способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якутов

Формула изобретения

Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якутов, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, отличающийся тем, что амплификацию специфичности гена липопротеинлипазы - LPL определяют методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипа *G/*T и аллеля *Т полиморфного варианта Hind III гена липопротеинлипазы - LPL прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, и может быть использовано в офтальмологии, а также в эндокринологии, медицинской генетике, общественном здоровье и здравоохранении, медико-социальной экспертизе, генной инженерии, генотерапии для прогнозирования развития и профилактики диабетической ретинопатии (ДР) при сахарном диабете типа 2 (СД типа 2) у якутов.

Известен способ прогнозирования возникновения и развития диабетической ретинопатии у больных инсулинзависимым сахарным диабетом (Заявка 2003122404/15, G01N 33/68, БИПМ № 6, 27.02.2005 г.), который позволяет прогнозировать возникновение и прогрессирование диабетической ретинопатии у больных инсулинзависимым сахарным диабетом при проведении иммунологического исследования сыворотки крови путем определения содержания интерлейкина - 1 при наличии его в концентрации 50 пкг/мл и выше. Возникновение диабетической ретинопатии при отсутствии клинических явных изменений на глазном дне прогнозируют при концентрации интерлейкина - 1 700 пкг/мл и более.

Известен способ прогнозирования клинической манифестации диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом 2 типа (Патент 2292549, G01N 33/487, БИПМ № 3, 27.01.2007 г.), который позволяет исследовать индуцированную хемолюминесценцию слезной жидкости и световую чувствительность макулы с помощью фотостресс-теста. При значениях индуцированной хемолюминесценции слезной жидкости от 0,031-0,043 отн. ед. и показателях световой чувствительности макулы от 56 до 75 секунд прогнозируют высокий риск клинической манифестации диабетической ретинопатии на ранней стадии.

Известен способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии (Заявка 2005112169/15, G01N 33/48, БИПМ № 30, 27.10.2006 г.), который включает определение нитритов в крови, а в слезной жидкости - холестерин, СОД и каталазу, по этим показателям составляют карту, по которой определяют стадии развития ДР.

Известен способ диагностики диабетической ретинопатии (Патент 2071059, G01N 33/68, БИ № 36, 27.12.1996 г.), который позволяет диагностировать диабетическую ретинопатию при определении в сыворотке крови повышенного уровня тироксинсвязывающего гормона в 1,5 и более раз.

Известен способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии (Патент 2124727, G01N 33/53, A61F 9/00, БИ № 1, 10.01.1999 г.), который обеспечивает возможность прогнозирования перехода непролиферативной стадии диабетической ретинопатии в пролиферативную путем иммунологического исследования слезной жидкости и определения концентрации иммуноглобулина А при его значениях не менее 0,20 г/л.

Однако все перечисленные выше способы не позволяют в полном объеме определять специфические и генетические признаки диабетической ретинопатии непосредственно у больных сахарным диабетом типа 2, в частности, в зависимости от этнической принадлежности обследуемых пациентов, а именно у якутов.

Известен способ диагностики риска развития у субъекта атеросклероза или диабетической ретинопатии (Заявка 2001130755/14, C12Q 1/68, БИПМ № 24, 27.08.2003 г.), включающий определение у диабетика наличия полиморфизма на участке сигнального пептида препро-NPY человека. Полиморфизм заключается в замене лейцина на пролин в 7-м положении на участке сигнального пептида препро-NPY человека и является индикатором повышенного риска развития диабетической ретинопатии и атеросклероза.

Данный способ диагностики разработан на основе изучения генетической предрасположенности к ДР при сахарном диабете независимо от его типа в гетерогенной популяционной среде, и поэтому не приемлем для медико-генетического консультирования по ДР при СД типа 2 в других регионах, в частности в Республике Саха (Якутия). Это обусловлено тем, что генетическая предрасположенность к ДР при СД типа 2, как и к другим многофакторным заболеваниям, формируется в зависимости от особенностей популяционно-генетической структуры этноса, к которому относится этническая группа якутов.

Задача предлагаемого способа - прогнозирование риска развития ДР при СД типа 2 у якутов.

Поставленную задачу решают за счет того, что амплификацию специфичности гена липопротеинлипазы - LPL определяют методом полимеразной цепной реакции синтеза ДИК и при выявлении генотипа *G/*T и аллеля *Т полиморфного варианта Hind III LPL прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.

Способ осуществляют следующим образом

Кровь для выделения ДНК собирают из локтевой вены пациента в специальный вакутейнер с консервантом EDTA. Собранную кровь замораживают в специальном контейнере при температуре -20°C и ниже.

ДНК экстрагируют из лейкоцитов с помощью системы очистки (Promega, Madison, WI).

В работе использовали полиморфный маркер геналипопротеинлипазы, участвующий в метаболизме липидов и углеводов: LPL (вариант Hind III LPL).

Гаплотип rs320 гена LPL анализирован с помощью аллельной дифференциации Tagman универсальной средой ПЦР (no AmpErase UNG). Все реакции проводились на системе ABI7300 с использованием программы SDS 1.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Фрагменты ПЦР денатурировали при температуре 95°C в течение 5 минут с последующей ренатурацией понижением температуры до 25°C на протяжении 45 минут. Идентификация аллелей выполнена с использованием системы Wave Nuclear Acid Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha, NE). Результаты соответствовали прямым данным секвенирования.

Статистическая обработка материалов. Статистический анализ данных проведен с использованием пакета Statistica 8.0 и SAS 7.0. При сравнении качественных данных использован критерий Пирсона ² и точный критерий Фишера. Критическое значение уровня значимости принималось равным 5%. Относительный риск заболевания по каждому аллелю вычисляли как соотношение шансов (odds ratio - OR) с расчетом доверительных интервалов (OR'). При OR=1 ассоциации нет, OR>1 - положительная ассоциация заболевания с аллелем и генотипом и OR<1 - отрицательная ассоциация.

Офтальмологическое обследование пациентов включало стандартные методы определения визометрии, офтальмотонуса, биомикроскопии, офтальмоскопии с применением универсальной линзы Гольдмана в условиях медикаментозного мидриаза при отсутствии противопоказаний.

Учитывая особые этические моменты, связанные с охраной права личности, осмотры и забор биологического материала проводились с заполнением специальных медицинских карт при добровольном согласии на участие в клиническом исследовании взрослого пациента или родителя несовершеннолетнего больного. Форма указанной медицинской карты одобрена Комитетом по этике при Якутском научном центре СО РАН РФ (Протокол № 5 от 21.06.2006 г.).

Нами обследованы коренные жители, принадлежащие к этнической группе якутов, проживающие в 5 районах (Амгинский, Усть-Алданский, Таттинский, Чурапчинский, Мегино-Кангаласский) Республики Саха (Якутия).

В ходе работы исследованы 238 образцов ДНК этнических якутов обеих гендерных групп. Группу исследования составили 78 больных ДР (Классификация E.Kohner, M.Porta, 1990) при СД типа 2, в возрасте свыше 40 лет. Контрольная группа состояла из 160 добровольных доноров, той же этнической группы, без клинических и лабораторных признаков сахарного диабета, не родственных между собой и не имеющих отягощенный семейный анамнез по сахарному диабету. Сравнительная клинико-социальная характеристика исследуемых пациентов в обеих группах представлена в таблице 1.

Таблица 1
Сравнительная социально-клиническая характеристика исследуемых пациентов в этнической группе якутов
Характеристика исследуемых пациентов в этнической группе якутов	Группа больных ДР при СД 2 типа	Контрольная группа
1	2	3
Возраст	54.7±10.9	57.0±14.7
Пол (М/Ж в %)	31.5/68.5	42.6/57.4
Индекс массы тела	27.5±3.76	25.2±2.87
Гликемия (ммоль/л)	11.7±4.81	4.8±0.75
Артериальное давление (систолическое) (ммHg)	151±24	140±14
Артериальное давление (диастолическое) (ммHg)	92±11	88±8

Из таблицы 1 видно, что пациенты обеих групп не имели особых статистических различий по полу и возрасту. Основной составляющей обеих групп были женщины в возрасте старше 50 лет. Среди пациентов исследуемой группы отмечается повышенный индекс массы тела, уровня гликемии и артериального давления.

В результате офтальмологического исследования пациентов установлено, что длительность развития ДР варьировала в диапазоне от 1 года до 20 лет. ДР развилась в 62.8% случаев после установления СД типа 2 в течение первых 5 лет. Впервые выявленная ДР, преимущественно 1 и 2 стадии, установлена нами при сроке СД типа 2 на момент исследования и продолжительности основного заболевания до 1 года в 30% случаев.

Данный факт подтверждает тяжесть диабетических микроангиопатий органа зрения, обусловливающих раннюю слепоту и слабовидение пациентов в первые годы заболевания.

В результате молекулярно-генетического исследования отмечено, что эмпирическое распределение частот генотипов полиморфного варианта Hind III гена LPL в популяции якутов соответствует теоретически ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга ( ²=0.008, Р=0.999).

Оценка распределения частот генотипов и аллелей полиморфного варианта Hind III гена липопротеинлипазы (LPL) обнаружила статистически значимые различия между больными ДР и контрольной группой (таблица 2).

Из таблицы 2 видно, что с наибольшей частотой в группе больных ДР, чем в контрольной группе, встречается генотип *G/*T (41.56% против 25.0%, Р=0.015) и аллель *Т (24.681% против 15.71%, Р=0.027) полиморфного варианта Hind III LPL. Относительный риск (OR) генотипа *G/*T составил 2.13 (CI_OR=1.19-3.81) и аллеля *T составил 1.76 (CI_OR=1.09-2.83). Частоты других генотипов и аллелей достоверно не различаются.

Предлагаемый способ позволяет при выявлении генотипа *G/*T и аллеля *Т полиморфного варианта Hind III гена липопротеинлипазы (LPL) у якутов прогнозировать риск развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2.

Выявленные генотип *G/*T и аллель *T полиморфного варианта Hind III гена липопротеинлипазы (LPL) являются маркерами повышенного риска диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 для данного этноса. Полученные результаты будут способствовать своевременному прогнозированию и/или выявлению группы риска по диабетической ретинопатии среди якутов и помогут определить тактику ведения пациента с предрасположенностью к диабетической ретинопатии с использованием индивидуального комплекса профилактических и лечебных мероприятий.