способ выделения некультивируемых бактерий стафилококка

Формула изобретения

Способ выделения некультивируемых бактерий стафилококка основан на культивировании исследуемого материала на мясопептонном агаре в течение 24 ч при температуре 37°С, а затем выросшую культуру бактерий выдерживают при температуре +4°С в течение 48 ч.

Описание изобретения к патенту

Способ относится к области медицины, а именно к микробиологии, и предназначен для повышения эффективности микробиологической диагностики стафилококковых инфекций.

В последние годы отмечается рост заболеваемости внутрибольничными инфекциями (ВБИ), которые представляют собой одну из наиболее актуальных проблем здравоохранения во всех странах мира и наносят огромный социально-экономический ущерб. Одной из основных причин роста заболеваемости ВБИ является селекция и формирование госпитальных штаммов, обладающих высокой вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью [Митрофанова Н.Н., Мельников В.Л., Слетов A.M. Результаты мониторинга видового состава и основных биологических характеристик микроценозов многопрофильного стационара // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион, 2009. - № 4. С.90-97]. Известно значительное количество факторов, влияющих на генетическую изменчивость микроорганизмов. Меняющиеся условия окружающей среды вызывают у бактерий состояние стресса, в результате которого меняется способность бактерий размножаться на питательных средах [Rollins D., Colwell R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment // Appl. Environ. Microbiol. - 1986. - Vol.52. - P.531-538]. Под воздействием стрессовых факторов окружающей среды, влияющих на культуральные свойства бактерий, иногда даже значительное количество бактерий могут переходить в жизнеспособное некультурабельное состояние [Волянський. Ю.Л. Некультурабельний стан аспорогенних бактерiй: теоретичнi аспекти проблеми та практична значущiсть // Iнфекцiйнi хвороби. - 2004. - № 1. - С.5-9; Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий // Микробиология. - 1998. - № 6. - С.725-735; Colwell R. R. Bacterial death revisited // Nonculturable microorganisms in the environment / - Ed. D. J. Grimes. - Washington, D.C.. ASM Press, 2000. - p.325-342]. Установлено, что значительное количество бактериальных клеток, обладающих жизнеспособными патогенными свойствами, не размножаются в лабораторных условиях [Staley J., Konopka A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats // Annu. Rev. Microbiol. - 1985. - Vol.39 - P.321-346]. Так, при использовании стандартных микробиологических методов исследований только 0,01-0,1% бактерий культурабельны при исследовании проб морской воды [Kogure К., Simidu U., Taga N. Atentative direct microscopic method for counting living marine bacteria // Can. J. Microbiol. - 1979. - V.25. P.415-420].

Таким образом, в микробных популяциях формируется определенное количество бактерий, не способных размножаться на питательных средах, используемых для накопления и идентификации бактерий, вызывающих инфекционные заболевания у людей.

Известен общепринятый способ культивирования культуры Staphilococcus aureus на мясопептонном агаре и на желточно-солевом агаре при температуре 37°С [Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978, 394 с.], выбранный нами в качестве прототипа. Данный способ позволяет выявить только культурабельные бактерии стафилококка. Бактерии, обладающие некультурабельными свойствами, не растут на питательных средах, применяемых для микробиологических исследований, но обладают патогенными свойствами и за счет этого в микробиологических лабораториях регистрируются ложно отрицательные результаты исследований.

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности лабораторной диагностики стафилококковых инфекций за счет перевода некультивируемых бактерий стафилококка в культивируемое состояние.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат и основан на стрессовом воздействии холодом на размножающуюся культуру стафилококка на мясопептонном агаре при температуре 37°С.

Теоретическое обоснование возможности перехода некультивируемых бактерий в культивируемое состояние. В научной литературе имеется значительное количество сообщений о наличии в популяциях бактерий жизнеспособных, но потерявших свойство размножаться на питательных средах, используемых в лабораторных условиях, и для перехода этих бактерий в культивируемое состояние необходимо воздействовать на бактерии стрессовыми факторами, обеспечивающими переход бактерий из некультурабельного состояния в культурабельное.

Технический результат предложенного способа достигается тем, что согласно изобретению исследуемый материал культивируют на мясопептонном агаре в течение 24 часов при температуре 37°С, а затем выросшую культуру бактерий выдерживают при температуре +4°С в течение 48 часов.

Сущность предложенного способа достигается тем, что стрессовое воздействие низкой температуры на некультивируемые бактерии при 37°С создает условия для размножения бактерий и вызывает переход некультивируемых патогенных бактерий в культивируемое состояние. В результате перехода некультивируемых бактерий в культивируемое состояние снижается количество ложноотрицательных результатов исследований и обеспечивается более эффективное расследование эпидемических вспышек внутрибольничных инфекций, вызываемых госпитальными штаммами, что дает основание для проведения в полном объеме противоэпидемических мероприятий в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ).

Способ осуществляется следующим образом. Проводят посев исследуемого материала, выделенного от больных и из различных объектов ЛПУ, на скошенный мясопептонный агар (МПА) и культивируют бактерии при температуре 37°С в течение 24 часов. Для определения количества бактерий выросших на МПА проводят посев серийных разведений бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром и определяют титр микробной взвеси через 24 часа. Из культуры бактерий, выросших на МПА, по стандарту мутности в 5 единиц, соответствующей 500000 мк в 1 мл, получают взвесь бактерий, из которой готовят серийные разведения до 10⁷. Серийные разведения бактерий выдерживают 48 часов при +4°С и определяют концентрацию бактерий по результатам посева бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Примеры использования предлагаемого способа

Пример 1.

В декабре 2010 - январе 2011 гг. возникла вспышка, вызванная госпитальным штаммом стафилококка в 3-м роддоме г.Тюмени. От больных выделен возбудитель инфекции и проведен посев бактерий на скошенный МПА. Культивировали бактерии при температуре 37°С в течение 24 часов. Для определения количества бактерий, выросших на МПА, провели посев серийных разведений бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Через 24 часа титр микробной взвеси составил 9,0.10⁵. Из культуры бактерий, выросших на МПА, по стандарту мутности в 5 единиц, соответствующей 500000 мк в 1 мл, приготовили серийные разведения до 10⁷. Серийные разведения бактерий выдержали 48 часов при +4°С и определили концентрацию бактерий по результатам посева бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Концентрация бактерий составила 47.10⁵. Следовательно, 42 микробные клетки из состояния некультивируемого перешло в культивируемое состояние.

Пример 2.

От больного с гнойно-воспалительным процессом выделен спорадический штамм стафилококка. Бактериологической петлей провели посев выделенных бактерий на скошенный МПА и культивировали при температуре 37°С в течение 24 часов. Для определения количества бактерий, выросших на МПА, провели посев серийных разведений бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Через 24 часа титр микробной взвеси составил 10,4.10⁵. Из культуры бактерий, выросших на МПА, по стандарту мутности в 5 единиц, соответствующей 500000 мк в 1 мл, получили взвесь бактерий, из которой приготовили серийные разведения до 10⁷. Серийные разведения бактерий выдержали 48 часов при +4°С и определили концентрацию бактерий по результатам подсчета выросших колоний на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Концентрация бактерий составила 60.10⁵. Следовательно, 55 микробных клеток из состояния некультивируемого перешло в культивируемое состояние.

Способ перевода некультивируемых бактерий стафилококка в культивируемое состояние апробирован на базе бактериологической лаборатории Тюменского филиала ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по железнодорожному транспорту». Всего проведено 10 исследований. Количество некультивируемых бактерий в популяции госпитального штамма стафилококка, восстановивших способность размножаться на питательных средах, составило 39±4,3 мк, а спорадического штамма стафилококка - 53±2,5 мк.

Предложенный способ позволяет при одинаковых затратах на проведение микробиологических лабораторных исследований по сравнению со стандартным микробиологическим методом госпитальных и спорадических штаммов стафилококка повысить эффективность выделения возбудителей стафилококковой инфекции, уменьшить количество ложноотрицательных результатов исследований и обеспечить в более полном объеме проведение противоэпидемических мероприятий в очагах стафилококковых инфекций.