотвращения или лечения инфекции Helicobacter - подобным организмом. Питательная композиция может также содержать источник углеводородов, источник жира и/или источник диетического белка гороха в качестве одного из них.

JP 2005255679 описывает полипептид, полученный путем обработки пахты протеазой, обладающий не только ингибирующим эффектом на адгезию Helicobacter pylori к слизистой оболочке желудка, но и эффектом выталкивания Helicobacter pylori из слизистой оболочки желудка переносчиков Helicobacter pylori.

JP 2001335504 описывает ингибитор пролиферации Helicobacter pylori, в качестве активного ингредиента содержащий ферментный гидролизат соевого белка.

DE 10317935 описывает использование казеина для приготовления композиции для предотвращения или лечения инфекции Helicobacter и для предотвращения заболеваний, связанных с инфекцией Helicobacter.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей гидролизат белка гороха, интактный белок гороха и/или гидролизат белка верблюжьего молока для лечения и/или предотвращения инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией указанными патогенами, в частности инфекций желудочно-кишечным патогеном, выбранным из группы, состоящей из Helicobacter, Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter, Clostridium и Enterobacter. Более того, изобретение относится к применению гидролизата белка гороха, интактного белка гороха и/или гидролизата белка верблюжьего молока для приготовления композиции для лечения и/или предотвращения инфекции или заболевания, соответственно, указанных выше.

Авторы настоящего изобретения выяснили, что гидролизат белка гороха, интактный белок гороха и гидролизат верблюжьего казеина (далее в тексте совместно обозначаемые как «настоящий белковый компонент») способны ингибировать адгезию Н. pylori к клеткам слизистой оболочки желудка. Термины гидролизат белка гороха и гидролизат верблюжьего казеина (далее в тексте совместно обозначаемые как «настоящий гидролизат белкового компонента») в том виде, в каком они используются в тексте, относятся к их пептидам и/или гликоконъюгатам, но предпочтительнее относятся к пептидам, полученным гидролизом белка гороха и/или полученным гидролизом верблюжьего казеина. Ингибирование адгезии делает эти белковые компоненты особенно подходящими для применения в способе лечения и/или предотвращения инфекции Helicobacter.

Особенно хорошие результаты были получены с гидролизатами белка гороха. Предпочтительно гидролизат белка гороха получали из изолята белка гороха. Изолят белка гороха предпочтительно содержит по меньшей мере 75 массовых % белка гороха на 100 граммов изолята белка гороха.

Настоящий белковый компонент и в частности гидролизат настоящего белкового компонента могут быть легко добавлены в детские молочные композиции, продукты для малышей и продукты для подростков. Простота и безопасность в применении этого белкового компонента придает особую важность этому изобретению, так как оно решает проблемы побочных эффектов, обычно связанных с приемом лекарств и дорогостоящей мультилекарственной терапией. Настоящий белковый компонент также легко могут принимать взрослые.

Дополнительное преимущество использования настоящего белкового компонента, в частности настоящего гидролизата белка гороха, состоит в том, что оно предпочтительно и обычно быстро растворяется в воде, к примеру, делая его особенно удобным для применения в качестве жидкого пищевого продукта. Это дает то преимущество, что настоящий антиинфекционный белковый компонент не обязательно давать отдельно (к примеру, детям), а можно принимать в составе питательной композиции.

Вследствие того, что увеличенная продолжительность кормления грудью в младенчестве может иметь долгосрочный защитный эффект против хронической инфекции Н. pylori и таким образом снижать риск желудочной карциномы (|J Pediatr Gastoenterol Nutr. 2005 Nov; 41(5): 617-20), особенно желательно защищать от инфекции Н. pylori детей, которые получают детские молочные композиции. Неожиданно было выяснено, что настоящий белковый компонент (в частности гидролизат белка гороха) может быть использован для уменьшения и/или предотвращения инфекции Н. pylori.

В следующем воплощении настоящий белковый компонент можно легко применять для профилактики инфекций желудочно-кишечными патогенами для предотвращения повторной инфекции желудочно-кишечным патогеном после лечения антибиотиками, в частности профилактики инфекции Н. pylori для предотвращения повторной инфекции Н. pylori после лечения антибиотиками.

Так как описано, что инфекция H. pylori на ранних этапах жизни увеличивает риск кишечной карциномы, в частности желудочной карциномы, гастрита и язвы желудка, настоящее изобретение также предоставляет способ предотвращения этих болезней путем приема гидролизата белка гороха и/или гидролизата белка верблюжьего молока.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

Настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей гидролизат белка гороха, интактный белок гороха и/или гидролизат белка верблюжьего молока для приготовления композиции для лечения и/или предотвращения инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией указанными желудочно-кишечными патогенами.

Настоящее изобретение также предоставляет способ для лечения и/или предотвращения инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией желудочно-кишечными патогенами, указанный способ включает прием этим млекопитающим гидролизата белка гороха, интактного белка гороха и/или гидролизата белка верблюжьего молока. Предпочтительно млекопитающее является младенцем или ребенком, более предпочтительно ребенком в возрасте от 0 до 5 лет и/или пациентом, страдающим от заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки.

В следующем аспекте настоящее изобретение предоставляет композицию, содержащую липидную часть, обеспечивающую от 5 до 50% от общего числа калорий, белковую часть, обеспечивающую от 5 до 50% от общего количества калорий, и углеводородную часть, обеспечивающую от 15 до 90% от общего количества калорий. Указанная композиция отличается тем, что белковая часть содержит: (i) по меньшей мере один источник белка, выбранный из группы, состоящей из гидролизата белка гороха, интактного белка гороха и гидролизата белка верблюжьего молока; и (ii) по меньшей мере один источник азота, выбранный из группы белков молока, гидролизата белков молока, яичных белков, гидролизата яичных белков, соевого белка, гидролизата соевого белка, пшеничного белка, гидролизата пшеничного белка, рисового белка, гидролизата рисового белка, свободных аминокислот и их смесей. Использованные выше термины «липидная часть, белковая часть и углеводородная часть» означают сумму всех липидных ингредиентов, белковых ингредиентов или углеводородных ингредиентов, соответственно, присутствующих в композиции.

В том же аспекте настоящее изобретение включает применение этой композиции для лечения и/или предотвращения инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией указанным желудочно-кишечным патогеном.

Следующим предметом настоящего изобретения является гидролизат белка гороха, интактный белок гороха и/или гидролизат белка верблюжьего молока для лечения и/или предотвращения инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией указанным желудочно-кишечным патогеном.

Белок

Настоящее изобретение предоставляет композицию, содержащую гидролизат белка гороха, интактный белок гороха и/или гидролизат белка верблюжьего молока, и применение этой композиции для настоящей терапии.

Было обнаружено, что гидролизат верблюжьего казеина также чрезвычайно эффективен. Таким образом, в одном воплощении настоящее изобретение предпочтительно содержит гидролизат белка верблюжьего молока, предпочтительно гидролизат верблюжьего казеина.

Предпочтительным настоящим гидролизатом белкового компонента является гидролизат белка гороха.

Определенный методами гель-электрофореза (LDS-ПААГ с окраской кумасси и серебром) и масс-спектрометрии MALDI, диапазон молекулярного веса наиболее эффективных антиадгезионных к Helicobacter пептидов и/или гликоконъюгатов в настоящем гидролизате белкового компонента составляет 300-12000 Да, предпочтительно 2200-6000 Да. Таким образом, настоящий гидролизат белкового компонента предпочтительно содержит по меньшей мере 1 массовый % пептидов и/или гликоконъюгатов (предпочтительно пептидов) с молекулярным весом от 300 до 12000 Да относительно общего веса настоящего гидролизата белка, предпочтительно по меньшей мере 5 массовых %, более предпочтительно по меньшей мере 50 массовых %, наиболее предпочтительно по меньшей мере 75 массовых %. Более предпочтительно настоящий гидролизат белкового компонента содержит по меньшей мере 1 массовый % пептидов и/или гликоконъюгатов (предпочтительно пептидов) с молекулярной массой от 2200 до 6600 Да относительно общего веса настоящего белкового гидролизата, предпочтительно по меньшей мере 5 массовых %, более предпочтительно по меньшей мере 50 массовых %, наиболее предпочтительно по меньшей мере 75 массовых %.

Настоящий белковый компонент и в частности настоящий гидролизат белкового компонента предпочтительно принимают в количестве от 0,1 до 100 граммов в день, предпочтительно в количестве от 0,5 до 10 граммов в день.

Желудочно-кишечные патогены

Настоящий способ относится к лечению и/или предотвращению инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией указанным желудочно-кишечным патогеном, в частности лечению и/или предотвращению инфекций желудочно-кишечным патогеном, выбранным из группы, состоящей из Helicobacter, Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter, Clostridium и Enterobacter и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией указанным желудочно-кишечным патогеном.

Настоящее изобретение в частности предусматривает лечение и/или предотвращение инфекций Helicobacter и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией Helicobacter. Helicobacter предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Helicobacter pylori, Helicobacter bizzozeronii, H. salomonis, Helicobacter heilmannii и Helicobacter felis. Предпочтительно настоящее изобретение предоставляет лечение и/или предотвращение инфекций Helicobacter pylori (H. pylori) и или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией Helicobacter pylori.

Пищевые композиции

Было найдено, что настоящий белковый компонент и в частности гидролизат настоящего белкового компонента может быть с пользой добавлен в пищу, такую как детская еда и клиническое питание, в частности детское питание. Настоящая питательная композиция преимущественно содержит липидную часть, белковую часть и углеводородную часть.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к питательной композиции, содержащей настоящий белковый компонент и предпочтительно гидролизат настоящего белкового компонента и использование их в настоящем способе, где липидная часть обеспечивает от 5 до 50% от общего количества калорий, белковая часть обеспечивает от 5 до 50% от общего количества калорий и углеводородная часть обеспечивает от 15 до 90% от общего количества калорий. Настоящая композиция предпочтительно применяется как детская молочная смесь, где липидная часть обеспечивает от 35 до 50% от общего количества калорий, белковая часть обеспечивает от 7,5 до 12,5% от общего количества калорий и углеводородная часть обеспечивает от 40 до 55% от общего количества калорий. Для расчета % от общего количества калорий для белковой части необходимо учитывать все белки, пептиды и аминокислоты.

Кроме настоящего гидролизата белка гороха, интактного белка гороха и/или гидролизата верблюжьего казеина настоящая композиция для повышения питательности предпочтительно содержит дополнительный источник азота. Дополнительный источник азота предпочтительно выбирают из группы, состоящей из белка, пептида, аминокислот и их композиций. Таким образом, в предпочтительном исполнении белковая часть настоящей композиции содержит: (i) по меньшей мере один источник белка, выбранный из группы, состоящей из гидролизата белка гороха, интактного белка гороха и гидролизата белка верблюжьего молока; и (ii) по меньшей мере один источник азота, выбранный из группы белков молока, яичных белков, соевого белка, пшеничного белка, рисового белка, свободных аминокислот и их смесей. Предпочтительно настоящее изобретение содержит (i) гидролизат белка гороха и (ii) по меньшей мере один источник азота, выбранный из группы гидролизованной коровьей сыворотки, негидролизованной коровьей сыворотки, гидролизованного коровьего казеина, негидролизованного коровьего казеина и негидролизованного соевого белка.

Когда настоящий белковый компонент и в частности гидролизат настоящего белкового компонента принимают в сочетании с дополнительным источником азота, настоящая композиция предпочтительно содержит от 1 до 50 массовых % настоящего белкового компонента и в частности гидролизата настоящего белкового компонента относительно общей массы белка.

К питательной композиции может быть добавлен источник легко усваиваемого углеводорода. Настоящая композиция предпочтительно содержит лактозу.

В предпочтительном воплощении антиинфекционный эффект настоящего белкового компонента и в частности гидролизата настоящего белкового компонента, предпочтительно гидролизата белка гороха по отношению к желудочно-кишечным патогенам улучшается при одновременном принятии растворимого, трудно усваиваемого, ферментируемого олигосахарида. Прием этих олигосахаридов стимулирует рост лактобактерий, таких как бифидобактерии и лактобациллы, предотвращающие проникновение и инфекцию желудочно-кишечными патогенами. Таким образом, в этом отношении настоящий белковый компонент (гидролизат) и настоящий олигосахарид действуют синергически. Настоящий олигосахарид предпочтительно выбирают из группы, состоящей из галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов (например, инулина). Предпочтительно по меньшей мере 50 массовых % настоящих олигосахаридов имеют степень полимеризации от 2 до 60. В особенно предпочтительном воплощении настоящая композиция содержит по меньшей мере галактоолигосахариды и фруктоолигосахариды. Галактоолигосахариды предпочтительно содержат сахариды со степенью полимеризации от 2 до 10. Фруктоолигосахариды предпочтительно содержат сахариды со степенью полимеризации от 2 до 60.

Нерегулярность стула (к примеру, запоры, недостаточный объем стула или диарея) является специфической проблемой для многих детей и больных, у которых есть инфекция или риск инфекции Н. pylori. Такие больные часто получают жидкую пищу. Было найдено, что проблемы со стулом можно уменьшить путем приема настоящего белкового компонента в составе жидкой пищи с осмотической концентрацией раствора от 50 до 500 мОсм/кг, более предпочтительно от 100 до 400 мОсм/кг. Предотвращение проблем со стулом имеет особую важность, когда настоящий белковый компонент принимается вместе с или после лечения антибиотиками. Учитывая сказанное выше, также важно, чтобы жидкая пища не была особо калорийной, однако поставляла достаточное количество калорий, чтобы насытить больного. Таким образом, жидкая пища предпочтительно имеет калорийность от 0,1 до 2,5 ккал/мл, даже более предпочтительно калорийность от 0,5 до 1,5 ккал/мл, наиболее предпочтительно от 0,6 до 0,8 ккал/мл.

Применение

Настоящее изобретение предусматривает композицию и способ для лечения и/или предотвращения инфекции, вызванной желудочно-кишечными патогенами (в частности Н. pylori) и/или заболевания человека, связанного с инфекцией желудочно-кишечными патогенами (в частности Н. pylori), указанный способ содержит прием человеком настоящего белкового компонента и в частности гидролизата настоящего белкового компонента. Заболевания, связанные с инфекцией желудочно-кишечными патогенами, включают постоянный хронический гастрит, диарею, абдоминальную боль, язвы и/или рак желудка. Заболевания людей, связанные с инфекцией H. pylori, включают постоянный хронический гастрит, язвы и/или рак желудка. Настоящее изобретение также предусматривает лечение и/или предотвращение у людей этих заболеваний при риске возникновения или при необходимости их лечения.

Настоящее изобретение относится к лечению и предотвращению заболевания млекопитающего, предпочтительно человека или домашнего животного, более предпочтительно человека. Настоящую композицию могут легко принимать а) дети в возрасте от 0 до 5 лет, предпочтительно дети в возрасте от 0 до 2 лет и/или б) пациенты, страдающие от заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки, особенно пациенты, страдающие от язвы желудка.

Настоящее изобретение также особенно подходит для предотвращения повторной инфекции желудочно-кишечными патогенами, в частности Н. pylori, после лечения млекопитающего одним или несколькими антибиотиками.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Антиинфекционный эффект гидролизата настоящего белкового компонента

I. Получение антиадгезионных пептидов и гликоконъюгатов путем ферментативного гидролиза

Белок гороха: изолят белка гороха (90% белка) диспергировали в дистиллированной воде до концентрации 2,5 мас./мас.%. Гидролиз проводили 180 мин при 50°С путем добавления трипсина и химотрипсина в соотношении фермент: субстрат = 1:150 по массе для каждой протеазы. За счет добавления гидроксида натрия в течение гидролиза сохраняли постоянный рН на уровне 7,80. Ферменты инактивировали нагреванием до 85°С и поддержанием температуры от 85 до 80°С в течение 5 минут. Суспензию быстро охлаждали на льду до комнатной температуры, после чего центрифугировали на 3800 g в течение 15 минут при 20°С. Супернатант отбирали и подвергали лиофильной сушке.

Верблюжий казеин: верблюжий казеин (85% белка) растворяли в дистиллированной воде до концентрации 5 мас./мас.%. Гидролиз проводили 120 мин при 37°С путем добавления ТРСК-обработанного трипсина с отношением фермент: субстрат = 1:89 по массе. За счет добавления гидроксида натрия в течение гидролиза сохраняли постоянный рН на уровне 7,00. Гидролиз останавливали добавлением соляной кислоты до значения рН 4,60, и нерастворимую часть удаляли центрифугированием на 3100 g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант отбирали, доводили до нейтрального рН 6,90 и подвергали лиофильной сушке.

II. Очистка пептидов и гликоконъюгатов ультрафильтрацией (пептиды и гликоконъюгаты из изолята белка гороха)

Гидролизат белка гороха растворяли в дистиллированной воде до концентрации 1 мас./об.%. Ультрафильтрация проводилась на центрифужных фильтрах Amicon® Ultra-15 или Centricon® Plus-20 (Millipore GmbH, Швальбах, Германия). Устройства для получения антиадгезионных к H. pylori фракций имеют номинальную отсечку по молекулярному весу (NMWCO) в 10 кДа для Amicon® Ultra-15 или в 5 кДа для Centricon® Plus-20. Для удаления увлажнителя (глицерол) фильтры предварительно промывали дистиллированной водой путем центрифугирования в течение 5 минут на 4500 об/мин (4000 g) при 10°С (центрифуга Beckman J2-21 с ротором JS 7,5). Этот шаг повторяли один раз. Образец центрифугировали на 4500 об/мин (4000 g) в течение 30 мин при 10°С. Фильтрат отбирали, а осадок на фильтре разводили примерно до его исходного объема и повторяли центрифугирование. Этот шаг повторяли еще раз, и осадок на фильтре снова разводили до его исходного объема. Затем осадок на фильтре собирали. Фильтрат и осадок на фильтре подвергали лиофильной сушке.

III. In situ-тест на адгезивность для Н. pylori

Тест in situ в основном был проведен по методике Falk et al. (Falk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1993; 90:2035-2039). Использовался бактериальный штамм G27 Н. pylori I типа. Для анализа антиадгезионной активности пептидов и гликоконъюгатов, аликвоты (100-200 мкл) меченых FITC Н. pylori 2 часа в темноте преинкубировали с образцами пептидов и гликоконъюгатов (0,01-0,1% в блокирующем буфере). Контролем служили меченые FITC, но не обработанные, т.е. без добавления пептидов и гликоконъюгатов, аликвоты Н. pylori. Меченую FITC бактериальную суспензию разводили блокирующим буфером в 20 раз и 200 мкл, соответственно, помещали на предметное стекло со срезом слизистой оболочки желудка человека и инкубировали. После отмывки с помощью флуоресцентной микроскопии наблюдали адгезию бактерий. Сопоставимые результаты были получены при инкубации среза слизистой оболочки желудка с пептидами и гликоконъюгатами вместо инкубации с ними Н. pylori.

IV. Результаты

Гидролизаты человеческого казеина, верблюжьего казеина и особенно белка гороха подавляют адгезию H. pylori к слизистой оболочке желудка по сравнению с контролем (необработанными H. pylori). При использовании пептидов казеина человеческого молока адгезия может быть снижена более чем на 60%, при использовании пептидов верблюжьего казеина примерно на 80%, а при использовании пептидов и гликоконъюгатов белков гороха даже на 95% по сравнению с контролем (см. Таблицу 1). Настоящие результаты отражают преимущества использования гидролизата белка гороха и/или гидролизата верблюжьего казеина в лечении и/или предотвращении инфекций H. pylori и/или заболевания млекопитающих, связанного с инфекцией H. pylori.

ТАБЛИЦА 1
Ингредиент	Адгезия H. pylori (%)
Контроль	100
Гидролизованные белки бычьей сыворотки	100
Гидролизованный бычий казеин	100
Гидролизованный человеческий казеин	34
Гидролизованный верблюжий казеин	21
Гидролизованный белок гороха	5