состав среды для культивирования растений семейства рясковые (wolffia arrhiza) в условиях in vitro

Формула изобретения

Состав среды для культивирования растений семейства Рясковые (Wolffia arrhiza) в условиях in vitro, включающий фосфат калия монозамещенный - KH₂PO₄, четырехводный нитрат кальция - Са(NO₃)₂·4H₂ O, нитрат калия - KNO₃, семиводный сульфат магния - MgSO₄·7H₂O, двуводный молибдат натрия - Na₂MoO₄·2H₂O, семиводный сульфат цинка - ZnSO₄·7H₂O, двунатриевый дигидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты - Na₂ЭДTA·2H ₂O, пятиводный сульфат меди - CuSO₄·5H ₂O, борную кислоту -Н₃ВО₃ и сахарозу, отличающийся тем, что дополнительно содержит калия йодид - KJ, шестиводный кобальта хлорид - CoCl₂·6H₂ O, аспарагин, глутамин, тиамин, пиридоксин, аскорбиновую кислоту, мезоинозит, семиводный сульфат железа - FeSO₄·7H ₂O и пятиводный сульфат марганца - MnSO₄·5H ₂O при следующем содержании компонентов, мас.%:

KH2PO4	1,044-1,050
Ca(NO3)2·4H2O	3,90-4,00
KNO3	1,60-1,68
MgSO4 ·7H2O	1,20-1,26
FeSO4·7H2О	0,040-0,046
Na2ЭДTA·2H2O	0,059-0,067
KJ	0,0035-0,0051
Na2 MoO4·2H2O	0,00048-0,00060
ZnSO4·7H2O	0,00012-0,00022
CuSO4·5H2O	0,00014-0,00022
MnSO4·5H2O	0,0023-0,0027
H3BO3	0,011-0,017
CoCl2·6H2O	0,00060-0,00084
Аспарагин	0,22-0,28
Глутамин	0,35-0,45
Тиамин	0,0010-0,0016
Пиридоксин	0,009-0,017
Аскорбиновая кислота	0,041-0,049
Мезоинозит	1,31-1,39
Сахароза	Остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для производства как высокобелковых кормов в отраслях кормопроизводства, так и разнообразных белковых препаратов в фармацевтике и ветеринарии.

При культивировании растений семейства рясковых (разные виды Lemna, Wolffia, Spirodela) в условиях in vitro рядом исследователей рекомендованы среды, составленные по прописям Мурасиге-Скуга (наиболее универсальная среда) (Воинов Н.А. и др. 2009), Гамборга, Шенка-Хильдебрандта (Schenk and Hildebrandt, 1972; Gamborg et al., 1968; Boehm et al., 2001; Kruse et al., 2001; Li J. et al., 2004; Friedrich A.S., 2005).

Наиболее распространенными средами для водных и песчаных культур являются среды, составленные по прописям Кнопа, Стейнберга и Хогланда-Арнона (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973; Steinberg, R., 1946; Knop, 1865; Hoagland and Arnon., 1938) и имеющие более низкое, по сравнению с вышеупомянутыми, содержание минеральных веществ. Все указанные среды разработаны для культивирования широкого круга растений, поэтому не в полной мере удовлетворяют индивидуальным потребностям в элементах питания отдельно взятого объекта, что не позволяет максимально реализовать его потенциальную биологическую продуктивность.

Наиболее близкими по биологической сущности к изобретению являются среда Хогланда-Арнона (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973; Hoagland and Arnon., 1938), включающая в свой состав следующие компоненты, мас.%:

KН2РO4	0,45
Ca(NO 3)2×4Н2O	3,60
KNO 3	1,67
MgSO4 ×7H2O	1,63
FeCl 3×6H2O	6,42
Nа 2ЭДТА×2Н2O	19,89
Na 2MoO4×2H2O	0,0003
ZnSO 4×7H2O	0,0007
CuSO 4×5H2O	0,0003
MnCl 2×4H2O	0,006
H 3BO3	0,009
Сахароза	Остальное

К недостаткам указанной среды для культивирования водных растений относятся: несбалансированность минерального питания для индивидуальных потребностей Wolffia arrhiza и практически полное отсутствие органических элементов питания за исключением сахарозы.

Задача изобретения - повышение биологической продуктивности Wolffia arrhiza за счет оптимизации содержания элементов питания в культивационной среде.

Поставленная задача достигается изменением баланса минеральных элементов в питательном растворе, заменой некоторых минеральных элементов и включением в раствор дополнительных как минеральных, так и органических компонентов. Для этого среда, включающая фосфат калия монозамещенный - KН₂РO ₄, четырехводный нитрат кальция - Ca(NO₃) ₂×4Н₂O, нитрат калия - KNO₃, семиводный сульфат магния - MgSO₄×7H₂ O, двуводный молибдат натрия - Na₂MoO₄×2H ₂O, семиводный сульфат цинка - ZnSO₄×7H ₂O, двунатриевый дигидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты - Na₂ЭДТА×2Н₂O, пятиводный сульфат меди - CuSO₄×5H₂O и борную кислоту - Н₃ВO₃, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит калия йодид -KI, шестиводный хлорид кобальта - СоСl ₂×6Н₂O, аспарагин, глутамин, тиамин, пиридоксин, аскорбиновую кислоту, мезоинозит, семиводный сульфат железа - FeSO₄×7H₂O и пятиводный сульфат марганца - MnSO₄×5H₂O, при следующем содержании компонентов, мас.%:

KН2РO4	1,044-1,050
Ca(NO3)2×4Н2O	3,90-4,00
KNO3	1,60-1,68
MgSO4 ×7H2O	1,20-1,26
FeSO4×7H2O	0,040-0,046
Na2ЭДТА×2H2O	0,059-0,067
KI	0,0035-0,0051
Na2 MoO4×2H2O	0,00048-0,00060
ZnSO4×7H2O	0,00012-0,00022
CuSO4×5H2O	0,00014-0,00022
MnSO4×5H2O	0,0023-0,0027
H3BO3	0,011-0,017
СоСl2×6H2O	0,00060-0,00084
Аспарагин	0,22-0,28
Глутамин	0,35-0,45
Тиамин	0,0010-0,0016
Пиридоксин	0,009-0,017
Аскорбиновая кислота	0,041-0,049
Мезоинозит	1,31-1,39
Сахароза	Остальное

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав раствора отличается от известных по содержанию всех компонентов, ионной формой ряда компонентов и введением новых компонентов. Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию «новизна». Разработанная среда обеспечила многократное повышение продуктивности Wolffia arrhiza по целому комплексу показателей, таких как: прирост биомассы популяции, содержание тотального белка в 100 мг сырой массы и процентное содержание белка в сухой массе, обеспечивая при этом достаточно высокий показатель содержания сухого вещества, и не вызывая видимых физиологических отклонений в архитектонике растения. Наиболее важный показатель - выход тотального белка с популяции - также превосходит аналогичный показатель при культивировании Wolffia arrhiza на ранее известных аналогах сред. Таким образом, данный состав компонентов среды действительно увеличивает продуктивность объекта, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «существенные отличия».

Для экспериментальной проверки заявляемого состава были подготовлены 4 варианта: прототип (среда Хогланда-Арнона (Hg)) и 3 варианта заявляемой среды (W3M«1» - среда составлена по наименьшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, W3M«2» - среда составлена по средним величинам из заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, W3M«3» - среда составлена по наибольшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов).

Смеси получили простым смешиванием. Среды готовили из концентрированных маточных растворов стандартной компоновки (Шевелуха B.C., 1998):

Раствор	Методика приготовления раствора	Количество раствора в мл/л среды
W3M«1»	W3M«2»	W3M«3»
Раствор четырехводного нитрата кальция	В 80 мл дистиллированной воды добавляют 23,6 г Ca(NO3 )2×4Н2O. Полученный раствор доводят дистиллированной водой до кондиционного объема в 100 мл	3,63	3,7 0	3,77
Раствор макроэлементов	В 400 мл дистиллированной воды добавляют:	18,2	20,0	21,8
KNO 3	9,2 г
MgSO4×7H2O	6,7 г
KН2РO4	5,8 г
Полученный раствор доводят дистиллированной водой до кондиционного объема в 500 мл
Раствор микроэлементов	В 100 мл дистиллированной воды добавляют:	0,9	1,0	1,1
MnSO4×7H2O	0,18 г
Н3ВО3	0,31 г
ZnSO4×7H2O	0,037 г
KI	0,096 г
CuSO4×5H2O	0,0038 г
Na2MoO4×2H2O	0,012 г
СоСl2×6Н2O	0,016 г
Раствор хелата железа	1. Растворяют в 400 мл дистиллированной воды: 2,8 г FeSO 4×7H2O.	1,77	1,95	2,13
2. Растворяют в 100 мл дистиллированной воды: 3,73 г Na2 ЭДТА×2H2O.
3. Оба раствора смешивают и нагревают на водяной бане до константного состояния смеси.
Раствор органических веществ	В 100 мл дистиллированной воды добавляют:	0,9	1,0	1,1
Тиамин	0,03 г
Пиридоксин	0,3 г
Аскорбиновая кислота	1,0 г
Вещества, добавляемые в виде сухих препаратов	Количество вещества в г/л среды
Мезоинозит	0,29	0,3	0,31
Глутамин	0,0782	0,0894	0,1006
Аспарагин	0,0488	0,0555	0,0622
Сахароза	20,06	20,0	19,94

Растения помещали на жидкие питательные среды в количестве 100 растений в одну колбу общим объемом 500 мл в трехкратной повторности для каждого из вариантов. Объем среды в каждой колбе составлял 300 мл, культивацию осуществляли на шейкере при 90 об/мин. Учетный период - 1 месяц со дня посадки.

Среда	Биомасса популяции в г	Масса тотального белка в мкг/100 мг сырой массы	Масса белка популяции в мг	Содержание сухого вещества в %	Белка в сухом веществе в %
W3M «1»	11,72	1471,22	170,89	4,5	32,9
W3M «2»	19,05	1813,20	392,15	4,9	40,1
W3M «3»	13,48	1435,65	193,14	4,6	31,6
Hg	6,99	846,13	58,97	3,9	22,1

Приведенные в таблице данные по результатам дисперсионного анализа показали наличие достоверных различий фактора на 95% уровне значимости.

Из таблицы следует, что заявляемая среда существенно превосходит по всем показателям продуктивности прототип. Также полученные данные свидетельствуют о том, что при использовании граничных значений заявляемых допустимых интервалов масс компонентов происходит снижение продуктивности Wolffia arrhiza по всем показателям в связи с дефицитом либо избытком элементов питания в среде.

Источники информации

1. Воинов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В., Маркова С.В., Франк Л.А., Шишацкая Е.И. Современные проблемы и методы биотехнологии / Учеб. пособие. - Красноярск, ИПК СФУ, 2009. - 418 с.

2. Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. (1973). Краткий справочник по физиологии растений. Изд 2, испр., доп. - Киев: Наукова думка. - 590 с.

3. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха, С.В. Калашникова, Е.З. Кочиева [и др.]. - М.: Высш. шк., 1998. - 416 с.

4. Boehm R., Kruse С., Voeste D., Barth S. and Schnabl H. (2001) A transient transformation system for duckweed (Wolffia columbiana) using Agrobacterium-mediated gene transfer. J Appl Bot 75:107-111.

5. Friedrich A.S. (2005). Untersuchungen zu Kultivierung, Transformation und Fermentation von Wolffia spec. - Inaugural - Dissertation. - 177 s.

6. Gamborg O.L., Miller R.A. and Ojima K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50, 151-158.

7. Gamborg O.L., Constabel F., La Rue, T.A.G., Miller R.A. & Steck W. (1971). The influence of hormones on secondary metabolite formation in plant cell cultures. In Les Cultures de Tissas de Plantes, pp.335-44. Paris: Centre National de la Recherche Scientifique.

8. Hoagland D.R. and Arnon D.I. (1938). The water-culture method for growing plants without soil Univ. Calif. Coll. Agric. Exp. Sta. Circ. Berkeley, CA 347-353.

9. Knop W. (1865). Quantitative Utersuchungen Über den ErnährungensprozeB der Pflanze. Landw. Versuchssat. 7:93.

10. Knop W. (1865) Arbeiten aus dem Laboratorio der Versuchs-Station zu Moecern. Die Landwirtschaftlichen Versuchs-Stationen 7: 436-450.

11. Kruse C., Boehm R., Voeste D., Barth S. and Schnabl H. (2001). Transient transformation of Wolffia columbiana by particle bombardment. Aquatic Bot 72:175-181.

12. Li J., Jain M., Vunsh R., Vishnevetsky J., Hanania U., Flaishman M., Perl A., Edelman M. Callus induction and regeneration in Spirodela and Lemna // Plant Cell Rep (2004) 22:457-464.

13. Steinberg R., 1946: Mineral requirement of Lemna minor. Plant Physiology, 21, 42-48.