препарат для стимуляции обмена веществ и неспецифической резистентности животных

Формула изобретения

Препарат для стимуляции обмена веществ и неспецифической резистентности животных, включающий нуклеинат натрия, отличающийся тем, что он дополнительно содержит отходы биологической промышленности, полученные при культивировании перепелиных фибробластов на первичной культуральной среде, включающей синтетическую среду MEM (минимальная среда Игла), синтетическую среду 199 и сыворотку крови крупного рогатого скота, а также препарат дополнительно содержит антисептик стимулятор Дорогова Ф-2 (АСД Ф-2) при следующем соотношении компонентов, мас.%:

нуклеинат натрия	2,5
АСД Ф-2	3,5
отходы биологической промышленности,
полученные при культивировании клеток	94

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к получению биологически активных препаратов, стимулирующих обмен веществ, рост и повышающих естественную резистентность у животных.

Известен способ получения препарата для повышения резистентности организма животных, включающий замораживание тканей паренхиматозных органов, размораживание, гомогенизацию и внесение в экстракт янтарной кислоты с последующим гидролизом биомассы и декантирования экстракта с добавлением едкого натра (Патент РФ № 2237485, кл. А61К ³/₀₀ от 10.10.2004).

Недостатком известного способа является то, что он многоэтапный и сложный по своему техническому исполнению.

Существует также препарат «Янтарный биостимулятор» для повышения резистентности организма животных, предусматривающий смешивание янтарной кислоты с тканевым препаратом АСД Ф-2 (антисептик стимулятор Дорогова, фракция-2), новокаином и дистиллированной водой (Патент РФ № 2303979, кл. А61К 3/00 от 23.05.2005).

Недостатком этого способа является то, что он не оказывает стимулирующего действия на обмен веществ в организме животных.

В качестве прототипа выбран «Комплексный препарат для профилактики и лечения нарушений обмена веществ, микроэлементозов, повышения резистентности организма животных». Приготовление препарата предусматривает смешивание следующих компонентов из расчета, г/л: янтарная кислота (10,0), сульфат железа (2,0), сульфат меди (0,1), сульфат кобальта (1,0), сульфат цинка (0,1), нуклеинат натрия (10,0), метионин (10,0), вода для инъекций (до 1000 мл) (Патент РФ № 2404761, кл. А61К 3/00, от 24.03.2009).

Недостатком этого препарата является то, что полученный препарат не оказывает стимулирующего влияния на белково-аминокислотный и витаминный обмен веществ, а также имеет сравнительно невысокую иммуностимулирующую эффективность. При этом использование компонентов, входящих в состав препарата, а также применение стерилизации путем автоклавирования, делает препарат относительно дорогим.

Техническим результатом изобретения является обеспечение стимулирующего влияния препарата на белково-аминокислотный, минеральный и витаминный обмены веществ, повышение иммуностимулирующей эффективности, снижение стоимости препарата.

Указанный технический результат достигается тем, что известный препарат, содержащий нуклеинат натрия, согласно изобретению дополнительно содержит отходы биологической промышленности, полученные при культивировании перепелиных фибробластов на первичной культуральной среде, включающей синтетическую среду MEM (минимальная среда Игла), синтетическую среду 199 и сыворотку крови крупного рогатого скота, а также препарат дополнительно содержит антисептик стимулятор Дорогова Ф-2 (АСД Ф-2) при следующем соотношении компонентов, мас.%:

нуклеинат натрия	2,5
АСД-Ф2	3,5
отходы биологической промышленности, полученные
при культивировании перепелиных фибробластов	94

Отходы биологической промышленности получают после культивирования клеток, в частности перепелиных фибробластов, в технологических условиях биофабрик, например Курской биофабрики. При культивировании клеток используют первичную культуральную среду, включающую синтетическую среду MEM (минимальная среда Игла), синтетическую среду 199 и сыворотку крови крупного рогатого скота. Данные среды содержат комплекс аминокислот, минеральных и витаминных компонентов в соотношениях, обеспечивающих оптимальный рост культуры клеток. После процесса культивирования в жидких отходах указанные вещества остаются практически в прежнем количестве и соотношениях. Помимо перечисленных выше компонентов отходы культурального производства включают биологические продукты жизнедеятельности культивируемых клеток, которые выполняют роль естественных биостимуляторов.

Анализ биохимического состава отходов, полученных после культивирования клеток перепелиных фибробластов, при производстве жидкой вакцины против болезни Марека в условиях Курской биофабрики показал, что отходы содержат комплекс биохимических компонентов, которые соответствуют компонентам первичной культуральной среды. При этом содержание некоторых веществ было больше, чем в первичной культуральной среде. Это подтверждает, что в процессе культивирования клеток они продуцируют биохимические вещества, поступающие в окружающую среду, и тем самым повышают ее биологическую ценность.

Как следует из табл.1, отходы культурального производства включают азотистые компоненты: белки и аминокислоты. Среди аминокислот наибольшее содержание приходится на лизин, аргинин, треонин, глютаминовую кислоту, изолейцин, лейцин, тирозин и фенилаланин. Минеральная часть отходов представлена кальцием, фосфором, магнием, калием, натрием и хлоридами. В отходах содержится относительно много углеводов в виде глюкозы, а также витаминов: ретинола, тиамина, кальциферола, аскорбиновой кислоты. При этом отходы культурального производства представляют собой стерильную жидкость розового цвета с рН 6,7-7,0.

Отходы культурального производства в дальнейших технологических процессах не используются и, например на Курской биофабрике, утилизируются.

Таблица 1
Содержание биохимических компонентов в отходах, полученных после культивирования клеток перепелиных фибробластов
Исследуемые компоненты	Ед. измерений	Содержание
Альбумины	%	52,0
Альфа-глобулины	%	20,0
Бета-глобулины	%	18,0
Гамма-глобулины	%	10,0
Лизин	мг/л	135,7
Гистидин	мг/л	67,8
Аргинин	мг/л	158,4
Аспарагиновая кислота	мг/л	73,4
Треонин	мг/л	111,8
Серин	мг/л	63,7
Глютаминовая кислота	мг/л	144,8
Пролин	мг/л	53,2
Глицин	мг/л	88,5
Аланин	мг/л	74,7
Валин	мг/л	98,8
Метионин	мг/л	63,3
Изолейцин	мг/л	105,6
Лейцин	мг/л	208,7
Тирозин	мг/л	103,0
Фенилаланин	мг/л	107,7
Кальций	мг/л	388,4
Фосфор	мг/л	225,6
Магний	мг/л	199,4
Хлориды	мг/л	955,7
Калий	мг/л	108,3
Натрий	мг/л	211,8
Глюкоза	мг/л	1988,0
Пиридоксин	мг/л	1,47
Ретинол	мг/л	0,48
Тиамин	мг/л	0,12
Кальциферол	мг/л	2,05
Аскорбиновая кислота	мг/л	1,88
Рибофлавин	мг/л	0,97
Пантотеновая кислота	мг/л	1,17

Нуклеинат натрия - синтетический иммуностимулятор, он применяется для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, протекающих на фоне иммунодефицитных состояний. Термостабилен. Включение в состав препарата нуклеината натрия повышает его иммуномодулирующие свойства, так как нуклеинат натрия стимулирует деятельность костного мозга, внутриклеточный метаболизм и нуклеиновый обмен, обладает активностью поликлонального иммуномодулятора, стимулирует фагоцитарную активность макрофагов и в целом повышает неспецифическую защиту организма, особенно при иммунодефицитах.

Добавление в комплексный препарат АСД Ф-2 (антисептик-стимулятор Дорогова, фракция-2) способствует повышению активности тканевых ферментов, которые участвуют в активном транспорте ионов и питательных веществ через клеточные мембраны, в процессах фосфорилирования, улучшает трофику тканей, повышает уровень обменных процессов в здоровом организме и восстанавливает обмен до нормы при различных дистрофических состояниях.

Предлагаемый препарат получают следующим образом.

Для получения 1 л предлагаемого препарата в стерильную мерную колбу последовательно вносят 25 г нуклеината натрия, 35 мл АСД Ф-2 (антисептик-стимулятор Дорогова, фракция-2) и доводят объем до 1000 мл добавлением отходов биологической промышленности, полученных при культивировании клеток жидком виде.

Указанные количества нуклеината натрия и АСД Ф-2, входящих в предлагаемый препарат, были определены опытным путем и обосновано это тем, что при уменьшении указанных количеств эффективность препарата снижается, а при увеличении - остается на постоянном уровне.

Полученный препарат представляет собой жидкость розового цвета, со слабым специфическим запахом. Разливают препарат во флаконы емкостью по 50-100 мл, которые закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками.

Общие свойства и стабильность препарата определяют согласно положению Государственной фармакопеи. Критериями служат такие параметры, как внешний вид, прозрачность, окраска, токсичность, отсутствие механических включений.

Для определения сроков хранения препарата на предварительном этапе исследований был использован метод «ускоренного старения», а для получения более точных результатов экспериментальные образцы препарата были заложены на хранение при комнатной температуре, а также в холодильник при 4-8°С. Каждые 3 месяца проводилась проверка препарата на бактериальную загрязненность с использованием среды Эндо и МПА.

В ходе проверки было установлено, что при хранении исходные параметры остаются без существенных изменений в течение 12 мес.

Проверку препарата на пирогенность проводили на 6 здоровых кроликах разного пола с массой тела 2,5±0,14 кг. Каждый подопытный кролик содержался в отдельной клетке и получал рацион, одинаковый для всех животных.

До и после однократного введения препарата в ушную вену в дозе 1 мл/кг у кроликов измеряли температуру тела, а также брали кровь через 1, 3 и 6 часов. В крови определяли СОЭ, гематокрит и общее содержание лейкоцитов.

Результаты проверки препарата на пирогенность показали, что после введения препарата повышение суммарного показателя температуры тела у 6 подопытных кроликов находились в пределах физиологических норм 38,6-39,3°С. СОЭ и гематокрит соответственно составляли 1,5-2,0 мм/час и 37,0-38,0%. Содержание лейкоцитов после введения препарата повысилось, однако это увеличение (7,0±0,25-7,6±0,27×10¹² /л) по сравнению с фоновыми значениями (6,8±0,34×10 ¹²/л) незначительно.

Полученные результаты послужили основанием оценить изготовленный препарат как апирогенный.

Для исследования местного действия предлагаемого препарата на слизистые оболочки его вносили однократно в конъюнктивальный мешок кроликов в количестве 1-2 капель. При внесении препарата оттягивали внутренний угол конъюнктивального мешка, затем в течение 1 минуты зажимали слезно-носовой канал и наблюдали за поведением кроликов. В первые 1-2 часа отмечалась только слабая гиперемия конъюнктивы, изменений со стороны сосудов склеры, роговицы и зрачка у подопытных животных не наблюдалось.

Острую токсичность оценивали на белых беспородных мышах и кроликах породы советская шиншилла, которые содержались в условиях вивария Курской государственной сельскохозяйственной академии. Препарат вводили внутрибрюшинно: мышам - 0,5; 1,0 и 1,5 мл/гол., кроликам - 5,0 и 10,0 мл/гол.

Результаты исследований показали, что выбранные дозы препарата не оказывали отрицательного действия на организм белых мышей и кроликов. При убое подопытных животных видимых изменений в органах и тканях обнаружено не было.

Анафилактогенные свойства препарата исследовали на 10 морских свинках, которым внутрибрюшинно вводили отходы биологической промышленности, полученные после культивирования клеток в дозе 1,0 мл, а через 15 дней 1,0 мл предлагаемого препарата. После введения препарата ни у одного подопытного животного не наблюдалось реакций, характерных для анафилактического шока, что свидетельствует об отсутствии в изготовленном препарате гетерогенного белка.

Научно-производственные испытания препарата проводили на трех видах домашних животных: кроликах, свиньях и крупном рогатом скоте.

Пример 1. С целью оценки общего состояния, гематологических и иммунологических показателей после введения разных доз препарата был проведен эксперимент на кроликах породы советская шиншилла, которые содержались в условиях вивария Курской ГСХА.

Были сформированы три группы кроликов-аналогов 2-летнего возраста по 5 голов в каждой.

Кролики 1 группы являлись контрольными, вместо предлагаемого препарата им внутримышечно вводили 1,0 мл/гол. стерильного изотонического раствора натрия хлорида (физиологического раствора) один раз в день в течение трех дней подряд.

Кроликам 2 группы внутримышечно вводили предлагаемый препарат в дозе 0,5 мл/гол. один раз в день в течение трех дней подряд.

Кроликам 3 группы вводили 1,0 мл/гол. предлагаемого препарата по той же схеме, что и животным второй группы.

В период эксперимента за кроликами проводили наблюдение, а также брали кровь для лабораторного анализа до введения препарата, через 48 и 72 часа после последнего введения препарата. В крови определяли скорость оседания эритроцитов (СОЭ), гематокрит, содержание эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина общепринятыми методами. Содержание общих иммуноглобулинов устанавливали цинксульфатным методом, фагоцитарную активность лейкоцитов (ФАЛ) - путем реакции фагоцитоза с латексом, бактериальную активность сыворотки крови (БАСК) - с использованием культуры Staphylococcus aureus, лизоцимную активность сыворотки крови (ЛАСК) оценивали с применением суточной культуры Micrococcus lisodectus.

Результаты исследований (табл. 2) показали, что у всех подопытных кроликов общие гематологические и иммунологические показатели находились в пределах физиологических норм. При этом содержание эритроцитов у кроликов опытных групп после введения препарата было достоверно больше (р<0,05), чем до введения препарата и по сравнению с контрольными животными. Отмечалось также увеличение концентрации гемоглобина в крови подопытных животных, однако это увеличение было статистически недостоверным (р>0,05).

Таблица 2
Общие гематологические и иммунологические показатели у кроликов после введения предлагаемого препарата
Показатели	До введения препарата	Через 48 часов после введения препарата	Через 72 часа после введения препарата
1 группа (контрольная)
СОЭ, мм/час	1,1±0,09	1,3±0,10	1,2±0,07
Гематокрит, %	37,7±0,44	36,9±0,36	37,4±0,47
Эритроциты, 1012/л	5,9±0,05	5,7±0,07	5,9±0,09
Лейкоциты, 10 9/л	7,0±0,11	6,9±0,14	7,0±0,08
Гемоглобин, г/л	109,5±5,59	107,5±4,18	105,5±5,07
Иммуноглобулины общие, г/л	1,19±0,07	1,16±0,08	1,16±0,09
БАСК, %	69,4±2,00	68,3±1,16	67,7±1,11
ФАЛ, %	18,4±0,25	18,0±0,54	17,8±0,24
ЛАСК, %	41,5±0,46	42,0±0,58	41,6±0,49
2 группа (0,5 мл/гол.)
СОЭ, мм/час	1,2±0,10	1,2±0,09	1,3±0,08
Гематокрит, %	37,0±0,24	38,8±0,11	39,5±0,10
Эритроциты, 1012/л	5,8±0,07	6,2±0,06*	6,4±0,05*
Лейкоциты, 109/л	6,9±0,08	6,9±0,05	7,3±0,04
Гемоглобин, г/л	109,5±5,86	114,0±7,04	118,5±6,00
Иммуноглобулины общие, г/л	1,15±0,03	1,23±0,05	1,35±0,04*
БАСК, %	68,8±2,16	70,0±3,04	74,4±2,08
ФАЛ, %	18,8±0,24	21,1±0,15*	22,0±0,14*
ЛАСК, %	41,7±0,31	44,9±0,44	48,8±0,56
3 группа (1,0 мл/гол.)
СОЭ, мм/час	1,3±0,07	1,2±0,08	1,4±0,08
Гематокрит, %	37,4±0,34	39,5±0,22	39,8±0,18
Эритроциты, 1012/л	6,0±0,06	6,5±0,05*	6,7±0,04*
Лейкоциты, 109/л	6,8±0,07	7,0±0,09	7,4±0,08*
Гемоглобин, г/л	104,5±6,17	119,4±5,05	121,0±5,11
Иммуноглобулины общие, г/л	1,17±0,05	1,31±0,04*	1,38±0,04*
БАСК, %	67,0±3,17	72,5±4,15	80,7±3,00*
ФАЛ, %	17,5±0,34	21,7±0,25*	22,4±0,18*
ЛАСК, %	40,8±0,56	48,7±0,64	51,4±0,25
Примечание: * - при Р<0,05 по сравнению с соответствующими показателями, полученными до введения препарата; - при Р<0,05 по сравнению с контрольными животными.

Препарат оказывал положительное влияние на неспецифические защитные свойства организма, в частности у них было выше содержание в крови общих иммуноглобулинов, БАСК, ЛАСК и ФАЛ активность крови. В свою очередь отмечено, что у кроликов, которым вводили 1,0 мл/гол. препарата, неспецифические факторы защиты были выше по сравнению с кроликами, получавшими дозу 0,5 мл/гол. Таким образом, используемые дозировки изготовленного препарата оказывали положительное влияние на организм кроликов и обладали иммуностимулирующим эффектом.

Учитывая, что предлагаемый препарат содержит комплекс заменимых и незаменимых аминокислот, были проведены исследования содержания свободных аминокислот до и после введения препарата.

Пример 2. С этой целью в условиях свиноводческой фермы учебно-опытного хозяйства Курской ГСХА были отобраны три группы подсвинков 4-х месячного возраста (по 10 голов в каждой) с соблюдением принципа аналогов.

Свиньи 1 группы являлись контрольными, им вводили внутримышечно 3,0 мл/гол. изотонического раствора натрия хлорида ежедневно три раза через 24 часа.

Свиньям 2 группы вводили уже известный препарат «Комплексный препарат для профилактики и лечения нарушений обмена веществ, микроэлементозов, повышения резистентности организма» в дозе 3,0 мл/гол. ежедневно три раза через 24 часа.

Свиньям 3 группы внутримышечно вводили предлагаемый препарат в дозе 3,0 мл/гол., ежедневно три раза через 24 часа в той же последовательности, что и животным второй группы.

Кровь у свиней брали из сосудов хвоста до введения препаратов и через 10 дней после последнего введения препаратов. Содержание в плазме крови свободных аминокислот определяли на анализаторе фирмы «Hitachi» в научно-исследовательской лаборатории Курской биофабрики.

Сравнение содержания свободных аминокислот (табл. 3) показало, что их суммарное содержание в крови свиней, которым вводили предлагаемый препарат, было достоверно больше (р<0,05), чем у животных 1 и 2 групп. При этом увеличение суммы аминокислот происходило за счет как незаменимых, так и заменимых аминокислот.

Относительно высокое содержание аминокислот в крови свиней 3 группы можно объяснить стимулирующими свойствами метаболитов, выделяемых клетками в процессе культивирования, на усвояемость белка рациона, а также наличием комплекса аминокислот, содержащихся в изготовленном препарате в оптимальных соотношениях, что способствует их всасыванию в кишечнике свиней.

Для изучения влияния предлагаемого препарата на биохимический и иммунологический статус, а также на спермопродукцию у быков-производителей был проведен научно-производственный эксперимент в условиях ОАО «Курское» по племенной работе.

Пример 3. Эксперимент проводили на двух группах быков-производителей.

Быкам 1 группы (контрольной) вводили внутримышечно изотонический раствор хлорида натрия в дозе 10,0 мл/гол. один раз в день 3 раза через 24 часа.

Быкам 2 группы (опытной) вводили внутримышечно предлагаемый препарат в дозе 10,0 мл/гол. один раз в день 3 раза через 24 часа.

Условия содержания и кормления быков обеих групп были стереотипными. У всех животных брали кровь до введения препарата и на седьмой день после последнего его введения. В крови определяли биохимические и иммунологические показатели.

Результаты исследований представлены в табл.4, данные которой указывают на то, что после введения предлагаемого препарата у быков повышалось содержание биохимических компонентов крови, а также были выше показатели естественной резистентности организма. У контрольных животных изучаемые показатели находились на уровне исходных данных или несколько ниже.

Таблица 4
Биохимические и иммунологические показатели у быков-производителей после введения предлагаемого препарата
Показатели	1 группа (контрольная)	2 группа (опытная),
Рекорд	Хикс	Ракс	Миф	Старт	Скипер	Ромер	Ханнибал
Гемоглобин, г/л
Общий белок, г/л
Общий кальций, ммоль/л
Неорганический фосфор, ммоль/л
Общий магний, ммоль/л
Глюкоза, ммоль/л
Витамин А, мкмоль/л
Витамин Е, мг/л
Витамин С; ммоль/л
Иммуноглобулины общие, мг/л
ЛАСК, %
БАСК, %
ФАЛ, %
Примечание: 1 группа: числитель - до введения изотонического раствора хлорида натрия; знаменатель - после введения изотонического раствора хлорида натрия;
2 группа: числитель - до введения предлагаемого препарата; знаменатель - после введения предлагаемого препарата.

В свою очередь предлагаемый препарат оказывал положительное влияние на спермопродукцию быков-производителей (табл.5). У быков опытной группы, где использовался предлагаемый препарат, была выше концентрация сперматозоидов, их выживаемость и подвижность.

Таблица 5
Показатели спермопродукции у быков-производителей после введения предлагаемого препарата
Показатели	1 группа (контрольная)	2 группа (опытная)
Рекорд	Хикс	Ракс	Миф	Старт	Скипер	Ромер	Ханнибал
Объем эякулята, мл
Концентрация сперматозоидов, млрд/мл
Процент живых сперматозоидов
Подвижность сперматозоидов, балл
Общее количество сперматозоидов в эякуляте, млрд
Примечание: 1 группа: числитель - до введения изотонического раствора хлорида натрия; знаменатель - после введения изотонического раствора хлорида натрия; 2 группа: числитель - до введения предлагаемого препарата; знаменатель - после введения предлагаемого препарата.

Предлагаемый препарат апробировали с целью повышения обменных процессов и защитных сил организма у телят-гипотрофиков.

Пример 4. В условиях животноводческой фермы учебно-опытного хозяйства «Знаменское» Курской ГСХА были отобраны три группы телят-гипотрофиков.

Телята 1 группы являлись контрольными, им вводили внутримышечно изотонический раствор хлорида натрия в дозе 5 мл/гол. один раз в день 3 раза через 24 часа.

Телятам 2 группы вводили внутримышечно уже известный препарат в дозе 5 мл/гол. один раз в день 3 раза через 24 часа.

Телятам 3 группы внутримышечно вводили предлагаемый препарат в дозе 5 мл/гол. по той же схеме, что и животным второй группы.

У всех телят брали кровь до введения препарата и на 10 день после последнего его введения. В крови определяли биохимические и иммунологические показатели.

В ходе проведенных исследований было установлено, что у телят, которым вводили препараты (2, 3 группа), содержание изучаемых биохимических компонентов крови повышалось и было больше по сравнению с контрольными животными 1 группы (табл. 6). В свою очередь у телят 3 опытной группы содержание глюкозы, витаминов А, Е и С было достоверно больше (р<0,05), чем у телят 2 опытной группы.

Клинические наблюдения за подопытными животными показали, что телята, которым вводили предлагаемый препарат, быстрее восстанавливались, у них были выше среднесуточные привесы, среди них не встречалось больных телят. У животных 2 опытной группы привесы были меньше, у двух телят наблюдалось расстройство желудочно-кишечного тракта с клиническими признаками диспепсии. Телята 1 контрольной группы в росте отставали, за период эксперимента два теленка пали.

Проведенные научно-производственные опыты свидетельствуют, что изготовленный препарат обладает более выраженным биологическим действием по сравнению с препаратом-прототипом. Содержащийся в изготовленном препарате комплекс биохимических компонентов в оптимальных соотношениях способствует их активному поступлению в организм животных и оказывает благоприятное влияние на обмен веществ. При этом продукты обмена, выделяемые клетками при культивировании, являются биологическими стимуляторами и оказывают стимулирующее влияние на клеточный метаболизм и неспецифические факторы защиты животных.

Таким образом, предлагаемый препарат для стимуляции обмена веществ и неспецифической резистентности животных оказывает одновременно стимулирующее влияние на белково-аминокислотный, минеральный и витаминный обмены, повышает неспецифическую резистентность организма животных. Это может иметь положительное значение как в профилактике и комплексной терапии инфекционных болезней, так и в профилактике других заболеваний, в основе которых лежит нарушение обмена веществ и иммунологическая недостаточность организма. Кроме того, при получении предлагаемого препарата не применяется автоклавирование, а используются отходы биологической промышленности, полученные при культивировании клеток, которые на Курской биофабрике утилизируются.

Следовательно, способ получения предлагаемого препарата технологически прост, уменьшает экономические затраты и время на получение препарата по сравнению с известными аналогами.