никотиноилгидразон димефосфона, обладающий противотуберкулезной активностью

Формула изобретения

1. Никотиноилгидразон димефосфона формулы (I):

2. Никотиноилгидразон димефосфона по п.1, обладающий противотуберкулезной активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области органической химии, в частности к синтезу новых химических соединений с практически полезными свойствами, конкретнее к новым производным известного лекарственного препарата - димефосфона. В данной заявке предлагается никотиноилгидразон димефосфона формулы I (название по системе ИЮПАК - никотиноилгидразон диметилового эфира 4-кето-2-метилпент-2-илфосфоновой кислоты):

,

обладающий низкой токсичностью и достаточно высокой противотуберкулезной активностью. Заявляемое соединение может найти применение в медицине и ветеринарии. Его свойства и способ получения в литературе не описаны.

Действующим веществом известного медицинского препарата «Димефосфон» является диметиловый эфир 4-кето-2-метилпент-2-илфосфоновой кислоты. Димефосфон обладает широким спектром биологической активности и низкой токсичностью [1. А.О.Визель, Р.С.Гараев. Новый аспект фармакологического подхода к соединениям фосфора. Димефосфон. Издательство «Печатъ-сервис-ХХ1-век», Казань, 2011, 189 с.]; [2. В.Г Малышев, И.В.Федоскин. Применение димефосфона в медицине (фармаколитические, патогенетические и клинические аспекты). М.: Наука. 2008, 172 с.]. Промышленный выпуск его осуществляется на КПФХО «Татхимфармпрепараты» в г.Казани. Препарат «Димефосфон» имеет широкую область применения в медицине. Он используется с 1983 года в качестве антиацидотического средства при ацидозах различной этиологии, вазоактивного средства при нарушениях мозгового кровообращения, при заболеваниях органов дыхания, препарат проявляет мембрано-стабилизирующие и противовоспалительные свойства, при наружном применении оказывает антисептическое действие, повышает защитные функции кожи и слизистых оболочек. У димефосфона обнаружены еще и кардиотропные, нейротропные, нейропротекторные, антигипоксические, противоаллергические, иммунокорригирующие, антиагрегатные, антиоксидантные и радиопротекторные свойства. Димефосфон предложен для лечения больных аутоиммунным тиреоидитом, для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, гнойного гайморита и других заболеваний. Димефосфон относится к фосфорсодержащим соединениям, но обладает не антихолинэстеразной активностью и используется как антидот [1], [2].

Сам димефосфон не обладает противотуберкулезной активностью. Более того, он несколько способствует росту микобактерий туберкулеза. При этом димефосфон снижает устойчивость микобактерий к антибиотику рифампицину и тем самым помогает лечению болезни [3. Патент РФ 2008902, опубл. 15.03.1994].

Туберкулез как болезнь остается большой угрозой, в то же время устойчивость микобактерий к лекарствам продолжает увеличиваться. Известно, что микобактерии отличаются сложным строением клеточной мембраны, препятствующей проникновению терапевтических агентов, существованием латентных, «дремлющих» форм, а также способностью вырабатывать резистентность. Поэтому, несмотря на усилия многочисленной армии исследователей во всем мире, в настоящее время задача поиска новых антитуберкулезных препаратов остается нерешенной. Это приводит к тому, что туберкулез занимает первое место в структуре смертности больных с инфекционными заболеваниями [4. В.В.Маньковский, Е.Г.Щекина. Туберкулостатики - сегодня и завтра. Провизор, 2002, 10]; [5. R.L.Hunter, L.Armitige, С.Jagannath, J.К.Actor. ТВ Research at UT-Houston - A review of cord factor: new approaches to drugs, vaccines and the pathogenesis of tuberculosis. Tuberculosis, 2009, vol. 89, SI, 18-25]; [6. J.E.Galagan, P.Sisk et al. ТВ database 2010: Overview and update. Tuberculosis, 2010, vol 90, 225-235]. [7. К.E.A.Lougheed, D.L.Taylo, S.A.Osborne, J.S.Bryans, R.S.Buxton. New anti-tuberculosis agents amongst known drugs. Tuberculosis, 2009, vol 89, S1, 5-9.]

Особую угрозу для больных представляют резистентные и мультирезистентные штаммы (MDR-штаммы), которые устойчивы к одному из лекарств или одновременно к нескольким лекарственным препаратам. Заболевания, вызванные MDR-штаммами М. tuberculosis, имеют остро прогрессирующий характер и плохо поддаются лечению существующими препаратами, поэтому и с этой точки зрения необходим поиск новых соединений обладающих противотуберкулезной активностью.

По рекомендации ВОЗ основу антимикобактериальной терапии составляет специальный направленный краткосрочный курс химиотерапии, ключевыми противотуберкулезными препаратами которого являются изониазид, рифампицин, пиразинамид, стрептомицин и этамбутол. Однако необходимо иметь в виду факторы, ограничивающие применение существующих терапевтических средств: (1) устойчивость некоторых штаммов микобактерий к применяемым противотуберкулезным препаратам, в том числе и к изониазиду; (2) серьезные побочные эффекты, вызываемые при продолжительном лечении данными препаратами; и (3) отсутствие эффективного лечения туберкулеза у ВИЧ-инфицированных пациентов [8. R.С.Goldman, В.Е.Laughon. Discovery and validation of new antitubercular compounds as potential drug leads and probes // Tuberculosis. 2009, vol 89, 331-333]; [9. D.A.Mitchison, P.B.Fourie. The near future: Improving the activity of rifamycins and pyrazinamide // Tuberculosis 2010, vol 90, 177-181].

Существует большое количество противотуберкулезных препаратов, и их современная классификация основана на эффективности их влияния на возбудителя: наиболее эффективные препараты: изониазид и антибиотик рифампицин; препараты средней эффективности: антибиотики стрепомицин, канамицин, флоримицин, циклосерин и химиопрепараты этамбутол, этионамид, протионамид, пиразинамид, а также препараты умеренной эффективности: пара-аминосалициловая кислота и тибон.

Кроме монотерапии широкое распространение получили комбинированные методы лечения туберкулеза, когда используют смеси нескольких противотуберкулезных препаратов или добавляют вещества, сами не обладающие антитуберкулезной активностью, но дающие положительный эффект, например, за счет снижения токсичности или за счет других факторов [10. А.М.Ginsberg. Tuberculosis drug development: Progress, challenges, and the road ahead. Tuberculosis, 2010, vol 90, 162-167].

Несмотря на наличие большого количества противотуберкулезных средств, изониазид (или тубазид), представляющий собой гидразид изоникотиновой кислоты, является лучшим из существующих препаратов. Он входит в состав практически всех схем профилактики и лечения туберкулеза животных и людей [10], [11. М.Д.Машковский. Лекарственные средства. Т.2. Харьков, 1998, 331-333]; [12. Ю.И.Смолянинов, Н.Н.Кощеев Специфическая профилактика туберкулеза у молодняка крупного рогатого скота. // Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ. - Омск, 2001: Инфекционная патологи животных, 168-170].

Учитывая высокую антитуберкулезную активность изоиниазида, среди его производных, в том числе и среди изоникотиноилгидразонов, полученных на его основе, широко проводится поиск новых препаратов. Из них лучшие имеют общую формулу (II). Например, фтивазид (IIa), салюзид IIб), ИНГА-17 (IIв) и ларусан (IIг), содержащие при терминальном атоме азота гидразидного фрагмента остаток соответствующего карбонильного соединения:

фтивазид (IIа), R¹=Н, R ²=4-НО-3-Н₃СОС₆Н₃;

салюзид (IIб), R¹=H, R²=2-НООС-3,4-(H ₃CO)₂C₆H₂;

ИНГА-17 (IIв), R¹=Н, R²=4-H₃ C(=O)NHC₆H₄;

ларусан (IIг), R¹=СН₃, R²=-CH-CH-Furyl-2

Фтивазид (IIа), салюзид (IIб), ИНГА-17 (IIв) и ларусан (IIг) ранее были предложены как антитуберкулезные препараты с меньшей токсичностью, чем у изониазида [11]. Однако с уменьшением токсичности у приведенных производных изониазида IIа-г уменьшилась и антитуберкулезная активность и наибольшее применение из них получил только фтивазид (IIа), близкий по активности к изониазиду. Например, для ларусана МИК составляет 1.57 мкг/мл [13. Г.П.Беспамятное, Ю.А.Кротов, Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Ленинград, «Химия», Ленинградское отделение, 1985, с.157] по сравнению с 0.1-0.6 мкг/мл для изониазида. Для фтивазида МИК оценивается около 1 мкг/мл, а токсичность его менее 100 мг/кг [14. А.В.Сыроешкин, Н.А.Степанова, П.И.Попов, А.В.Балышев, Т.В.Плетнева. Прогнозирование токсичности химических соединений группы противотуберкулезных лекарственных средств методом количественных корреляций структура-активность // Судебно-медицинская экспертиза, 2009, № 4, 28-31].

Изониазид продолжает широко использоваться в химиотерапии туберкулеза, хотя он и является токсичным препаратом, а некоторые штаммы, например H₃₇R_V, быстро приобретают резистентность к нему. Так С.П. Булавин относит его к высокотоксичным соединением (для мышей - ЛД₅₀ равна 178.0±6.79 мг/кг массы) [15. С.П.Булавин. Фармакологическая характеристика тубазида. // Бюлл. ВИЭВ. М., 1982. Вып.48, с.61-62], а в справочнике Г.П.Беспамятнова и Ю.А.Кротова токсичность изониазида оценивается как LD₅₀ 150 мг/кг [13].

Известно, что изониазид и его производные IIа-г, используемые для профилактики и лечения туберкулеза, не только токсичны, но и не свободны от ряда побочных эффектов [15], [16. A.Lee, et al. Novel mutations in isoniazidresistant Myco-bacterium tuberculosis isolate // Antimicrob Agents Chemother, 2001, vol. 145, 2157-2159]; [17. Isoniazid. Tuberculosis 2008, vol 88, n 2, 112-116]. Как фармакологические средства они способны вызывать изменение показателей обмена веществ и структурно-функционального состояния органов и систем, а при передозировке могут приводить к отравлениям и даже к летальному исходу. Важно отметить, что токсичность изониазида связана в основном с его метаболитами [18. Н.П.Скакун, В.В.Шманько. Сущность гепатотоксического действия изониазида // Врачебное дело, 1984, № 1, 49-52]. Поэтому синтез аналогов изониазида, возможно, с другим типом метаболизма, приводящим к снижению токсичности, вызывает особый интерес и является перспективной задачей, например замена производных изоникотиновой кислоты на производные никотиновой кислоты.

В отличие от изониазида (гидразида изоникотиновой кислоты) его изомер по структуре гетероцикла - гидразид никотиновой кислоты и его производные, в том числе гидразоны, которые можно получить на его основе, практически не изучены на предмет выявления среди них веществ с антитуберкулезной активностью. По-видимому этому способствовали первые сообщения об отсутствии таких свойств у гидразида никотиновой кислоты и путаница с названиями производных двух изомерных кислот.

Задача изобретения - новое химическое соединение, производное гидразида никотиновой кислоты, обладающее противотуберкулезным действием, расширяющего арсенал известных средств указанного назначения.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в синтезе нового малотоксичного вещества, обладающего достаточно высокой противотуберкулезной активностью.

Технический результат достигается предлагаемым новым соединением, а именно никотиноилгидразоном димефосфона формулы I.

Сущность способа получения заявляемого соединения заключается во взаимодействии гидразида никотиновой кислоты с димефосфоном.

Синтез предлагаемого никотиноилгидразона димефосфона I проводится в соответствии со следующей схемой:

Для лучшего понимания изобретения приводим пример получения заявляемого соединения I и результаты исследования его структуры различными физико-химическими методами, а также результаты изучения токсичности и антитуберкулезной активности.

Пример конкретного выполнения:

Никотиноилгидразон димефосфона (Никотиноилгидразон диметилового эфира 4-кето-2-метилпент-2-илфосфоновой кислоты, I)

Смесь 7.59 г (0.036 моль) диметилового эфира 3-кето-2-метилпент-2-ил-фосфоновой кислоты (димефосфона), 5.0 г (0.036 моль) гидразида никотиновой кислоты, 100 мл бензола и 0.01 г серной кислоты кипятят 2 часа с обратным холодильником и насадкой Дина-Старка. После прекращения выделения воды горячий раствор отфильтровывают и маточный раствор охлаждают. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают небольшим количеством бензола и сушат 12 часов при температуре 40-50°C. Получают 10.4 г (87.7%) никотиноилгидразона димефосфона (I) в виде светло-бежевых мелких кристаллов с т.пл. 134-136°C (нагревательный столик типа Боэтиуса). Кристаллы никотиноилгидразон димефосфона (I) хорошо растворимы в воде и в спиртах.

Найдено, %: C 51.23, 51.31; H 6.87, 6.84; N 12.58, 12.62; Р 9.37, 9.29. C₁₄H₂₂N₃O₄P. Вычислено, %: C 51.37; H 6.77, N 12.84, Р 9.46.

Чистоту полученных образцов контролировали методом ТСХ на пластинках «Silufol». Структура никотиноилгидразона димефосфона установлена с использованием нескольких физико-химических методов и рентгеноструктурного анализа:

ИК, FT-IR spectrometer "Vector-22" (Bruker), вазелин, см^-1: 3222, 3206, 1681, 1615 сл, 1586 сл, 1539, 1446, 1414, 1331 сл, 1294, 1276, 1251 сл, 1225, 1184, 1173,1152, 1121 сл, 1085 сл, 1054, 1033,

ЯМР спектры, Bruker «Avans 400», , м.д.; J, Гц, ДМСО-d₆:

¹H: 1-17 д (6 Н, >CMe₂, 17.1), 2.01 c (3H,=CMe), 2.52 шир с (2H, >СН₂, 12.3), 3.69 д (6H, ОМе, 9.8), 8.98 с (1H, 2Н в Ру), 8.72 шир с (1H, 6Н в Ру), 8.17 шир с (1H, 4Н в Ру), 7.51 шир с (1H, 5Н в Ру), 10.67 с (1H, NH);

³¹P 38.1.

На фигуре 1 представлена геометрия молекул никотиноилгидразона димефосфона в кристалле.

Проведенное изучение строения и химических свойств никотиноилгидразона димефосфона показало, что в кристаллах его молекулы существуют в одной геометрической форме относительно кратной связи C=N гидразонного фрагмента и в виде одного конформера относительно амидной связи C(=O)-N. В растворах, например в ДМСО, наблюдается появление небольшого количества второго амидного конформера, не более 2-4%. Наличия возможных азоизомеров и енгидразинных таутомеров не обнаружено.

Заявляемое по данному изобретению новое соединение I четко отличается от описанных аналогов IIа-г наличием в своей структуре 2-диметоксифосфорил-2-метилпент-4-илиденового и 3-никотиноильного фрагментов.

Изучение бактериостатической активности полученного никотиноилгидразона димефосфона (I) в отношении микобактерий туберкулеза штамма H₃₇Rv проводили в Казанском тубдиспансере министерства здравоохранения Республики Татарстан, используя стандартную радиометрическую ростовую систему ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson).

Содержимое пробирки MGIT - это питательный бульон, благодаря которому достигается ускоренный рост микобактерий. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9, в который перед использованием вносится обогатительная добавка ВАСТЕС MGIT OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза и каталаза). Для предотвращения контаминации необходимо добавить MGIT PANTA.

Кроме жидкой среды в пробирке содержится бескислородный флюорохром - пентагидрат трис-4,7-дифенил-1,10-фенантролин хлорид рутения, помещенный на дно пробирки и покрытый силиконом. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода прекращается ингибирование флюорохрома. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки УФ-светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста (GU). Система ВАСТЕС MGIT 960 расценивает пробирку как положительную, если количество живых микроорганизмов в ней достигло 100000 на 1 мл среды (GU>75). Пробирка инкубируется при температуре 37 градусов с последующим анализом.

Для определения бактериостатического действия никотиноилгидразона димефосфона (I) готовили исходные растворы в воде и добавляли в пробирки MGIT в количествах, обеспечивающих получение конечной концентрации 0.1 мг/мл среды.

Суспензию микобактерий туберкулеза штамма H₃₇Rv в количестве 1 мкг добавляли в каждую из исследуемых пробирок. В качестве контроля использовали индивидуальные пробирки со средой радиометрической системы ВАСТЕС MGIT 960 с культурой микроорганизмов без содержания химических соединений, а также с физиологическим раствором. Для сравнения проводили аналогичные исследования с туберкулостатиком первого ряда - изониазидом. МИК использованного образца изониазида составил 0.5 мкг/мл. Все пробирки инкубировали при 37°C в приборе. Наличие или отсутствия роста микобактерий прибор регистрировал ежедневно в течение 11 суток. Результаты анализа бактериостатического действия заявляемого соединения на приборе ВАСТЕС MGIT 960 приведены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 следует, что заявляемое соединение I обладают выраженным бактериостатическим действием в отношении микобактерий в достаточно низкой концентрации - 1 мкг/мл водного раствора. В этой концентрации никотиноилгидразон димефосфона (I) полностью подавляет рост возбудителей туберкулеза в течение 6 суток и только на седьмые сутки рост микобактерий достигал отметки 10 GU.

В контрольных пробирках № 1 (среда с содержанием микобактерий туберкулеза) и № 2 (среда с добавлением физиологического раствора и микобактерий туберкулеза) отмечался обильный рост микобактерий уже на 2 сутки, на 3 сутки он достигал отметки 216 GU и 116 GU соответственно.

По результатам исследования заявляемого соединения на ВАСТЕС MGIT 960 концентрацию - 1 мкг/мл водного раствора можно принять за минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) никотиноилгидразона димефосфона (I).

Изучение токсического действия никотиноилгидразона димефосфона (I) проводили на белых беспородных мышах и на крысах при внутрибрюшинном способе введения [20. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ». М.: Медицина. 2005. Под ред. Р.У.Хабриева]. Пяти группам животных (по 6 животных в каждой) вводили водные растворы препаратов, приготовленные стерильно непосредственно перед введением. Соединение I вводили в разных дозах, после чего вели наблюдение за поведением животных, регистрировали число погибших. Результаты исследований обрабатывали по методу Беренса [21. Л.М.Беленький. «Элементы количественной оценки фармакологического эффекта». Л., 1963].

Параметры токсичности никотиноилгидразона димефосфона (I) на мышах приведены в табл.2 и на фиг.2, на крысах - в табл.3 и фиг.3, соответственно. Острая токсичность заявляемого никотиноилгидразона димефосфона (I) составила ЛД₅₀ 1788±31 мг/кг для мышей и ЛД₅₀ 2326±48 мг/кг для крыс.

Таким образом, заявляемый никотиноилгидразон димефосфона (I) более чем в 10-15 раз менее токсичен по сравнению с изониазидом, к тому же он очень хорошо растворим в воде. Никотиноилгидразон димефосфона (I) очень немного уступает по противотуберкулезной активности изониазиду, но несколько превосходит его по широте действия (в данном случае соотношение «токсичность - минимальная ингибирующая концентрация соединения», LD₅₀/MHK). У используемого в качестве контроля образца изониазида это соотношение составляет около 200, а у никотиноилгидразона димефосфона (I) - около 2000. Кроме того, заявляемое соединение превосходит другой антитуберкулезный препарат первого ряда - пиразинамид (МИК=12 мкг/мл).

Таблица 1.
Результаты анализа бактериостатической активности никотиноилгидразона димефосфона (I) и изониазида (контроль) на приборе ВАСТЕС MGIT 960 с использование штамма H37Rv
Вещество	Концентрация мкг/мл	Сутки
3	4	7	8	9	10	11	41
Никотиноилгидразон димефосфона (I)	0.1	2	10	15	15	22	28	35+	-
0.5	0	5	15	18	27	30	30+	-
1.0	0	2	10	14	24	25	25	25
5.0	0	0	2	11	15	15	15	15
10.0	0	0	2	10	15	15	15	15
20.0	0	0	5	5	5	5	5	5
изониазид	0.1	2	10	15	25	29	30+	-	-
0.5	0	5	10	15	15	15	15	15
1.0	0	0	5	5	5	5	5	5

Таблица 2.
Параметры токсичности никотиноилгидразона димефосфона (I) при испытании на мышах
дозы	фактический результат	«накопленные частоты»	% смертности
погибло	выжило
1600	0	6	0	14	0
1700	2	4	2	8	20,0
1800	3	3	5	4	55,6
1900	5	1	10	1	90,9
2000	6	0	16	0	100

Таблица 3.
Параметры токсичности никотиноилгидразона димефосфона (I) при испытании на крысах
дозы	фактический результат	«накопленные частоты»	%
погибло	выжило	смертности
1800	0	6	0	16	0
2000	1	5	1	10	9,1
2200	3	3	4	5	44,4
2400	4	2	8	2	80,0
2600	6	0	14	0	100