способ удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор vii

Формула изобретения

1. Способ очистки жидкой композиции, содержащей рекомбинантный фактор VII, от вирусов, отличающийся тем, что указанная композиция содержит один или более рекомбинантных полипептидов фактора VII, причем по меньшей мере 5% указанного одного или более рекомбинантных полипептидов фактора VII находится в активированной форме, при котором осуществляют нанофильтрацию указанного раствора, с использованием нанофильтра с размером пор максимум 80 нм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере 7% или по меньшей мере 10% одного или более рекомбинантных полипептидов фактора VII находится в активированной форме.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что активированная форма рекомбинантного полипептида фактора VII составляет 5-70%, 7-40% или 10-30% от массы одного или более чем одного полипептида фактора VII.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что активированная форма рекомбинантного полипептида фактора VII составляет 50-100%, 70-100% или 80-100% от массы одного или более чем одного рекомбинантного полипептида фактора VII.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что активированная форма рекомбинантного полипептида фактора VII составляет 20-80%, 30-70% или 30-60% от массы одного или более чем одного рекомбинантного полипептида фактора VII.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что жидкая композиция имеет pH в интервале 7,0-9,5, в интервале 7,6-9,4, в интервале 7,7-9,3, в интервале 8,0-9,0 или в интервале 8,3-8,7.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация рекомбинантного полипептида(ов) фактора VII в жидкой композиции находится в интервале 0,01-5 мг/мл или в интервале 0,05-2,0 мг/мл.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что размер пор нанофильтра составляет максимум 50 нм, максимум 30 нм или находится в интервале 10-30 нм.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют нанофильтр, мембрана которого изготовлена из одного или нескольких материалов, выбранных из медноаммиачной целлюлозы, гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF), комбинированного PVDF, поверхностно-модифицированного PVDF и полиэфирсульфона.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют жидкую композицию рекомбинантного фактора VII, полученную из надосадочной жидкости клеточной культуры.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что жидкая композиция, по существу, не содержит сыворотки.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что рекомбинантный полипептид фактора VII является продуцированным клеточной культурой в присутствии бычьей сыворотки или фетальной сыворотки теленка.

13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что рекомбинантный полипептид фактора VII продуцирован клеточной культурой в клетках СНО.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что рекомбинантный полипептид фактора VII продуцирован клеточной культурой в клетках СНО, в среде, не содержащей каких-либо компонентов животного происхождения.

15. Способ очистки жидкой композиции, содержащей рекомбинантный фактор VII, от вирусов, где указанная композиция содержит один или содержит сыворотки, при котором осуществляют нанофильтрацию указанного раствора с использованием нанофильтра с размером пор максимум 80 нм.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что используют жидкую композицию рекомбинантного фактора VII, полученную из надосадочной жидкости клеточной культуры.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что рекомбинантный полипептид фактора VII продуцирован клеточной культурой в клетках СНО.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что рекомбинантный полипептид фактора VII продуцирован клеточной культурой в клетках СНО, в среде, не содержащей каких-либо компонентов животного происхождения.

19. Способ по п.15, отличающийся тем, что по меньшей мере 5% указанного одного или нескольких рекомбинантных полипептидов фактора VII находится в активированной форме.

20. Способ по п.15, отличающийся тем, что жидкая композиция имеет pH в интервале 7,0-9,5, в интервале 7,6-9,4, в интервале 7,7-9,3, в интервале 8,0-9,0 или в интервале 8,3-8,7.

21. Способ по п.15, отличающийся тем, что концентрация рекомбинантного полипептида фактора VII в жидкой композиции находится в интервале 0,01-5 мг/мл или в интервале 0,05-2,0 мг/мл.

22. Способ по п.15, отличающийся тем, что размер пор нанофильтра составляет максимум 50 нм, максимум 30 нм или находится в интервале 10-30 нм.

23. Способ по любому из пп.15-22, отличающийся тем, что используют нанофильтр, мембрана которого изготовлена из одного или нескольких материалов, выбранных из медноаммиачной целлюлозы, гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF), комбинированного PVDF, поверхностно-модифицированного PVDF и полиэфирсульфона.

24. Способ очистки жидкой композиции, содержащей рекомбинантный фактор VII, от вирусов, где указанная композиция содержит один или более рекомбинантных полипептидов фактора VII, при котором осуществляют нанофильтрацию указанного раствора с использованием нанофильтра с размером пор максимум 80 нм, причем указанный нанофильтр имеет мембрану, изготовленную из одного или нескольких материалов, выбранных из медноаммиачной целлюлозы, гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF), комбинированного PVDF, поверхностно-модифицированного PVDF и полиэфирсульфона.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что материал нанофильтра выбран из материалов на основе поливинилиденфторида и материалов на основе полиэфирсульфона.

26. Способ по п.24, отличающийся тем, что по меньшей мере 5% указанного одного или более рекомбинантных полипептидов фактора VII находится в активированной форме.

27. Способ по п.24, отличающийся тем, что жидкая композиция имеет pH в интервале 7,0-9,5, в интервале 7,6-9,4, в интервале 7,7-9,3, в интервале 8,0-9,0 или в интервале 8,3-8,7.

28. Способ по п.24, отличающийся тем, что концентрация рекомбинантного полипептида фактора VII в жидкой композиции находится в интервале 0,01-5 мг/мл или в интервале 0,05-2,0 мг/мл.

29. Способ по п.24, отличающийся тем, что размер пор нанофильтра составляет максимум 50 нм, максимум 30 нм или находится в интервале 10-30 нм.

30. Способ по п.24, отличающийся тем, что используют жидкую композицию рекомбинантного фактора VII, полученную из надосадочной жидкости клеточной культуры.

31. Способ по п.24, отличающийся тем, что жидкая композиция, по существу, не содержит сыворотки.

32. Способ по п.24, отличающийся тем, что рекомбинантный полипептид фактора VII продуцирован клеточной культурой в присутствии бычьей сыворотки или фетальной сыворотки теленка.

33. Способ по любому из пп.24-32, отличающийся тем, что рекомбинантный полипептид фактора VII продуцирован клеточной культурой в клетках СНО.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что рекомбинантный полипептид фактора VII продуцирован клеточной культурой в клетках СНО, в среде, не содержащей каких-либо компонентов животного происхождения.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому способу улучшения вирусной безопасности жидких композиций, содержащих фактор VII, в частности активные полипептиды фактора VII (полипептид фактора VIIa).

Предшествующий уровень техники

Был определен ряд факторов, вовлеченных в процесс свертывания крови, включая фактор VII (FVII), гликопротеин плазмы. Гемостаз инициируется образованием комплекса между тканевым фактором (TF), который подвержен действию циркулирующей крови после повреждения стенки сосуда, и фактором VIIa, который присутствует в циркулирующей крови в количестве, соответствующем примерно 1% общей массы белка фактора VII. Фактор VII существует в плазме главным образом в виде одноцепочечного зимогена, который расщепляется FXa до его двухцепочечной активированной формы, фактора VIIa. Рекомбинантный активированный фактор VIIa (rFVIIa) разработан в качестве прогемостатического агента. Введение rFVIIa дает быстрый и высокоэффективный прогемостатический ответ у субъектов, страдающих гемофилией, с кровотечениями, которых нельзя лечить другими продуктами факторов свертывания крови в связи с образованием антител. Кровотечение у субъектов с дефицитом фактора VII или у субъектов, имеющих нормальную систему свертывания крови, но испытывающих интенсивное кровотечение, также можно успешно лечить фактором VIIa.

Очистку фактора VII и обращение с ним необходимо осуществлять осторожно в связи с возможностью разрушения молекулы. Фактор VII и фактор VIIa, представляющие собой большие молекулы (примерная молекулярная масса 50 кД), склонны к механическому разрушению силами сдвига в процессе очистки и фильтрования. Кроме того, фактор VIIa является активным протеолитическим ферментом, который разрушает другие белки, включая фактор VIIa. Разрушение фактора VIIa главным образом включает расщепление в тяжелой цепи фактора VIIa, в частности у аминокислот № 290 и 315 в молекуле. Наконец, метиониновые остатки в факторе VII и в факторе VIIa могут окисляться.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа удаления или инактивации вирусов из жидких композиций, содержащих фактор VII, при котором по существу сохраняется целостность структуры фактора VII.

В WO 96/00237 раскрыт способ фильтрации от вируса раствора, который содержит макромолекулы, например белок, такой как белок плазмы, представляющий собой фактор IX.

В WO 98/37086 раскрыто удаление вирусов из растворов белка, выделенного из плазмы, путем нанофильтрации с использованием мембраны, имеющей средний размер пор 15 нм.

У Tomokiyo et al., Vox Sanguinis, 2003, 84, 54-64, описано получение в больших объемах концентрата активированного человеческого фактора VII, выделенного из плазмы. Этот способ получения включает стадию фильтрации от вируса раствора, содержащего неактивный фактор VII.

Сущность изобретения

В широком аспекте настоящее изобретение относится к способам удаления и/или инактивации вирусов из композиции, содержащей фактор VII. Термин "вирус", как его используют в данном описании, означает любой ультрамикроскопический инфекционный агент, который реплицируется только внутри клеток живых хозяев, или неинфекционные частицы, имеющие происхождение от него. В одном варианте осуществления изобретения вирус является инфекционным. В другом варианте осуществления изобретения вирус представляет собой неинфекционную вирусную частицу.

Первый аспект настоящего изобретения относится к способу удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор VII, при котором указанный раствор подвергают нанофильтрации, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм.

Второй аспект настоящего изобретения относится к способу удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, причем по меньшей мере 5% указанного одного или более чем одного полипептида фактора VII находится в активной форме, при котором указанный раствор подвергают нанофильтрации, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, где указанная жидкая композиция по существу не содержит сыворотки, при котором указанный раствор подвергают нанофильтрации, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, при котором указанный раствор подвергают нанофильтрации, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм, где указанный нанофильтр имеет мембрану, изготовленную из одного или более чем одного материала, выбранного из медноаммиачной целлюлозы (целлюлозы, регенерированной в медноаммиачном растворе), гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF), комбинированного PVDF, поверхностно-модифицированного PVDF и полиэфирсульфона.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, включающему стадию смешения указанной композиции с детергентом.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу высокой степени очистки жидкой композиции, содержащей фактор VII от активных вирусов, включающему стадии (i) инактивации вирусов и (ii) удаления вирусов.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1 представляет собой схематическую иллюстрацию системы, пригодной для осуществления способов согласно изобретению. Эта система включает автоклав (1) или резервуар высокого давления, который снабжен подачей сжатого воздуха, предварительный фильтр (2) для удаления частиц, которые могут закупоривать вирусный фильтр, прибор (Р) для измерения давления, вирусный фильтр (3) и сборный резервуар (4).

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предложены способы удаления или инактивации вирусов, включая вирусы без оболочки, из жидкой композиции, содержащей фактор VII, которая, как правило, содержит значительную долю активированных и, следовательно, протеолитически активных полипептидов фактора VII. Этот способ включает стадию, на которой жидкую композицию, содержащую фактор VII, подвергают нанофильтрации, используя нанофильтр, имеющий размер максимум 80 нм.

Этот способ особенно полезен для удаления как вирусов с оболочкой, так и вирусов без оболочки, таких как вирус лейкемии мышей (с оболочкой), который может быть удален фильтрами с размером пор около 50 нм, и парвовирус свиней (без оболочки), который может быть удален фильтрами с размером пор около 20 нм.

Жидкие композиции, содержащие фактор VII, например, содержащие значительную долю активированных полипептидов фактора VII, в принципе могут быть изготовлены из сухих препаратов фактора VII, но более типично их получают в промышленных масштабах способами, которые включают рекомбинантные методики. Такие способы включают сбор надосадочной жидкости клеточной культуры, после которого следует одна или более чем одна стадия обработки с получением желаемого белка, включая без ограничения центрифугирование или фильтрование для удаления клеток, которые не были иммобилизованы на носителях; аффинную хроматографию, гидрофобную хроматографию; ионообменную хроматографию; вытеснительную хроматографию по размеру; электрофоретические методики (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию, и тому подобное. См. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; и Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989. Очистка полипептидов фактора VII может также включать, например, аффинную хроматографию на колонке с антителом против фактора VII (см., например, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097, 1986; и Thim et al., Biochem. 27: 7785, 1988) и активацию протеолитическим расщеплением, используя фактор XIIa или другие протеазы, обладающие трипсиноподобной специфичностью, такие, например, как фактор IXa, калликреин, фактор Ха и тромбин. См., например, Osterud et al., Biochem. 11: 2853 (1972); Thomas, U.S. Patent No.4456591 и Hedner et al., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983). Альтернативно полипептид фактора VII может быть активирован путем пропускания его через колонку для ионообменной хроматографии, такую как Mono Q® (Pharmacia) или подобную.

Способы согласно настоящему изобретению особенно полезны для широкомасштабных производственных процессов. Под термином "широкомасштабный", как правило, подразумевают процессы, где объем жидких композиций с полипептидами фактора VII составляет по меньшей мере 100 л, как, например, по меньшей мере 500 л, например, по меньшей мере 1000 л или по меньшей мере 5000 л. Это никоим образом не является ограничивающим, поскольку настоящее изобретение будет также работать для жидких композиций с полипептидами фактора VII объемом менее чем 100 л.

Сейчас понятно, что нанофильтрация может применяться даже после того, как вся масса полипептида фактора VII частично или полностью активирована.

Таким образом, способы согласно изобретению применимы в качестве одной из стадий общего способа очистки полипептида фактора VII, как правило, одной из конечных стадий процесса очистки.

Более конкретно, типичный процесс очистки, начиная со сбора материала из ферментационного бульона (либо из плазмы человека (или млекопитающего)), можно изобразить, как приведено ниже:

Стадия очистки	Возможные стадии для фильтрации вируса
Сбор
	1
Улавливание
	2
Промежуточная очистка
	3
Тонкая очистка
	4
Лекарственное вещество

Содержание полипептида фактора VII в активированной форме первоначально составляет (то есть со стадии сбора), как правило, около 2% и повышается в ходе процесса очистки до 90% или более, после чего полипептид получают в виде лекарственного вещества.

Жидкая композиция с фактором VII, подвергаемая нанофильтрации, содержит один или более чем один полипептид фактора VII в подходящем растворителе. Этот растворитель, как правило, представляет собой воду или водную смесь/раствор, такой как очищенная вода, водный буфер, смесь вода/этанол, смесь вода/диметилсульфоксид (ДМСО) или водный раствор соли, например физиологический раствор, раствор мочевины или раствор гуанидина. Подходящая водная жидкость может также содержать детергент (поверхностно-активное вещество).

В интересующих вариантах осуществления изобретения жидкая композиция фактора VII образуется или имеет происхождение из надосадочной жидкости клеточной культуры, например, из надосадочной жидкости клеточной культуры, полученной, как раскрыто в WO 02/29084. В одном варианте осуществления изобретения жидкая композиция фактора VII является свободной от сыворотки, то есть свободной от компонентов животного происхождения. Таким образом, клеточные культуры можно культивировать в среде без компонентов животного происхождения.

Привлекательным вариантом здесь является тот, где полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в клетках СНО, например, в клетках СНО в среде, не содержащей каких-либо компонентов животного происхождения или в среде без компонентов животного происхождения и без белков ("не содержащей белков").

Среда для клеток СНО может представлять собой любую имеющуюся в продаже среду СНО, не содержащую белка и компонентов животного происхождения, либо среду для клеток СНО, производимую той же фирмой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, используемые в изобретении, адаптированы для суспензионного роста в среде без компонентов животного происхождения, такой, например, как среда без сыворотки. Такие методики адаптации описаны, например, в Scharfenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21^st Century, E.C.Beuvery et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, pp.619-623, 1995 (клетки ВНК и СНО); Cruz, Biotechnol. Tech. 11:117-120, 1997 (клетки насекомых); Keen, Cytotechnol. 17:203-211, 1995 (клетки миеломы); Berg et al., Biotechniques 14:972-978, 1993 (клетки почек человека 293). В конкретном варианте осуществления изобретения клетки-хозяева представляют собой клетки ВНК 21 или СНО, которые сконструированы для экспрессии фактора VII человека или полипептида фактора VII и которые адаптированы к росту в отсутствие сыворотки или компонентов животного происхождения.

В альтернативном варианте осуществления изобретения полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в присутствии бычьей сыворотки или фетальной сыворотки теленка.

Согласно одному аспекту изобретения особенность состоит в том, что значительная доля, то есть по меньшей мере 5%, например, по меньшей мере 7%, например, по меньшей мере 10%, одного или более чем одного полипептида фактора VII находится в активированной форме (то есть в биологически активной, расщепленной форме полипептида фактора VII (то есть полипептида фактора VIIa)). В следующих вариантах осуществления изобретения полипептид фактора VIIa составляет 5-70%, например, 7-40%, например, 10-30%, от массы одного или более чем одного полипептида фактора VII. В других вариантах осуществления изобретения полипептид фактора VIIa составляет 50-100%, например, 70-100%, например, 80-100%, от массы одного или более чем одного полипептида фактора VII. Еще в других вариантах осуществления изобретения полипептид фактора VIIa составляет 20-80%, например, 30-70%, например, 30-60%, от массы одного или более чем одного полипептида фактора VII.

В большинстве вариантов осуществления изобретения раствор содержит как полипептид фактора VII в инактивированной форме, так и биологически активный полипептид фактора VIIa, то есть полипептид фактора VIIa составляет менее чем 100% от массы одного или более чем одного полипептида фактора VII. В наиболее типичном варианте осуществления изобретения композиция содержит (активированный) полипептид фактора VIIa, который соответствует (неактивному) полипептиду фактора VII, то есть полипептид фактора VIIa представляет собой полипептид фактора VII в активированной форме. В другом варианте осуществления изобретения полипептид фактора VIIa некоторым образом отличается от активированной формы инактивированного полипептида фактора VII. Конечно, должно быть понятно, что композиция в конкретных вариантах осуществления изобретения может содержать более чем один полипептид фактора VII и более чем один полипептид фактора VIIa.

Термин "один или более чем один полипептид фактора VII" включает как фактор VII дикого типа (то есть полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, раскрытую в патенте США № 4784950), так и варианты фактора VII, проявляющие по существу такую же или улучшенную биологическую активность относительно фактора VII дикого типа. В термин "фактор VII" следует включать как полипептиды фактора VII в их нерасщепленной (зимогенной) форме, так и те, которые претерпели протеолитический процессинг с образованием их соответствующих биологически активных форм, которые могут быть обозначены как фактор VIIa. Как правило, фактор VII расщепляется между остатками 152 и 153 с образованием фактора VIIa. Термин "фактор VIIa" конкретно означает активированный (то есть биологически активный, расщепленный) полипептид фактора VII. Таким образом, "фактор VIIa" представляет собой подгруппу относительно "фактора VII". Термин "неактивный фактор VII" конкретно означает фактор VII, не представляющий собой фактор VIIa.

Термин "полипептид фактора VII" также охватывает полипептиды, включая как варианты, в которых биологическая активность фактора VIIa существенно модифицирована или несколько снижена относительно активности фактора VIIa дикого типа, так и производные фактора VII и конъюгаты фактора VII. Эти полипептиды включают без ограничения фактор VII или фактор VIIa, в которые были введены специфичные изменения аминокислотной последовательности, которые модифицируют или прерывают биологическую активность этого полипептида. Термином "производное фактора VII", как его используют в данном описании, обозначают фактор VII дикого типа, варианты фактора VII, проявляющие по существу такую же или улучшенную биологическую активность относительно фактора VII дикого типа, и родственные фактору Factor VII полипептиды, в которых одна или более чем одна аминокислота исходного пептида была модифицирована химическим и/или ферментативным путем, например, путем алкилирования, гликозилирования, ПЭГилирования, ацилирования, образования эфира или образования амида или подобным образом. Они включают, но не ограничены ими, ПЭГилированный фактор VIIa человека, цистеин-ПЭГилированный фактор VIIa человека и их варианты. Не ограничивающие примеры производных фактора VII включают глико-пэгилированные производные FVII, которые раскрыты в WO 03/31464 и патентных заявках США US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557 и US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.); конъюгаты FVII, которые раскрыты в WO 01/04287, в патентной заявке США 20030165996, в WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) и WO 02/02764, в патентной заявке США 20030211094 (University of Minnesota).

Термин "ПЭГилированный фактор VIIa человека" означает фактор VIIa человека, содержащий молекулу ПЭГ, конъюгированную с полипептидом фактора VIIa. Должно быть понятно, что молекула ПЭГ может быть присоединена к любому участку полипептида фактора VIIa, включая любой аминокислотный остаток или углеводную группировку полипептида фактора VIIa. Термин "цистеин-ПЭГилированный фактор VIIa человека" означает VIIa, содержащий молекулу ПЭГ, конъюгированную с сульфгидрильной группой цистеина, введенного в фактор VIIa человека.

Биологическая активность фактора VIIa в свертывании крови является результатом его способности (i) связываться с тканевым фактором (TF) и (ii) катализировать протеолитическое расщепление фактора IX или фактора Х с образованием активированного фактора IX или Х (фактора IXa или Ха соответственно).

Для целей настоящего изобретения биологическую активность полипептидов фактора VII ("биологическую активность фактора VII") можно определить количественно путем измерения способности препарата стимулировать свертывание крови, используя плазму с недостатком фактора Factor VII и тромбопластин, как описано, например, в патенте США № 5997864 или в WO 92/15686. В данном анализе биологическую активность выражают как уменьшение времени свертывания относительно контрольного образца и переводят в "единицы фактора VII" путем сравнения со стандартом пула сыворотки человека, содержащим 1 единицу/мл активности фактора VII. Альтернативно биологическую активность фактора VIIa можно определить количественно путем (i) измерения способности фактора VIIa (или полипептида фактора VII) производить активированный фактор Х (фактор Ха) в системе, содержащей TF, заключенный в липидную мембрану, и фактор Х (Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924, 1997); (ii) измерения гидролиза фактора Х в водной системе ("In Vitro Proteolysis Assay", см. ниже); (iii) измерения физического связывания фактора VIIa (или полипептида фактора VII) с TF, используя прибор на основе поверхностного плазменного резонанса (Persson, FEBS Letts. 413: 359-363, 1997); (iv) измерения гидролиза синтетического субстрата фактором VIIa (или полипептидом фактора VII) ("In Vitro Hydrolysis Assay", см. ниже); либо (v) измерения образования тромбина в TF-независимой системе in vitro.

Варианты фактора VII, имеющие по существу такую же или улучшенную биологическую активность относительно фактора VIIa дикого типа охватывают те, которые проявляют по меньшей мере примерно 25%, например, по меньшей мере примерно 50%, например, по меньшей мере примерно 75%, например, по меньшей мере примерно 90% специфичной активности фактора VIIa, которые продуцированы в клетках того же типа, при тестировании в одном или более чем одном из анализов свертывания, протеолитическом анализе или анализе связывания TF, как описано выше. В одном варианте осуществления изобретения биологическая активность составляет более чем 80% биологической активности рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа. В другом варианте осуществления изобретения биологическая активность составляет более чем 90% биологической активности рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа. В следующем варианте осуществления изобретения биологическая активность составляет более чем 100% биологической активности рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа. В следующем варианте осуществления изобретения биологическая активность составляет более чем 120% биологической активности рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа. В следующем варианте осуществления изобретения биологическая активность составляет более чем 200% биологической активности рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа. В следующем варианте осуществления изобретения биологическая активность составляет более чем 400% биологической активности рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа.

Варианты фактора VII, обладающие существенно сниженной биологической активностью относительно фактора VIIa дикого типа, представляют собой те, которые проявляют менее чем примерно 25%, например, менее чем примерно 10%, например, менее чем примерно 5%, например, менее чем примерно 1% специфичной активности фактора VIIa дикого типа, которые продуцированы в клетках того же типа, при тестировании в одном или более чем одном из анализов свертывания, протеолитическом анализе или анализе связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, обладающие по существу модифицированной биологической активностью относительно фактора VII дикого типа, включают без ограничения варианты фактора VII, которые проявляют TF-независимую протеолитическую активность по отношению к фактору X, и те, которые связывают TF, но не расщепляют фактор X.

Варианты фактора VII либо проявляющие по существу такую же или лучшую биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, либо альтернативно проявляющие существенно модифицированную или сниженную биологическую активность относительно фактора VII дикого типа включают без ограничения полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности фактора VII дикого типа вставкой, делецией или заменой одной или более чем одной аминокислоты.

Не ограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих по существу такую же биологическую активность, как фактор VII дикого типа, включают S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); варианты фактора VIIa, проявляющие повышенную протеолитическую стабильность, которые раскрыты в патенте США № 5580560; фактор VIIa, который претерпел протеолитическое расщепление между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); окисленные формы фактора VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); варианты фактора VII, которые раскрыты в PCT/DK02/00189; и варианты фактора VII, проявляющие повышенную протеолитическую стабильность, которые раскрыты в WO 02/38162 (Scripps Research Institute); варианты фактора VII, имеющие модифицированный Gla-домен и проявляющие усиленное связывание с мембраной, которые раскрыты в WO 99/20767, в патентах США US 6017882 и US 6747003, в патентной заявке США 20030100506 (University of Minnesota) и WO 00/66753, в патентных заявках США US 20010018414, US 2004220106 и US 200131005, в патентах США US 6762286 и US 6693075 (University of Minnesota); и варианты фактора VII, которые раскрыты в WO 01/58935, в патенте США US 6806063, в патентной заявке США 20030096338 (Maxygen ApS), в WO 03/93465 (Maxygen ApS) и в WO 04/029091 (Maxygen ApS).

Не ограничивающие примеры вариантов фактора VII, обладающих повышенной биологической активностью по сравнению с фактором VIIa дикого типа, включают варианты фактора VII, которые раскрыты в WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/27147, WO 03/37932; WO 02/38162 (Scripps Research Institute); и варианты фактора VIIa с повышенной активностью, которые раскрыты в JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.).

He ограничивающие примеры вариантов фактора VII, обладающих существенно сниженной или модифицированной биологической активностью относительно фактора VII дикого типа, включают R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29: 3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270: 66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15: 515-520, 1998), и фактор VIIa, у которого отсутствует домен Gla (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317: 245-249, 1993).

и фактор VII, имеющий замены, добавления или делеции в аминокислотной последовательности от 233Тhr до 240Asn, фактор VII, имеющий замены, добавления или делеции в аминокислотной последовательности от 304Аrg до 329Cys.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид фактора VIIa представляет собой фактор VIIa человека (hFVIIa), такой как полученный рекомбинантным путем фактор VIIa человека (rhFVIIa). В других вариантах осуществления изобретения один или более чем один полипептид фактора VII содержит вариант последовательности фактора VII. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более чем один полипептид фактора VII обладает гликозилированием, отличным от фактора VII дикого типа.

Нанофильтрация

Жидкую композицию с фактором VII подвергают нанофильтрации, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм. В частности, размер пор нанофильтра составляет максимум 50 нм, например, максимум 30 нм, например, в интервале 10-30 нм.

Термин "размер пор", как правило, означает размер самых малых вирусов, которые удерживаются фильтром.

Примерами подходящих имеющихся в продаже нанофильтров являются Asahi Planove 15 N, Asahi Planove 20 N, Asahi Planova 35 N и Asahi Planova 75 N, все от Asahi Chemical, Tokyo, Japan; Millipore NFR, Millipore NFP, Millipore Viresolve 70 и Millipore Viresolve 180, все от Millipore; и Pall DV20, Pall DV 50, Pall Omega VR 100 K; а также Bemberg Microporous Membrane-15 нм (ВММ-15).

Мембрана фильтра может быть, например, изготовлена из одного или более чем одного материала, выбранного из медноаммиачной целлюлозы, гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF), комбинированного PVDF, поверхностно-модифицированного PVDF, полиэфирсульфона, и подобных материалов. В одном варианте осуществления изобретения материал выбран из материалов на основе поливинилиденфторида и материалов на основе полиэфирсульфона.

Нанофильтрацию можно проводить в динамическом режиме (тангенциальная фильтрация) или в статическом режиме, как должно быть понятно специалисту в данной области техники. В одном варианте осуществления изобретения нанофильтрацию проводят в статическом режиме.

Значение pH жидкой композиции фактора VII при нанофильтрации не считают особенно принципиальным. Таким образом, значение pH обычно дано с точки зрения условий, применяемых на стадиях процесса, непосредственно предшествующих стадии нанофильтрации. В некоторых вариантах осуществления изобретения значение pH регулируют таким образом, чтобы жидкая композиция имела pH в интервале 5,5-10, например, в интервале 7,0-9,5, например, в интервале 7,6-9,4, например, в интервале 7,7-9,3, например, в интервале 8,0-9,0 или в интервале 8,3-8,7. В одном варианте осуществления изобретения pH находится в интервале 5-7. В одном варианте осуществления изобретения pH выше, чем 9,5, например, в интервале 9,5-10.

Кроме того, концентрация полипептида фактора VII в жидкой композиции, как правило, также определяется предшествующими стадиями процесса, но обычно находится в интервале 0,01-5 мг/мл, например, в интервале 0,05-2,0 мг/мл.

Процесс нанофильтрации можно проводить, используя фильтрационную систему, как проиллюстрировано на фигуре 1.

Этот способ можно осуществлять, как описано в приведенном ниже иллюстративном примере: резервуар (1) высокого давления наполняют водой для инъекций (WFI), давление в резервуаре повышают до 3,5 бар перед вирусным фильтром (3) и фильтр промывают в течение 10 минут. Давление снижают до 2 бар, и вирусный фильтр (3) промывают еще в течение 10 минут. Из резервуара (1) высокого давления удаляют воду для инъекций. Эти операции можно повторить с буфером, после чего резервуар (1) высокого давления наполняют жидкой композицией с фактором VII. Давление повышают до 2 бар и поддерживают по существу постоянным в процессе фильтрации. Затем вирусный фильтр (3) можно проверить на целостность с помощью стандартных методик.

Фильтрат собирают в сборный резервуар, затем его можно дополнительно обработать с целью получения фармацевтической композиции, содержащей полипептид фактора VIIa, в виде лекарственного средства.

С учетом вышесказанного, как правило, предпочтительно использовать стадию предварительной фильтрации перед стадией нанофильтрации с целью удаления более крупных частиц, агрегатов и т.д., которые иначе будут вызывать закупорку нанофильтра. Такой предварительный фильтр, как правило, имеет размер пор в интервале 0,05-0,5 мкм. В одном варианте осуществления изобретения предварительный фильтр представляет собой фильтр Millipore NFR.

В качестве альтернативы использованию давления воздуха для создания необходимого давления для фильтрации можно использовать жидкостный насос, помещенный после резервуара высокого давления.

Если жидкая композиция с фактором VII после нанофильтрации содержит инактивированные полипептиды фактора VII, эту композицию можно подвергнуть последующей стадии активации, например, как описано в Bjørn, S. & Thim, L. Res. Disclosures (1986) 269, 564-565, Pedersen, A.H. & al., Biochemistry (1989), 28, 9331-9336, и Tomokiyo, К. & al., Vox Sang. 84, 54-64 (2003).

Дальнейшую обработку композиции и изготовление готового препарата в виде фармацевтического продукта можно проводить, как раскрыто в Juliander, В. & al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4, 373-383 (2001).

Нанофильтрация жидких композиций с полипептидом фактора VII, не содержащих сыворотки

Один отдельный аспект изобретения, который может включать некоторые или все из вышеописанных характеристик, относится к способу удаления вирусов из жидкой композиции фактора VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, причем указанная композиция по существу не содержит сыворотки, при котором указанный раствор подвергают нанофильтрации, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм.

Привлекательным вариантом здесь является тот, где полипептид(ы) фактора VII продуцируются клеточной культурой в клетках СНО, например, в клетках СНО в среде, не содержащей каких-либо компонентов животного происхождения.

Данный аспект изобретения не является конкретно ограниченным жидкими композициями с фактором VII, в которых некоторая доля полипептида(ов) фактора VII находится в активированной форме. Однако условия, упомянутые выше для первого аспекта изобретения, также применяются для данного второго аспекта изобретения, и наоборот.

Нанофильтрация жидких композиций с полипептидом фактора VII через конкретные фильтры

Другой отдельный аспект изобретения, который может включать некоторые или все из вышеописанных характеристик, относится к способу удаления вирусов из жидкой композиции с фактором VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, при котором указанный раствор подвергают нанофильтрации, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм, где указанный нанофильтр имеет мембрану, изготовленную из одного или более чем одного материала, выбранного из медноаммиачной целлюлозы, гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF), комбинированного PVDF, поверхностно-модифицированного PVDF и полиэфирсульфона.

В одном варианте осуществления изобретения материал выбран из материалов на основе поливинилиденфторида и материалов на основе полиэфирсульфона.

Данный аспект изобретения не является конкретно ограниченным жидкими композициями с фактором VII, в которых некоторая доля полипептида(ов) фактора VII находится в активированной форме. Однако условия, упомянутые выше для первого аспекта изобретения, также применяются для данного третьего аспекта изобретения, и наоборот.

Инактивация вирусов добавлением детергента

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу инактивации вирусов в жидкой композиции с фактором VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, включающему стадию смешения указанной композиции с детергентом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения детергент выбран из неионных детергентов, таких как октилфеноксиполиэтоксиэтанол, полисорбаты, полоксамеры, алкилэфиры полиоксиэтилена, блоксополимеры полиэтилена/полипропилена, полиэтиленгликоля (ПЭГ), полиоксиэтиленстеараты и полиоксиэтилен-касторовые масла. Иллюстративными примерами здесь являются неионные детергенты Тритон Х-100, Tween^®, полисорбат 20, полисорбат 60, полисорбат 80, Brij-35 (додециловый эфир полиоксиэтилена), полоксамер 188, полоксамер 407, ПЭГ 8000, полиолы Pluronic ^®, полиокси-23-лауриловый эфир, Myrj 49 и Cremophor A.

Особенно полезным детергентом является октилфеноксиполиэтоксиэтанол формулы пара-((СН₃)₃СН₂С(СН ₂)₂)-С₆Н₄-O-(СН₂ СН₂O)_n-Н, где n находится в интервале 5-15, в частности тот, где n равно 9-10, такой как детергент Тритон Х-100.

В одном варианте осуществления изобретения детергент смешивают с жидкой композицией фактора VII до получения концентрации детергента в этой композиции в интервале 0,01-0,5% масс./масс., например, в интервале 0,05-0,4% масс./масс., например, в интервале 0,05-0,3% масс./масс., например, в интервале 0,05-0,2% масс./масс., например, в интервале 0,05-0,1% масс./масс.

В следующем варианте осуществления изобретения детергент смешивают с композицией при температуре в интервале 2-12°C, например, в интервале 2-9°C.

В большинстве вариантов изобретения нежелательно включать триалкилфосфатный детергент, следовательно, детергент может по существу не содержать триалкилфосфатных растворителей, таких как три(н-бутил)фосфат.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения этот способ включает стадии смешения композиции полипептида фактора VII с Тритоном Х-100 до концентрации 0,05-0,2 масс.% при температуре в интервале 2-9°C, при условии, что детергент по существу не содержит триалкилфосфатных растворителей, таких как три(н-бутил)фосфат.

Данный аспект изобретения не ограничен конкретными жидкими композициями с фактором VII, в которых некоторая доля полипептида(ов) фактора VII находится в активированной форме. Однако условия, упомянутые выше для первого аспекта изобретения, также применяются для данного четвертого аспекта изобретения, и наоборот.

Сочетание стадий инактивации вирусов

Еще в одном следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу высокой степени очистки жидкой композиции, содержащей фактор VII, от активных вирусов, включающему стадии (i) инактивации вирусов способом, определенным под заголовком "Инактивация вирусов добавлением детергента", и (ii) удаления вирусов любым из способов, определенных в данном описании под заголовком "Нанофильтрация", в любом порядке.

В одном варианте осуществления изобретения стадия инактивации вирусов предшествует стадии удаления вирусов.

Даже хотя индивидуальные стадии считают достаточными для очистки композиции от активных вирусов, эти два способа можно рассматривать как, по меньшей мере частично, "ортогональные" в том смысле, что определенные вирусы может быть труднее удалить одним из этих способов, тогда как те же самые определенные вирусы могут быть легче удалены другим способом, и наоборот. Следовательно, сочетание этих двух способов будет обеспечивать даже более высокий уровень безопасности для пациента, для которого предназначен полипептид фактора VII, а также для врача, прописывающего лекарство, представляющее собой полипептид фактора VII, и для официальных властей, одобряющих это лекарство. Таким образом, сочетание этих двух способов может иметь высокую коммерческую ценность.

Как описано выше, настоящее изобретение относится к способам удаления или инактивации вирусных частиц. Снижение количества вирусных частиц на конкретной стадии процесса обычно описывают в логарифмических единицах (логарифм log 10 или log₁₀ ), где коэффициент снижения вычисляют как количество вирусных частиц после очистки относительно количества вирусных частиц до очистки.

Например, если 10⁶ вирусных частиц обнаружено до очистки, а 10² обнаружено после очистки, снижение составляет 10⁴, или 4log₁₀ .

Общее снижение вирусных частиц в результате осуществления всего способа описывают таким же образом, и его можно вычислить путем прибавления величины снижения количества вируса из каждой стадии способа, где "величина снижения" относится как к удалению вирусов, так и к инактивации вирусов.

Чтобы конкретная стадия снижения количества вирусов была эффективной, предпочтительно иметь снижение вирусов по меньшей мере 4log₁₀.

В одном варианте осуществления изобретения стадия фильтрации снижает количество вирусных частиц по меньшей мере примерно на 4log₁₀. В одном варианте осуществления изобретения стадия фильтрации снижает количество вирусных частиц по меньшей мере примерно на 5log₁₀ .

В одном варианте осуществления изобретения настоящего изобретения стадия смешения указанной композиции FVII с детергентом инактивирует по меньшей мере 4log₁₀ вируса. В одном варианте осуществления изобретения настоящего изобретения стадия смешения указанной композиции FVII с детергентом инактивирует по меньшей мере 5log₁₀ вируса.

Методы определения количества вирусных частиц известны специалистам в данной области техники, и его можно измерить в стандартных анализах TCID₅₀ (инфекционной дозы клеточных культур (Tissue culture infectious dose) 50% конечной концентрации на мл), анализах бляшек или ПЦР анализах. ТСID₅₀ и анализы бляшек можно использовать для измерения концентрации инфекционных частиц, тогда как ПЦР анализы можно использовать для измерения как инфекционных, так и неинфекционных инактивированных вирусных частиц.

Варианты способов согласно настоящему изобретению:

1. Способ удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, причем по меньшей мере 5% указанного одного или более чем одного полипептида фактора VII находится в активированной форме, при котором осуществляют нанофильтрацию указанного раствора, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм.

2. Способ согласно варианту 1, где по меньшей мере 7%, например, по меньшей мере 10%, одного или более чем одного полипептида фактора VII находится в активированной форме.

3. Способ согласно варианту 1, где активированная форма полипептида фактора VII составляет 5-70%, например, 7-40%, например, 10-30%, от массы одного или более чем одного полипептида фактора VII.

4. Способ согласно варианту 1, где активированная форма полипептида фактора VII составляет 50-100%, например, 70-100%, например, 80-100%, от массы одного или более чем одного полипептида фактора VII.

5. Способ согласно варианту 1, где активированная форма полипептида фактора VII составляет 20-80%, например, 30-70%, например, 30-60%, от массы одного или более чем одного полипептида фактора VII.

6. Способ согласно любому из вариантов 1-5, где жидкая композиция имеет pH в интервале 7,0-9,5, например, в интервале 7,6-9,4, например, в интервале 7,7-9,3, например, в интервале 8,0-9,0 или в интервале 8,3-8,7.

7. Способ согласно любому из вариантов 1-6, где концентрация полипептида(ов) фактора VII в жидкой композиции находится в интервале 0,01-5 мг/мл, например, в интервале 0,05-2,0 мг/мл.

8. Способ согласно любому из вариантов 1-7, где размер пор нанофильтра составляет максимум 50 нм, например, максимум 30 нм, например, в интервале 10-30 нм.

9. Способ согласно любому из вариантов 1-8, где мембрана нанофильтра изготовлена из одного или более чем одного материала, выбранного из медноаммиачной целлюлозы, гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF), комбинированного PVDF, поверхностно-модифицированного PVDF и полиэфирсульфона.

10. Способ согласно любому из вариантов 1-9, где жидкую композицию фактора VII получают, либо она имеет происхождение, из надосадочной жидкости клеточной культуры.

11. Способ согласно любому из вариантов 1-10, где жидкая композиция по существу не содержит сыворотки.

12. Способ согласно любому из вариантов 1-10, где полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в присутствии бычьей сыворотки или фетальной сыворотки теленка.

13. Способ согласно любому из вариантов 1-12, где полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в клетках СНО.

14. Способ согласно варианту 13, где полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в клетках СНО, в среде, не содержащей каких-либо компонентов животного происхождения.

15. Способ удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, и по существу не содержит сыворотки, при котором осуществляют нанофильтрацию указанного раствора, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм.

16. Способ согласно варианту 15, где жидкую композицию фактора VII получают, либо она имеет происхождение, из надосадочной жидкости клеточной культуры.

17. Способ согласно любому из вариантов 15-16, где полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в клетках СНО.

18. Способ согласно варианту 17, где полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в клетках СНО, в среде, не содержащей каких-либо компонентов животного происхождения.

19. Способ согласно любому из вариантов 15-18, где по меньшей мере 5% указанного одного или более чем одного полипептида фактора VII находится в активированной форме.

20. Способ согласно любому из вариантов 15-19, где жидкая композиция имеет pH в интервале 7,0-9,5, например, в интервале 7,6-9,4, например, в интервале 7,7-9,3, например, в интервале 8,0-9,0 или в интервале 8,3-8,7.

21. Способ согласно любому из вариантов 15-20, где концентрация полипептида(ов) фактора VII в жидкой композиции находится в интервале 0,01-5 мг/мл, например, в интервале 0,05-2,0 мг/мл.

22. Способ согласно любому из вариантов 15-21, где размер пор нанофильтра составляет максимум 50 нм, например, максимум 30 нм, например, в интервале 10-30 нм.

23. Способ согласно любому из вариантов 15-22, где мембрана нанофильтра изготовлена из одного или более чем одного материала, выбранного из медноаммиачной целлюлозы, гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF), комбинированного PVDF, поверхностно-модифицированного PVDF и полиэфирсульфона.

24. Способ удаления вирусов из жидкой композиции, содержащей фактор VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, при котором осуществляют нанофильтрацию указанного раствора, используя нанофильтр, имеющий размер пор максимум 80 нм, где указанный нанофильтр имеет мембрану, изготовленную из одного или более чем одного материала, выбранного из медноаммиачной целлюлозы, гидрофильного поливинилиденфторида (PVDF), комбинированного PVDF, поверхностно-модифицированного PVDF и полиэфирсульфона.

25. Способ согласно варианту 24, где материал выбран из материалов на основе поливинилиденфторида и материалов на основе полиэфирсульфона.

26. Способ согласно любому из вариантов 24-25, где по меньшей мере 5% указанного одного или более чем одного полипептида фактора VII находится в активированной форме.

27. Способ согласно любому из вариантов 24-26, где жидкая композиция имеет pH в интервале 7,0-9,5, например, в интервале 7,6-9,4, например, в интервале 7,7-9,3, например, в интервале 8,0-9,0 или в интервале 8,3-8,7.

28. Способ согласно любому из вариантов 24-27, где концентрация полипептида(ов) фактора VII в жидкой композиции находится в интервале 0,01-5 мг/мл, например, в интервале 0,05-2,0 мг/мл.

29. Способ согласно любому из вариантов 24-28, где размер пор нанофильтра составляет максимум 50 нм, например, максимум 30 нм, например, в интервале 10-30 нм.

30. Способ согласно любому из вариантов 24-29, где жидкую композицию фактора VII получают, либо она имеет происхождение, из надосадочной жидкости клеточной культуры.

31. Способ согласно любому из вариантов 24-30, где жидкая композиция по существу не содержит сыворотки.

32. Способ согласно любому из вариантов 24-31, где полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в присутствии бычьей сыворотки или фетальной сыворотки теленка.

33. Способ согласно любому из вариантов 24-32, где полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в клетках СНО.

34. Способ согласно варианту 33, где полипептид(ы) фактора VII продуцируется(ются) клеточной культурой в клетках СНО, в среде, не содержащей каких-либо компонентов животного происхождения.

35. Способ инактивации вирусов в жидкой композиции, содержащей фактор VII, где указанная композиция содержит один или более чем один полипептид фактора VII, включающий стадию смешения указанной композиции с детергентом.

36. Способ согласно варианту 35, где детергент представляет собой октилфеноксиполиэтоксиэтанол формулы пара-((СН₃) ₃СН₂С(СН₂)₂)-С₆ Н₄-O-(СН₂СН₂O)_n-Н, где n находится в интервале 5-15.

37. Способ согласно варианту 36, где детергент представляет собой соединение, где n равно 9-10, например, Тритон Х-100.

38. Способ согласно варианту 35, где детергент выбран из группы, состоящей из Tween^®, полисорбата 20, полисорбата 60 и полисорбата 80.

39. Способ согласно любому из вариантов 35-38, где детергент смешивают с жидкой композицией, содержащей фактор VII, до получения концентрации детергента в этой композиции в интервале 0,01-0,3 масс.%, например, в интервале 0,05-0,2 масс.%.

40. Способ согласно любому из вариантов 35-39, где детергент смешивают с композицией при температуре в интервале 2-12°C, например, в интервале 2-9°C.

41. Способ согласно любому из вариантов 35-40, где детергент по существу не содержит триалкилфосфатных растворителей, таких как три(н-бутил)фосфат.

42. Способ высокой степени очистки жидкой композиции, содержащей фактор VII, от активных вирусов, включающий стадии (i) инактивации вирусов способом, определенным в любом из вариантов 35-41, и (ii) удаления вирусов любым из способов, определенных в любом из вариантов 1-35, в любом порядке.

43. Способ согласно варианту 42, где стадия инактивации вирусов предшествует стадии удаления вирусов.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1: Опытное производство фактора VII. не содержащего сыворотки

Приведенный ниже эксперимент проводили для получения из культуры фактора VII в большом масштабе.

Клеточную линию СНО K1, трансформированную плазмидой, кодирующей фактор VII, адаптировали к росту в суспензионной культуре в среде, не содержащей компонентов животного происхождения. Банк адаптированных клеток замораживали. Клетки из банка размножали в спин-флаконах в суспензионной культуре в среде, не содержащей компонентов животного происхождения. По мере того как число клеток увеличивалось, объем постепенно повышали добавлением новой среды. Когда объем достиг 4 л, а число клеток достигло 0,8×10⁶ мл, содержимое спин-флаконов переносили в реактор объемом 50 л с мешалкой (реактор посевного материала). По мере того как число клеток увеличивалось в 50-тилитровом реакторе, объем постепенно повышали добавлением новой среды. Когда объем достиг 50 л, а число клеток достигло 1×10⁶ мл, содержимое реактора переносили в реактор объемом 500 л с мешалкой (реактор для продуцирования). Этот 500-литровый реактор содержал макропористые носители Cytopore 1 (Amersham Biosciences), на которых клетки иммобилизовывались в течение 24 часов после инокуляции. Объем в 500-литровом реакторе постепенно повышали добавлением новой среды по мере увеличения числа клеток. Когда объем достиг 450 л, а число клеток достигло 2×10⁶/мл, начинали стадию продуцирования, и смену среды проводили каждые 24 часа. Перемешивание останавливали, чтобы дать возможность носителям, содержащим клетки, осесть, а затем 80% надосадочной жидкости культуры собирали и заменяли новой средой. Собранную надосадочную жидкость культуры фильтровали для удаления не уловленных клеток и клеточных остатков, а затем переносили для дальнейшей обработки. Как 50-тилитровый, так и 500-литровый биореактор, были оборудованы приборами регуляции температуры, растворенного кислорода (барботажа кислорода через микробарботер), скорости перемешивания, скорости аэрации верхнего пространства и pH (отрицательная регуляция путем добавления газа CO₂ в верхнее пространство). Кроме того, 500-литровый биореактор был оборудован приборами для регуляции растворенного CO₂. Текущее измерение CO₂ осуществляли с помощью CO₂-датчика YSI 8500. Уровень CO₂ регулировали путем барботажа атмосферного воздуха в жидкость через трубку в соответствии с сигналом CO₂. Скорость барботажа устанавливали на 0 л/мин на литр культуральной жидкости, когда концентрация CO₂ находилась на фиксированном значении или ниже, и на 0,01-0,05 л/мин на литр культуральной жидкости, когда концентрация CO₂ была выше фиксированного значения. Фиксированное значение для растворенного CO₂ составляло 160 мм Hg. Как указано выше, основание не добавляли в биореактор для положительной регуляции pH. Во время фазы продуцирования густота клеток достигала 1-2×10⁷ клеток/мл, а концентрация фактора VII в суточном сборе 10-20 мг/л. pCO ₂ поддерживалось в пределах интервала 150-170 мм Hg. Значение pH поддерживали выше 6,70, хотя даже не добавляли основание.

Пример 2: Фильтрация элюата со стадии улавливания

Раствор белка, подлежащий фильтрации: 25 л раствора FVII со стадии улавливания, со следующими характеристиками:

Концентрация FVII/FVIIa: 630 мг/л

1,7% окисленных форм FVII

Степень активации (то есть процент FVIIa): не анализировали

Разрушение: <2,2%

Фильтрование проводили по существу, как описано в данном описании со ссылкой на фигуру 1:

Фильтр: Millipore NFR, 0,08 м²

Давление: 2 бар

Свойства фильтрата:

Концентрация FVII/FVIIa: 610 мг/л, то есть: выход FVII: 96,8%

1,5% окисленных форм FVII

Степень активации (то есть процент FVIIa): не анализировали.

Разрушение: <2,2%

Пример 3: Фильтрация элюата со стадии улавливания

Раствор белка, подлежащий фильтрации: 185 мл раствора FVII со стадии улавливания, со следующими характеристиками:

Концентрация FVII/FVIIa: 82 мг/л

3,4% окисленных форм FVII

Степень активации (то есть процент FVIIa): 19%

Разрушение: <3%

Фильтрование проводили по существу, как описано в данном описании со ссылкой на фигуру 1:

Фильтр: Pall DV50, 0,0017 м²

Давление: 2 бар

Свойства фильтрата:

Концентрация FVII/FVIIa: 77,1 мг/л, то есть: выход FVII: 94%

4,1% окисленных форм FVII

Степень активации (то есть процент FVIIa): 20%.

Разрушение: <3%

Пример 4: Фильтрация элюата со стадии улавливания

Раствор белка, подлежащий фильтрации: 108 мл элюата стадии 1 со следующими характеристиками:

Концентрация FVII/FVIIa: 320 мг/л

3,7% окисленных форм FVII

Степень активации (то есть процент FVIIa): 3,3%

Разрушение: <0,5%

Фильтрование проводили по существу, как описано в данном описании со ссылкой на фигуру 1:

Фильтр: Asahi Planova, 0,001 м ²

Давление: 0,8 бар

Свойства фильтрата:

Концентрация FVII/FVIIa: 310 мг/л, то есть: выход FVII: 100%

3,7% окисленных форм FVII

Степень активации (то есть процент FVIIa): не анализировали.

Разрушение: <0,5%

Пример 5: Фильтрация массы лекарственного вещества FVII

Раствор белка, подлежащий фильтрации: 98 мл массы вещества FVIIa со следующими характеристиками:

Концентрация FVII/FVIIa: 1460 мг/л

2,1% окисленных форм FVII

Степень активации (то есть процент FVIIa): >90%.

Разрушение: 11,9%

Фильтрование проводили по существу, как описано в данном описании со ссылкой на фигуру 1:

Фильтр: Millipore NFP, 0,0017 м²

Давление: 2 бар

Свойства фильтрата:

Концентрация FVII/FVIIa: 1320 мг/л, то есть: выход FVII: 90,4%

2,3% окисленных форм FVII

Степень активации (то есть процент FVIIa): не анализировали, поскольку степень активации в растворе, подлежащем фильтрации, составляет 98%.

Разрушение: 12,3%

Пример 6: Удаление вирусов

50 мл раствора полипептида фактора VII (см. пример 1) со стадии улавливания, содержащего вирус лейкемии мышей, титр YY бляшкообразующих единиц (бое).

Фильтрование проводили по существу, как описано в данном описании со ссылкой на фигуру 1:

Фильтр: Millipore NFR, уу см²

Давление: YY Бар

Титр вируса в фильтрате: хх бое

Вычисленная величина снижения количества вируса: хх.