способ диагностики ртутной энцефалопатии у мелких лабораторных животных

Формула изобретения

Способ диагностики ртутной энцефалопатии у мелких лабораторных животных путем исследования состояния центральной нервной системы животных контрольной и опытной групп после ингаляционного воздействия парами металлической ртути, отличающийся тем, что в срезах коры головного мозга при обзорной микроскопии определяют на единицу площади гистологического препарата на препаратах обеих групп количество неизмененных нейронов, на препаратах опытной группы общее количество нейронов и количество дистрофически измененных нейронов, вычисляют отношение количества неизмененных нейронов на препаратах опытной группы к таковому на препаратах контрольной группы (%) и долю дистрофически измененных нейронов от общего количества нейронов на препаратах опытной группы (%), при электронной микроскопии определяют площадь ядер нейронов на препаратах обеих групп и вычисляют увеличение площади ядер на препаратах опытной группы, и при снижении количества неизмененных нейронов на препаратах опытной группы относительно этого показателя в контрольной группе более 51%, возрастании на препаратах опытной группы доли дистрофически измененных клеток от общего числа нейронов более чем на 8,9%, увеличении площади ядра нейрона на препаратах опытной группы более чем на 50% от площади ядра на препаратах контрольной группы делают заключение о наличии ртутной энцефалопатии у животных, подвергшихся воздействию ртути.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, конкретно к экспериментальной медицине, и касается критериев диагностики токсической энцефалопатии у лабораторных животных.

В России, как и во всем мире, хроническая ртутная интоксикация занимает одно из ведущих мест среди профессиональных отравлений [9], а ртуть и ее соединения являются одним из приоритетных экотоксикантов [2, 13, 14]. Среди клинических проявлений хронической ртутной интоксикации токсическая энцефалопатия является одной из ведущих причин потерь трудоспособности. Данные последнего десятилетия показали, что и после прекращения контакта с нейротоксикантами в отдаленном постконтактном периоде нередко наблюдается прогрессирование нервно-психических нарушений [9]. Вместе с тем относительно невысокая эффективность существующих методов реабилитации больных определяет необходимость изучения механизмов развития патологических процессов в ткани мозга, что в клинических условиях зачастую неосуществимо. К сожалению, исследований, посвященных причинам и характеру структурно-морфологических поражений нервной ткани при нейроинтоксикациях, крайне мало. Центральное место в изучении существа и динамики патологического процесса в центральной нервной системе (ЦНС) занимают экспериментальные модели на животных; большое значение, при этом, имеют информативность и доступность методов оценки токсических поражений нервной ткани. При моделировании патологических процессов в нервной ткани, в том числе и токсических энцефалопатий, экспериментаторы отдают предпочтение грызунам, поскольку строение сосудов мозга, их топография, молекулярная и клеточная биология нервных клеток грызунов имеют высокую степень гомологичности с высшими млекопитающими и в частности с человеком.

Экспериментальное моделирование токсической энцефалопатии позволяет сформировать основные представления о морфофункциональных нарушениях мозга, эффективности реабилитационных мероприятий. Известны способы верификации повреждения головного мозга при экспериментальном моделировании энцефалопатии (острая постгеморрагическая и постгипоксическая энцефалопатии, токсическая энцефалопатия путем однократного введения фенилгидразина, либо многократного введения ацетата свинца в сочетании с сульфатом аммония), в основу которых положена регистрация нарушений условно-рефлекторной деятельности и поведенческой активности экспонированных животных [1, 5, 6, 7, 8, 11]. Прототипом является способ диагностики токсической энцефалопатии с регистрацией двигательных актов: количество и длительность актов «норка», актов «стойка с упором», «грумминг» и т.д. [4]. Однако данные способы оценки состояния ЦНС при токсической энцефалопатии не представляют объективную картину морфологических нарушений в ткани головного мозга белых крыс.

Задачей, решаемой данным изобретением, является разработка способа диагностики токсической энцефалопатии у мелких лабораторных животных для расширения арсенала и объективизации критериев и методов оценки патологического процесса в центральной нервной системе при моделировании токсической энцефалопатии.

Поставленная задача решается путем оценки морфометрических нарушений в нервной ткани головного мозга животных после проведения ингаляции ртутью.

Способ осуществляется следующим образом: набирают две группы животных - опытную и контрольную; производят ингаляционную затравку ртутью животных опытной группы; оценку состояния ЦНС животных осуществляют по данным гистологического исследования коры головного мозга при обзорной микроскопии и электронной микроскопии. При обзорной микроскопии на гистологических препаратах опытной и контрольной групп животных определяют количество неизмененных нейронов на единицу площади препарата, на гистологических препаратах опытной группы - общее количество нейронов на единицу площади препарата и количество дистрофически измененных нейронов, вычисляют отношение количества неизмененных нейронов на препаратах опытной группы к количеству неизмененных нейронов на препаратах в контрольной группе (%), долю дистрофически измененных нейронов от общего количества нейронов на препаратах опытной группы (%), при электронной микроскопии определяют площадь ядер нейронов на препаратах обеих групп и вычисляют увеличение (%) площади ядер в опытной группе. При снижении количества неизмененных нейронов на препаратах опытной группы по сравнению с этим показателем в контрольной группе до 50% и более, возрастании доли дистрофически измененных нейронов от общего числа нейронов в опытной группе более чем на 8,9%, увеличении площади ядра нейрона в опытной группе более чем на 50% от площади ядра в контрольной группе делают заключение о наличии энцефалопатии у животных.

Заявленный способ от прототипа отличается тем, что диагностику экспериментальной токсической энцефалопатии проводят с помощью микроскопирования образцов ткани головного мозга животных и оценки морфометрических показателей.

В литературе описаны изменения в ткани головного мозга животных при отравлении ртутью [10, 12]. В данном способе предлагаются количественные критерии морфометрических изменений, с помощью которых диагностируют ртутную энцефалопатию.

Таким образом, заявленное изобретение соответствует критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники. Предлагаемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость», так как оно может использоваться в экспериментальной медицине (токсикологии, фармакологии, патологической физиологии, патологической анатомии) для верификации моделирования патологических состояний центральной нервной системы животных.

Для верификации состояния токсической энцефалопатии исследуют кору головного мозга как нервный центр, деятельность которого обеспечивает регуляцию разнообразных функций организма и сложные формы поведения, к которому поступают сигналы от всех главных сенсорных образований.

Пример осуществления способа

Предлагаемый способ был применен в эксперименте на беспородных крысах в количестве 60 особей массой 180-240 г (опытная группа - 30 животных; контрольная группа - 30 животных).

Животных из опытной группы помещали на 4 часа в стандартную затравочную камеру, содержащую пары металлической ртути со средней концентрацией 0.61 мг/м³. Ингаляционную затравку проводили 5 раз в неделю в течение 7 недель.

Готовили послойные фронтальные, сагиттальные и горизонтальные срезы коры головного мозга и материал для электронной микроскопии из сенсомоторной зоны коры. Для этого животных опытной и контрольной групп декапитировали и производили отбор гистологического материала. Часть материала фиксировали в 10% нейтральном формалине. Затем заливали в парафин. Из залитых блоков изготавливали срезы ткани толщиной 5 мкм. Приготовленные срезы окрашивали гематоксилинэозином, и тионином по методу Ниссля. На гистологических препаратах коры головного мозга подсчитывали общую численную плотность нейронов, количество дистрофически измененных и нормальных нейронов в коре головного мозга. Плотность расположения нормальных нейронов и число поврежденных клеток определяли на единицу площади гистологического препарата (0,2 мм²). Дистрофическими считали гиперхромные клетки, у которых не отмечается четко выраженного ядра. Часть гистологического материала использовали для проведения электронной микроскопии с целью выявления ультраструктурных нарушений в нейронах головного мозга. Материал для электронной микроскопии размером 1×1 мм фиксировали в глутаровом альдегиде, затем обрабатывали OsO ₄ и заливали в аралдитовые смолы. При окраске проводили контрастирование уранилацетатом. В процессе микроскопии измеряли площадь ядер нейронов.

Показатели морфометрии нервной ткани животных опытной и контрольной групп. Med (Q ₂₅-Q₇₅) n=30

Группы	Количество неизмененных нейронов в 0,2 мм2	Число дистрофически измененных нейронов в 0,2 мм2	Общее количество нейронов в 0,2 мм2	Размер площади ядра нейронов в мкм2
Опытная	112	11	123	1,13
(104,0-128,0)	(9,0-16,0)	(113,0-144,0)	(1,0-1,25)
Контрольная	220	2	222	0,75
(180,0-240,0)	(1,0-3,0)	(181,0-243,0)	(0,7-1,0)

Показатели вычисляют по усредненным результатам:

отношение количества нормальных нейронов в препаратах опытной группы относительно к числу нейронов в препаратах контрольной группы:

;

доля дистрофически измененных нейронов от общего числа всех нейронов в препаратах опытной группы:

112+11=123 - общее число нейронов в опытной группе

;

доля дистрофически измененных нейронов от общего числа всех нейронов на препаратах контрольной группы:

площадь ядра клетки на препаратах опытной группы по сравнению с контролем:

1,13-0,75=0,38 мкм² - разность площадей ядер клеток в препаратах опытной и контрольной групп;

- увеличение площади ядер

В опытной группе по сравнению с результатами контрольной группы животных снижалось количество неизмененных нейронов, возрастало количество дистрофически измененных нейронов на единицу площади и отмечалось увеличение площади ядра нейрона (таблице).

Полученные результаты указывают на то, что при воздействии ртути в нейронах головного мозга развиваются процессы, свидетельствующие о дистрофически-дегенеративных изменениях: в тканях опытной группы животных после ингаляции парами металлической ртути количество неизмененных нейронов относительно к числу нейронов в препаратах контрольной группы снизилось до 50%; доля дистрофически измененных нейронов от общего числа всех нейронов в препаратах опытной группы возросла до 8,9%; площадь ядра клетки по сравнению с контролем увеличилась на 50%, что дает основание диагностировать у животных опытной группы токсическую энцефалопатию.

Предлагаемый способ диагностики расширяет арсенал методов оценки действия токсических веществ на организм лабораторных животных, повышает точность верификации токсической энцефалопатии, так как о развитии патологического процесса судят не по нарушениям видоспецифического поведения животных, лишь опосредованно свидетельствующим о функциональном состоянии центральной нервной системы, но непосредственно по морфометрическим изменениям ткани головного мозга, учитывая точки-мишени патологического процесса.

Литература

15. Горбунова Н.Б. Эпидермальный фактор роста в сыворотке крови и мозге крыс при некоторых видах токсических энцефалопатии./ Н.Б.Горбунова, В.С.Лукашевич, В.Н. Калюнов. // Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности. Под ред. В.Н.Гурина, В.А.Кульчицкого, В.Н.Никанорова. - Минск: Полибег, -1999. - 370 с.

16. Курляндский Б.А. Общая токсикология./ Б.А.Курляндский, В.А.Филов. - Москва: Медицина - 2002. - 607 с.

17. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. / А.Е Платонов. - М., 2000. - 52 с.

18. Способ диагностики отдаленной токсической энцефалопатии у экспериментальных животных: RU. 2383060 С2 10.05.2009.

19. Способ моделирования гипоксической энцефалопатии. RU 2253152 С2, 03.07.2003.

20. Способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии. RU 2257620 С1, 27.07.2005.

21. Способ моделирования постгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови. RU 2240604 С1, 20.11.2004.

22. Суслов Н.И. Патогенетическое обоснование психофармакологических эффектов препаратов природного происхождения: Автореферат дис. докт.мед.наук. - Томск, 1995.

23. Течение энцефалопатии в отдаленном периоде профессиональной ртутной интоксикации. / О.Л.Лахман, В.Г.Колесов, O.K.Андреева, П.В.Казакова и др. // Медицина труда и промышленная экология. - 2003. - № 3. - С.46-48.

24. Трахтенберг И.М. Хроническое воздействие ртути на организм. / И.М.Трахтенберг - Киев, изд-во «Здоров'я» - 1969. - 392 с.

25. Чехонин В.П., Лебедев С.В., Петров С.В. с соавт. / Моделирование фокальной ишемии головного мозга. // Вестник РАМН, 2004. - № 3. - С.47-54.

26. Eto Komyo, Takizawa Yukio, Akagi Hirokatsu. Differential Diagnosis between Organic and Inorganic Mercury Poisoning in Human Cases - The pathologic Point of View. Жур. Toxicologic Pathology. - 1999. - t 27, № 6. - р 664-671.

27. Diawara MM. Arsenic, cadmium, lead, and mercury in surface soils. Pueblo, Colorado: implication for population health risk. / Diawara MM, Litt JS, Unis D, Alfonso N, Martinez L, Crock JG, Smith DB, Carsella J. // Environ Geochem Health, 2006, Aug.

28. Futatsuka M. Long-term follow-up atudy of health status in population living in methylmercury-polluted area / Futatsuka M, Kitano T, Shono M, Nagano M, Wakamiya J, Miyamoto K, Ushijima K, Inaoka T, Fukuda Y, Nakagawa M, Arimura K, Osame M. // Environ Sci, 2005, Nov-Dec.