способ определения трансфузии гомологичной крови при допинговом контроле спортсменов

Формула изобретения

Способ определения трансфузии гомологичной крови при допинговом контроле спортсменов путем анализа крови, включающем забор образца крови, разделение образца на аликвоты, приготовление суспензии эритроцитов каждой аликвоты, окрашивание минорных антигенов эритроцитов первичными и вторичными антителами с флуоресцентными метками и последующий флуорометрический анализ суспензии меченных эритроцитов методом проточной цитометрии с регистрацией рассеяния света и интенсивности флуоресценции, отличающийся тем, что пробу крови разделяют на десять аликвот, и осажденные эритроциты окрашивают антителами против одного из антигенов: С, с, Е, Fy^a , Fy^b, Jk^a, Jk^b, S, «P» и «N», проводят цитофлуориметрический анализ, регистрируют результаты в виде гистограмм, выстраивают гистограммы соотношения минорных и мажорных популяций эритроцитов и при наличии на всех гистограммах анализируемой пробы одного пика (популяции) результаты анализа интерпретируют как отсутствие признаков трансфузии гомологичной крови, при наличии двух и более гистограмм с двумя пиками результаты анализа интерпретируют как положительные, при наличии одной гистограммы с двумя пиками (популяциями) результаты анализа переводят в категорию подозрительных и в этом случае проводят повторные анализы через 30, 60 и 90 сут и по показателям уменьшения или исчезновения минорной популяции выносят окончательное решение о трансфузии гомологичной крови.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а точнее к лабораторной диагностике и, в частности к способам определения состава крови, и может быть использовано, например, при допинговом контроле спортсменов.

Известны способы анализа крови анализом ИК-спектров крови или люминесцентного анализа компонентов крови или хемолюминисцентного анализа для определения отдельных характеристик крови, таких как динамику дисперсий физических показателей, свечения тромбоцитов, биологической совместимости эритроцитарной массы крови донора и реципиента соответственно [1-3].

Недостатком указанных технических решений является низкая информативность и ограниченная область применения.

Известны также способы анализа клеток и, в частности, крови методом проточной цитометрии, при котором регистрируют излучение, проходящее через поток одиночных клеток и далее интерпретируют результаты просвечивания [4-5].

Недостатком указанных технических решений также является низкая информативность и ограниченная область применения.

Известен также способ проведения анализа крови и анализатор крови для его осуществления, согласно которому пробу крови смешивают с разбавляющим и/или растворяющим реагентом, формируют поток пробы крови, на который воздействуют когерентным поляризованным излучением с длиной волны 330-680 нм, направляя его вдоль оси потока, определяют мультиугловое рассеяние клетками крови в потоке, выявляют и подсчитывают клетки крови по мультиугловому рассеянию ими света [6].

Недостатком указанного способа также является низкая информативность полученных результатов: получение обобщенных данных в основном о количественном составе крови без определения различий между однородными клетками и другими составляющими крови.

Наиболее близким к заявляемому объекту по своей технической сущности и достигаемому техническому результату является способ определения трансфузии гомологичной крови путем анализа крови, включающий приготовление суспензии эритроцитов (ЭЦ), окрашивание минорных антигенов ЭЦ по Дафи и Кидду первичными и вторичными антителами с флуоресцентными метками и последующий флуорометрический анализ суспензии ЭЦ методом проточной цитометрии с регистрацией рассеяния света и интенсивности флуоресценции и анализа гистограмм на наличие популяций ЭЦ [7].

Недостатком указанного способа является низкая достоверность выявления трансфузии гомологичной крови, связанная с высокой вероятностью получения ложноположительного результата, поскольку привлекается весьма узкая группа охвата вероятных признаков трансфузии и соответственно связанных с ней антигенов, что затрудняет корректную интерпретацию результатов анализа.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение точности и достоверности определения трансфузии крови за счет вовлечения дополнительных групп охвата признаков вероятной трансфузии и определения показателей уменьшения или исчезновения минорной популяции ЭЦ во времени, при одновременном сокращении продолжительности проведения анализа и его удешевлении.

Поставленный технический результат достигается тем, что помимо восьми антигенов (С, с, Е, Fy^a, Fy^b, Jk^a и Jk ^b и S) ЭЦ дополнительно окрашивают первичными и вторичными антителами с флуоресцентными метками по группам антигенов "Р" и "N" и далее на основе зарегистрированных интенсивностей рассеянного света и флуоресценции выстраивают гистограммы соотношения минорных и мажорных популяций ЭЦ и при наличии на всех гистограммах анализируемой пробы единичного пика (популяции) результаты анализа интерпретируют как отсутствие признаков трансфузии гомологичной крови, при наличии одной гистограммы, с двумя пиками (две популяции) результаты анализа переводят в категорию подозрительных, а при наличии двух и более гистограмм с двумя пиками результаты анализа интерпретируют как положительные и далее по категории подозрительных проводят повторные анализы через 30, 60 и 90 дней и по показателям уменьшения или исчезновения минорной популяции выносят окончательное решение о трансфузии гомологичной крови.

В настоящее время для достижения высоких результатов спортсмены вновь возвращаются к кровяному допингу. Конечным результатом кровяного допинга является повышение содержания гемоглобина в крови и увеличение снабжения мышечной ткани кислородом и в итоге повышение выносливости спортсмена.

Кровяной допинг многообразен и представляет собой введение спортсмену крови, красных кровяных телец (ЭЦ), родственных продуктов крови (плазмы в том числе), как правило, незадолго до старта. Применение кровяного допинга, включая аутологичную или гомологичную гемотрансфузию (переливание крови), запрещено во всех видах спорта как в соревновательном (In-competition), так и в несоревновательном периодах (Out-of-competition). Гомологическая гемотрансфузия означает, что спортсмену переливается кровь со схожими характеристиками: группа крови и резус фактор.

На практике не существует двух полностью одинаковых людей по антигенному составу ЭЦ за исключением однояйцевых близнецов. Это связанно с большим числом антигенов групп крови ЭЦ и их изменчивостью между отдельными индивидуами. В настоящее время известно около 236 антигенов ЭЦ, которые образуют 29 систем антигенов группы крови. Именно поэтому ЭЦ гомологичной крови донора практически всегда отличаются от ЭЦ реципиента по экспрессии нескольких минорных антигенов групп крови из-за различий в фенотипах. (Фенотип ЭЦ - это совокупность антигенов, присутствующих или отсутствующих на эритроцитах индивида). Таким образом, практически определение трансфузии гомологичной крови заключается в выявлении фенотипа ЭЦ исследуемой пробы крови спортсмена.

По мнению авторов для получения достоверных результатов определения трансфузии гомологичной крови необходимо и достаточно выявить фенотип ЭЦ по 10 антигенам средней встречаемости. Средняя встречаемость подразумевает, что частота встречаемости антигена в популяции больше 25%, но меньше 85%. Для фенотипирования ЭЦ могут быть выбраны резус-антигены С, с, Е, антигены Fy^a и Fy ^b (система Даффи), антигены Jk^a и Jk^b (система Кидд) и антиген S (система MNSs), a также антигены "Р" и "N".

Авторы отмечают, что выбор антигенов "Р" и "N" обусловлен тем, что они присутствуют в крови 50% популяции людей, и поэтому высока вероятность того, что донор и реципиент будут отличаться по этим антигенам тоже на 50% (практически максимально).

При окрашивании ЭЦ антителами могут быть использованы антитела IgG и IgM класса специфичные к выбранным антигенам. В качестве вторичных антител могут быть использованы специфичные к первичным антителам -F(ab')² фрагменты мышиных антител, конЪюгированные с флуоресцеином изотиоцианатом (FITC). Вначале ЭЦ окрашивают антителами к исследуемым антигенам, после чего метят вторичными антителами с флуоресцентным красителем, направленным против первичных антител.

В качестве рабочего буфера может быть использован буфер для проточного цитометра «ISOTON II Diluent», (Beckman Coulter, США), В качестве стабилизирующего раствора для приготовления суспензии ЭЦ может быть использован реагент ID-Cell Stab (DiaMed, Швейцария). В качестве дополнительных реагентов - Фосфатно-солевой буфер PBS (Amresco, Канада), бычий сывороточный альбумин BSA (Sigma, США), азид натрия NaN₃ (Sigma, США).

В качестве оборудования для проведения цитофлуориметрического анализа может быть использован, например, проточный цитофлуориметр фирмы Beckman-Coulter серии FC500, а в качестве программного обеспечения - программа СХР 2.0. Также могут быть использованы системы, описанные в [6] и [8].

В качестве оборудования для подсчета количества эритроцитов может быть использован, например, автоматический гематологический анализатор Sysmex XT-2000i (SysmexCorporation, Япония).

В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы, например:

- центрифуга для микропробирок «Eppendorf-5417R» (Eppendorf, ФРГ);

- центрифуга с бакет-ротором «Rotina 46R» (Hettich, ФРГ);

- центрифуга для глеевых карт ID (DiaMed, Швейцария);

- весы аналитические «Analytical Plus» (Ohaus, США);

- система очистки воды «Milli-Q» (Millipore, Франция);

- контактный миксер «Vortex-Genie 1» (Scientific Industries Inc., США);

- магнитная мешалка «RCT basic» (IKA, ФРГ);

- роллер-миксер «Stuart SRT9D» (Barloworld Scientific, Великобритания).

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

Готовят суспензию ЭЦ разведением пробы крови рабочим буфером до выбранной конечной концентрации (N×10⁶ ЭЦ в 100 мкл), отбирают 100 мкл приготовленной суспензии ЭЦ, отмывают рабочим буфером от плазмы, причем во время отмывки ЭЦ осаждают центрифугированием и после отмывки ресуспендируют в рабочем буфере. К восстановленной суспензии добавляют первичные антитела, разведенные в рабочем буфере до предварительно подобранной рабочей концентрации, интенсивно перемешивают и инкубируют. После инкубации с первичными антителами эритроциты три раза отмывают в рабочем буфере и затем к суспензии ЭЦ добавляют вторичные антитела в рабочей концентрации, перемешивают и инкубируют. Далее ЭЦ трижды отмывают рабочим буфером, ресуспендируют в определенном объеме рабочего буфера и перемешивают. Полученную суспензию ЭЦ подвергают цитофлуориметрическому анализу. Результаты анализа отображают в виде ряда гистограмм (в соответствии с числом привлеченных антигенов группы охвата признаков трансфузии гомологичной крови) и на основе показаний гистограмм делают вывод о наличии или отсутствии признаков трансфузии гомологичной крови.

Следует отметить, что заявляемый способ определения трансфузии гомологичной крови позволяет существенно сократить продолжительность допинг-контроля и существенно сократить затраты на его проведение.

Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.

Пример 1.

Для окрашивания в процессе проведения анализа выбраны 10 антигенов: резус-антигены С, с, Е, антигены Fy^a и Fy^b (система Даффи), антигены Jk^a и Jk^b (система Кидд), антиген S (система MNSs), а также антигены "Р" и "М".

Берут пробу крови у спортсмена (биатлон) заведомо не подвергавшегося трансфузии гомологичной крови с соблюдением правил проведения таковой операции предписанных WADA. Суспензию ЭЦ получают путем разведения образца крови рабочим буфером (PBS с 0,1% BSA и 0.02% азида натрия, рН 7.4) до конечной концентрации 5×10⁶ ЭЦ в 100 мкл. Количество ЭЦ в исследуемом образце предварительно измеряют на автоматическом гематологическом анализаторе Sysmex XT2000i. Затем разделяют полученную суспензию на 10 аликвот. Из первой аликвоты отбирают 100 мкл приготовленной суспензии ЭЦ и дважды отмывают рабочим буфером для удаления плазмы. В процессе отмывки ЭЦ осаждают центрифугированием в течение 2-х минут при 450 g. Далее ЭЦ ресуспендируют в 100 мкл рабочего буфера для предотвращения агглютинации. К полученной суспензии добавляют 50 мкл первичных антител (Anti-C monoclonal, human IgM, clone MS-24), специфичных к антигену С, разведенных в рабочем буфере до рабочей концентрации 1:10, интенсивно перемешивают и инкубируют в темноте 30 минут при комнатной температуре. После инкубации с первичными антителами ЭЦ трижды отмывают 500 мкл рабочего буфера, после чего к ним добавляют 50 мкл флуоресцентно меченных вторичных антител (Goat F(ab')² Anti-Human IgM-, FITC), специфичных к первичному использованному выше антителу в рабочей концентрации 1:20. Перемешивают на контактном миксере Vortex и инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре. Далее ЭЦ трижды отмывают 500 мкл рабочего буфера. Затем ЭЦ ресуспендируют в 300 мкл рабочего буфера при перемешивании. Полученную суспензию ЭЦ подвергают цитофлуориметрическому анализу, регистрируют результаты в виде гистограммы и анализируют гистограмму на наличие признаков трансфузии гомологичной крови. В точности так же, как описано выше манипулируют с остальными девятью аликвотами пробы, за исключением того, что каждый раз окрашивают следующий антиген в выбранном ряду. Соответственно каждый раз регистрируют результаты в виде гистограммы и анализируют ее.

На Рис.1 представлены гистограммы анализируемых образцов ЭЦ без трансфузии крови, меченых: резус-антигенами С, резус-антигенами с, резус-антигенами Е, антигенами Fy^a, антигенами Fy^b, антигенами Jk ^a, антигенами Jk^b, антигеном S, антигенами "Р" и антигенами "N".

Как видно из представленных гистограмм на всех гистограммах проявился только один пик (мажорная популяция ЭЦ 100%).

Примеры 2-9

Анализ исследуемых образцов крови ведут как в Примере 1, за исключением того, что исследуют кровь после трансфузии с известным содержанием мажорной и минорной популяций ЭЦ и при этом варьируют окрашивание антигенов (см. графу «Антигены» Таблицы 1).

Условия проведения анализов по Примерам 2-7 приведены в Таблице 1

Как следует из Таблицы 1, анализ крови с известной минорной популяцией эритроцитов по всем десяти антигенам (Примеры 2, 3 и 4) показывает наличие трансфузии крови при содержании минорных популяций эритроцитов 5,0-0,5%. В то же время при этих же условиях анализ крови с участием девяти антигенов (Примеры 5 и 6 сравнительные) не подтверждает наличия трансфузии крови при содержании минорных популяций эритроцитов 1,5-0,5%. Примеры 7, 8 и 9 сравнительные по прототипу (анализ с участием только восьми первых антигенов) показывают наличие трансфузии крови при содержании минорных популяций эритроцитов 5,0%. Низкое (1,5-0,5%) содержание минорных популяций в указанном случае не определяется.

Примеры 10-14

Анализ исследуемых образцов крови ведут как в Примере 1, при этом исследуют кровь по Примерам 2, 3 и 4 через 30, 60 и 90 дней после первичного анализа. Результаты приведены в Таблице 2.

Из Таблицы 2 следует (см. Примеры 13 и 14 сравнительные по прототипу), что при высоком содержании минорных популяций эритроцитов (5,0%) анализ с участием восьми антигенов позволяет определить наличие указанных популяций в категории «подозрительный» через 30 дней, но не далее. В то же время анализ по предлагаемому способу (с участием десяти антигенов) позволяет определить наличие минорных популяций при начальной концентрации 5,0% через 90 дней, а при 0,5% - через 60 дней.

На Рис.2 представлены гистограммы анализа крови, содержащей 5% минорных ЭЦ через 30 дней (см. Табл.2, Пример 10),

На Рис.3 представлены гистограммы анализа крови, содержащей 5% минорных ЭЦ через 60 дней (см. Табл.2, Пример 10),

На Рис.4 представлены гистограммы анализа крови, содержащей 5% минорных ЭЦ через 90 дней (см. Табл.2, Пример 10),

Как видно из описания, примеров конкретного осуществления способа и сравнительных примеров, заявляемый способ позволяет существенно повысить точность и достоверность определения трансфузии крови за счет привлечения антигенов с высокой степенью встречаемости в популяции людей, и проведения дополнительного контроля спортсменов из группы риска, сократить продолжительность допинг-контроля и сократить затраты на его проведение.

Источники информации

1. RU 02148267 С1, МПК G01N 33/49, 1999.06.01.

2. RU 02230322 С2, МПК G01N 33/49, 2004.06.10.

3. RU 0219 3197 С1, МПК G01N 33/49, 2002.11.20.

4. ЕР 1399728 А2, G01N 33/49, 24.03.2004.

5. WO 2004/019047, G01N 33/49, 04.03.2004.

6. RU 02347224 С2, МПК G01N 33/49, 2004.06.10.

7. Proof of homologous blood transfusion through quantification of blood group antigens, Haematologica, 2003; 88: 1284-1295, (http://www.haematologica.org/2003_11/1284.htm) - прототип.

8. ЕР 1297334 А1, G01N 33/49, 02.04.2003.