меченые пептиды, связывающие фактор роста гепатоцитов (hgf), для визуализации

Формула изобретения

1. Агент визуализации, представляющий собой конъюгат формулы I:

,

где Z¹ присоединен к N-концу сМВР и представляет собой Н или M^1G;

Z² присоединен к С-концу сМВР и представляет собой ОН, OB^C или M^IG, где B^C представляет собой биосовместимый катион;

сМВР представляет собой cMet-связывающий циклический пептид из 17-30 аминокислот, включающий аминокислотную последовательность (SEQ-1): Cys^a-X¹-Cys^c-X ²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys ^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶;

где X¹ представляет собой Asn, His или Tyr;

X² представляет собой Gly, Ser, Thr или Asn;

X³ представляет собой Thr или Arg;

X⁴ представляет собой Ala, Asp, Glu, Gly или Ser;

X ⁵ представляет собой Ser или Thr;

X⁶ представляет собой Asp или Glu;

и каждый из Cys ^a-d представляет собой остаток цистеина, так что остатки а и b, а также c и d циклизованы с образованием двух отдельных дисульфидных связей;

M^IG представляет собой группу, ингибирующую метаболизм, которая представляет собой биосовместимую группу, ингибирующую или подавляющую метаболизм сМВР-пептида in vivo;

L представляет собой синтетическую линкерную группу формулы -(А)_m-, где каждый А независимо представляет собой -CR₂-, -CR=CR-, -С С-, -CR₂CO₂-, -CO₂CR ₂-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO₂ NR-, -NRSO₂-, -CR₂OCR₂-, -CR ₂SCR₂-, -CR₂NRCR₂, C _4-8циклогетероалкиленовую группу, С_4-8циклоалкиленовую группу, С_5-12ариленовую группу или С_3-12 гетероариленовую группу, аминокислоту, сахар или монодисперсную полиэтиленгликолевую (PEG) структурную единицу;

каждый R независимо выбран из H, С_1-4алкила, С_2-4 алкенила, С_2-4алкинила, С_1-4алкоксиалкила или С_1-4гидроксиалкила;

m равен целому числу от 1 до 20;

n равен целому числу 0 или 1;

IM представляет собой оптическую репортерную визуализируемую группировку, подходящую для визуализации организма млекопитающего in vivo с использованием света в диапазоне длин волн в области спектра от зеленой до ближней инфракрасной: 600-1200 нм.

2. Агент визуализации по п.1, где, в дополнение к SEQ-1, сМВР дополнительно содержит остатки Asp или Glu в пределах 4 аминокислотных остатков с С- или N-конца сМВР-пептида, и -(L)_nIM функционализирована аминогруппой, которая конъюгирована с карбоксилом боковой цепи указанного остатка Asp или Glu с образованием амидной связи.

3. Агент визуализации по п.1 или 2, где, в дополнение к SEQ-1, сМВР дополнительно содержит остаток Lys в пределах 4 аминокислотных остатков с С- или N-конца сМВР-пептида, и -(L)_nIM функционализирована карбоксильной группой, которая конъюгирована с -аминогруппой боковой цепи указанного остатка Lys с образованием амидной связи.

4. Агент визуализации по п.1, где сМВР включает аминокислотную последовательность SEQ-2 или SEQ-3:

Ser-Cys ^a-X'-Cys^c-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys ^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X ⁶ (SEQ-2);

Ala-Gly-Ser-Cys^a-X¹ -Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys ^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X ⁶-Gly-Thr (SEQ-3).

5. Агент визуализации по п.1, где X³ представляет собой Arg.

6. Агент визуализации по п.4, где, в дополнение к SEQ-1, SEQ-2 или SEQ-3, сМВР дополнительно содержит на N- или С-конце линкерный пептид, выбранный из -Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4), -Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5) или -Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6).

7. Агент визуализации по п.6, где сМВР имеет аминокислотную последовательность (SEQ-7):

Ala-Gly-Ser-Cys^a -Tyr-Cys^c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys^d -Trp-Cys^d-Tyr-Glu-Thr-Glu-GIy-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.

8. Агент визуализации по п.1, где оба Z¹ и Z ² независимо представляют собой M^IG.

9. Агент визуализации по п.8, где Z¹=M^IG = ацетил, и Z²=M^IG = первичный амид.

10. Агент визуализации по п.1, где n равен 0.

11. Агент визуализации по п.1, где IM представляет собой краситель, имеющий максимум поглощения в диапазоне 600-1000 нм.

12. Агент визуализации по п.11, где IM представляет собой цианиновый краситель.

13. Агент визуализации по п.12, где цианиновый краситель представлен формулой III:

,

где R¹ и R² независимо представляют собой Н или SO₃M¹, и по меньшей мере один из R¹ и R² представляет собой SO₃M¹, где М¹ представляет собой Н или B^c;

R³ и R⁴ независимо представляют собой С_1-4алкил или C_1-6карбоксиалкил;

R⁵, R⁶, R⁷ и R⁸ независимо представляют собой группы R^a;

где R^a представляет собой С_1-4алкил, С _1-6карбоксиалкил или -(CH₂)_kSO ₃M¹,

где k равен целому числу 3 или 4;

при условии, что цианиновый краситель имеет суммарно от 1 до 4 заместителей SO₃M¹ в группах R¹, R² и R^a.

14. Агент визуализации по п.1, где сМВР является таким, как определено в п.7, Z¹ и Z² являются такими, как определено в п.9, и IM является таким, как определено в пп.3 и 13.

15. Фармацевтическая композиция для оптической визуализации in vivo, содержащая агент визуализации по любому из пп.1-14 вместе с биосовместимым носителем, в форме, подходящей для введения млекопитающему.

16. Фармацевтическая композиция по п.15 в дозировке, подходящей для индивидуального пациента, предложенная в подходящем шприце или контейнере.

17. Способ получения агента визуализации по любому из пп.1-14, включающий одну из стадий (1)-(4):

(1) взаимодействие сМВР-пептида формулы Z¹-[cMBP]-Z², где Z¹ представляет собой Н, и Z² представляет собой M^IG, с соединением формулы Y¹-(L)_n-[IM] с получением агента визуализации формулы I, где [IM] конъюгирован по положению Z¹;

(2) взаимодействие сМВР-пептида формулы Z¹-[cMBP]-Z², где Z¹ и Z ² оба представляют собой M^IG, и сМВР содержит остаток Asp или Glu в пределах 4 аминокислотных остатков с С- или М-конца сМВР-пептида, а все другие остатки Asp/Glu сМВР-пептида защищены, с соединением формулы Y²-(L)_n -[IM] с получением агента визуализации формулы I, где [IM] конъюгирован по указанному остатку Asp или Glu данного сМВР-пептида;

(3) взаимодействие сМВР-пептида формулы Z¹-[сМВР]-Z ³, где Z¹ представляет собой M^IG, и Z³ представляет собой группу Z² или активированный сложный эфир, а все другие остатки Asp/Glu сМВР-пептида защищены, с соединением формулы Y²-(L)_n-[IM] с получением агента визуализации формулы I, где [IM] конъюгирован по положению Z²;

(4) взаимодействие сМВР-пептида формулы Z¹-[cMBP]-Z², где Z¹ и Z ² оба представляют собой M^IG, и сМВР содержит остаток Lys в пределах 4 аминокислотных остатков с С- или N-конца сМВР-пептида, с соединением формулы Y¹-(L)_n -[IM] с получением агента визуализации формулы I, где [IM] конъюгирован по остатку Lys данного сМВР-пептида;

где Z¹ , сМВР, Z², M^IG, L, n и IM являются такими, как определено в п.1, и

Z³ представляет собой группу Z² или активированный сложный эфир;

Y¹ представляет собой карбоновую кислоту, активированный сложный эфир, изотиоцианатную или тиоцианатную группу;

Y² представляет собой аминогруппу.

18. Способ по п.17, при котором используют стадию взаимодействия (4).

19. Набор для приготовления фармацевтической композиции по п.15 или 16, содержащий агент визуализации по любому из пп.1-14 в стерильной твердой форме и биосовместимый носитель, так чтобы после разведения стерильной добавкой биосовместимого носителя по п.15 или 16 произошло растворение с получением желаемой фармацевтической композиции.

20. Набор по п.19, где стерильная твердая форма представляет собой лиофилизированное твердое вещество.

21. Способ оптической визуализации организма млекопитающего in vivo, включающий введение агента визуализации по любому из пп.1-14 или фармацевтической композиции по п.15 или 16 с получением изображений сайтов сверхэкспрессии или локализации cMet in vivo.

22. Способ по п.21, при котором агент визуализации по любому из пп.1-14 или фармацевтическую композицию по п.15 или 16 предварительно вводят в организм указанного млекопитающего.

23. Способ по п.22, включающий стадии, на которых:

(1) поверхность интересующей ткани в организме млекопитающего просвечивают возбуждающим светом;

(2) используя детектор флуоресценции, детектируют флуоресценцию от агента визуализации, генерируемую путем возбуждения визуализируемой группировки (IM);

(3) свет, детектируемый детектором флуоресценции, возможно фильтруют для отделения флуоресцентного компонента;

(4) из флуоресцентного свечения на стадиях (2) или (3) формируют изображение указанной поверхности интересующей ткани.

24. Способ по п.23, где возбуждающий свет на стадии (1) представляет собой незатухающую волну (CW) по природе.

25. Способ по п.22, при котором:

(а) светорассеивающую биологическую ткань указанного организма млекопитающего, имеющую гетерогенный состав, подвергают воздействию света от источника света с заранее установленной варьируемой по времени интенсивностью для возбуждения агента визуализации, при котором наблюдают многократное рассеяние возбуждающего света в указанной ткани;

(б) детектируют многократно рассеянное световое излучение от ткани в ответ на указанное воздействие;

(в) проводят количественное определение параметра флуоресценции по всей ткани на основании этого излучения путем установления ряда показателей с использованием процессора, где каждый из показателей соответствует уровню параметра флуоресценции в различных положениях в пределах этой ткани, и где данный уровень параметра флуоресценции варьирует согласно гетерогенному составу этой ткани; и

(г) генерируют изображение этой ткани путем построения изображения гетерогенного состава ткани в соответствии с показателями стадии (в).

26. Способ по п.21, где способ оптической визуализации включает флуоресцентную эндоскопию.

27. Способ по любому из пп.21-26, где оптическую визуализацию in vivo используют при проведении детектирования, определения стадии заболевания, диагностики, мониторинга прогрессирования заболевания или мониторинга лечения колоректального рака (CRC).

28. Способ ведения больных колоректальным раком (CRC), включающий детектирование, определение стадии заболевания, диагностику, мониторинг прогрессирования заболевания или мониторинг лечения колоректального рака организма млекопитающего, включающий способ оптической визуализации in vivo по любому из пп.21-26.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к меченым cMet-связывающим пептидам, подходящим для оптической визуализации in vivo. Эти пептиды включают метку оптической репортерной группой, подходящей для визуализации в области спектра от красной до ближней инфракрасной. Также раскрыты способы визуализации in vivo, в частности, для применения в диагностике колоректального рака (CRC).

Предшествующий уровень техники

В WO 2005/030266 раскрыто, что существует медицинская необходимость в ранней диагностике колоректального рака (CRC). В WO 2005/030266 раскрыты оптические контрастные агенты визуализации, имеющие аффинность в отношении биологической мишени, аномально экспрессирующейся при CRC. Данная биологическая мишень выбрана из следующих: циклооксигеназа-2 (СОХ-2), бета-катенин, Е-кадгерин, Р-кадгерин, различные киназы, Her-2, матриксные металлопротеиназы (ММР), циклины, Р53, тимидилат-синтаза, рецепторы фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецепторы эпидермального фактора роста, K-ras, белок аденоматозного полипоза толстой кишки, катепсин В, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR), рецептор фактора роста гепатоцитов (cMet), муцины и желудочные рецепторы. Сказано, что предпочтительные такие мишени (стр.7, строки 11-12) представляют собой: cMet, MMP-14, СОХ-2, бета-катенин и катепсин В. Вектор из WO 2005/030266 может представлять собой: пептид, пептоидную группировку, олигонуклеотид, олигосахарид, относящееся к липидам соединение или обычную органическую малую молекулу, подобную лекарствам. Репортерная группировка предпочтительно представляет собой краситель, который взаимодействует со светом в диапазоне длин волн от ультрафиолетовой до инфракрасной области электромагнитного спектра.

Фактор роста гепатоцитов (HGF), также известный как рассеивающий фактор (scatter factor, SF), представляет собой фактор роста, который вовлечен в различные физиологические процессы, такие как заживление ран и ангиогенез. Взаимодействие HGF с его высокоаффинным рецептором (cMet) вовлечено в рост, инвазию и метастазы опухолей.

В Knudsen et al. рассмотрена роль HGF и cMet в раке предстательной железы с возможным применением для визуализации и терапии [Adv.Cancer Res., 91, 31-67 (2004)]. Меченые антитела против met для диагностики и терапии описаны в WO 03/057155.

В WO 2004/078778 раскрыты полипептиды или мультимерные пептидные конструкции, которые связываются с cMet или комплексом, содержащим cMet и HGF. Описано приблизительно 10 различных структурных классов пептидов. В WO 2004/078778 раскрыто, что эти пептиды могут быть мечены детектируемой меткой для in vitro и in vivo применений или лекарственным средством для терапевтического применения. Детектируемая метка может представлять собой: фермент, флуоресцентное соединение, оптический краситель, ион парамагнитного металла, ультразвуковой контрастный агент или радионуклид. Сказано, что предпочтительные метки согласно WO 2004/078778 являются радиоактивными или парамагнитными и, наиболее предпочтительно, включают металл, который хелатирован металл-хелатирующим агентом.

Настоящее изобретение

В настоящем изобретении предложены агенты визуализации, подходящие для оптической визуализации in vivo, которые содержат cMet-связывающие циклические пептиды и оптическую репортерную визуализируемую группировку, подходящую для визуализации организма млекопитающего in vivo с использованием света в диапазоне длин волн от зеленой до ближней инфракрасной области спектра 500-1200 нм. cMet-связывающие циклические пептиды относятся к одному из структурных классов пептида из WO 2004/078778 и имеют оптимальную аффинность связывания в отношении cMet. Эти пептиды имеют происхождение из фагового дисплея и отобраны по их аффинности в отношении cMet и отсутствию конкуренции с HGF, как описано в WO 2004/078778. cMet-связывающие пептиды по настоящему изобретению предпочтительно имеют по меньшей мере один из их концов, защищенных группами, ингибирующими метаболизм (M ^IG). Это является важным фактором для применения in vivo, где эндогенные ферменты и пептидазы в противном случае будут быстро метаболизировать пептид с последующей потерей cMet-связывающей аффинности и тем самым потерей избирательного нацеливания in vivo.

В настоящем изобретении предложен наилучший путь использования cMet-связывающих пептидов in vivo, включающий применение оптического репортера, в противоположность другим способам визуализации (например, ядерной, магнитно-резонансной визуализации (MRI) или ультразвуковой), и кроме того предложены предпочтительные оптические визуализируемые репортеры. Область спектра от зеленой до ближней инфракрасной (свет с длиной волны 500-1200 нм) является предпочтительной, так как эта область имеет минимальное спектральное перекрывание с эндогенными тканями и веществами, такими как гемоглобин, порфирины, меланин и коллаген [Licha, Topics Curr. Chem., 222, 1-29 (2002)]. Другие важные факторы, вносящие вклад в аутофлуоресценцию, представляют собой восстановленный никотинамид-адениндинуклеотид (NADH), флавин-адениндинуклеотид (FAD) и эластин.

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящего изобретения предложен агент визуализации, включающий конъюгат формулы I:

где:

Z¹ присоединен к N-концу сМВР и представляет собой Н или M^IG;

Z² присоединен к С-концу сМВР и представляет собой ОН, OB^c или M^IG, где B^c представляет собой биосовместимый катион;

сМВР представляет собой cMet-связывающий циклический пептид из 17-30 аминокислот, который включает аминокислотную последовательность (SEQ-1):

Cys^a-X¹-Cys ^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys ^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X ⁶; где

X¹ представляет собой Asn, His или Tyr;

X² представляет собой Gly, Ser, Thr или Asn;

X³ представляет собой Thr или Arg;

X⁴ представляет собой Ala, Asp, Glu, Gly или Ser;

X⁵ представляет собой Ser или Thr;

X⁶ представляет собой Asp или Glu;

и каждый из Cys ^a-d представляет собой остаток цистеина, так что остатки а и b, а также c и d циклизованы с образованием двух отдельных дисульфидных связей;

M^IG представляет собой группу, ингибирующую метаболизм, которая представляет собой биосовместимую группу, ингибирующую или подавляющую метаболизм сМВР-пептида in vivo;

L представляет собой синтетическую линкерную группу формулы -(А)_m-, где каждый А независимо представляет собой -CR₂-, -CR=CR-, -C C-, -CR₂CO₂-, -CO₂CR ₂-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO₂ NR-, -NRSO₂-, -CR₂OCR₂-, -CR ₂SCR₂-, -CR₂NRCR₂-, С _4-8циклогетероалкиленовую группу, С_4-8циклоалкиленовую группу, С_5-12ариленовую группу или С_3-12 гетероариленовую группу, аминокислоту, сахар или монодисперсную полиэтиленгликолевую (PEG) структурную единицу;

каждый R независимо выбран из Н, С_1-4алкила, С _2-4алкенила, С_2-4алкинила, С_1-4алкоксиалкила или С_1-4гидроксиалкила;

m равен целому числу от 1 до 20;

n равен целому числу 0 или 1;

IM представляет собой оптическую репортерную визуализируемую группировку, подходящую для визуализации организма млекопитающего in vivo с использованием света в диапазоне длин волн в области спектра от зеленой до ближней инфракрасной: 600-1200 нм.

Термин "агент визуализации" означает соединение, подходящее для визуализации организма млекопитающего in vivo. Предпочтительно, млекопитающее представляет собой человека. Визуализация может быть инвазивной (например, интраоперационной или эндоскопической) или неинвазивной. Предпочтительный способ визуализации представляет собой эндоскопию. Хотя конъюгат формулы I подходит для визуализации in vivo, он также может быть использован in vitro (например, для анализов количественного определения cMet в биологических образцах или визуализации cMet в тканевых образцах). Предпочтительно, агент визуализации используют для визуализации in vivo.

Группа Z¹ замещает аминогруппу последнего аминокислотного остатка. Таким образом, когда Z¹ представляет собой Н, амино-конец сМВР оканчивается свободной группой NH₂ последнего аминокислотного остатка. Группа Z² замещает карбонильную группу последнего аминокислотного остатка. Таким образом, когда Z² представляет собой ОН, карбокси-конец сМВР оканчивается свободной группой CO₂H последнего аминокислотного остатка, и когда Z² представляет собой OB^c, эта концевая карбоксильная группа ионизирована в виде группы CO₂B^c.

Термин "группа, ингибирующая метаболизм" (M^IG) означает биосовместимую группу, которая ингибирует или подавляет метаболизм сМВР-пептида in vivo либо по амино-концу (Z¹ ), либо по карбокси-концу (Z²). Такие группы хорошо известны специалистам в данной области техники и выбраны подходящим образом, для амино-конца пептидов, из: N-ацилированных групп -NH(C=О)R^G, где ацильная группа -(C=O)R^G имеет R^G, выбранный из C_1-6алкила, С _3-10арильных групп, или содержит полиэтиленгликолевую (PEG) структурную единицу. Подходящие группы PEG описаны ниже для линкерной группы (L). Предпочтительные такие группы PEG представляют собой биомодификаторы формулы IA или IB. Предпочтительные такие аминоконцевые группы M^IG представляют собой ацетил, бензилоксикарбонил или трифторацетил, наиболее предпочтительно ацетил.

Подходящие группы, ингибирующие метаболизм, для пептидного карбоксильного конца включают: карбоксамид, трет-бутиловый эфир, бензиловый эфир, циклогексиловый эфир, аминоспирт или полиэтиленгликолевую (PEG) структурную единицу. Подходящая группа M^IG для карбоксильного концевого аминокислотного остатка сМВР-пептида является такой, где концевая аминогруппа аминокислотного остатка N-алкилирована C_1-4алкильной группой, предпочтительно метильной группой. Предпочтительные такие группы M^IG представляют собой карбоксамид или PEG, наиболее предпочтительные такие группы представляют собой карбоксамид.

Формула I означает, что группировка -(L)_n[IM] может быть присоединена по любому положению Z¹, Z² или сМВР. Для Z¹ или Z² группировка -(L)_n[IM] может быть либо присоединена к группе M^IG, где один из Z¹/Z² представляет собой M^IG . Когда Z¹ представляет собой Н, или Z² представляет собой ОН, присоединение группировки -(L)_n [IM] по положению Z¹ или Z² дает соединения формул [IM]-(L)_n-[cMBP]-Z² или Z¹ -[cMBP]-(L)_n-[IM], соответственно. Ингибирование метаболизма сМВР по одному из пептидных концов может также быть достигнуто путем присоединения группировки -(L)_n[IM] таким образом, но -(L)_n[IM] не охватывается определением M^IG по настоящему изобретению.

Группировка -(L) _n- формулы I может быть присоединена по любому подходящему положению IM. Группировка -(L)_n- либо занимает место имеющегося заместителя IM, либо ковалентно присоединена к имеющемуся заместителю IM. Группировка -(L)_n- предпочтительно присоединена через карбоксиалкильный заместитель IM.

Термин "cMet-связывающий циклический пептид" (сМВР) означает пептид, который связывается с высокоаффинным рецептором фактора роста гепатоцитов (HGF), также известным как cMet (c-Met или рецептор фактора роста гепатоцитов). Подходящие сМВР-пептиды по настоящему изобретению имеют кажущуюся константу диссоциации (K_D) для cMet из комплекса cMet/HGF менее чем приблизительно 20 нМ. Указанные сМВР-пептиды содержат остатки пролина, и известно, что такие остатки могут проявлять цис/транс изомеризацию основной амидной связи. сМВР-пептиды по настоящему изобретению включают любые такие изомеры.

Термин "биосовместимый катион" (B^c) означает положительно заряженный противоион, который образует соль с ионизированной отрицательно заряженной группой, где указанный положительно заряженный противоион является также нетоксичным и поэтому подходящим для введения в организм млекопитающего, особенно организм человека. Примеры подходящих биосовместимых катионов включают: щелочные металлы натрий и калий; щелочноземельные металлы кальций и магний; и ион аммония. Предпочтительные биосовместимые катионы представляют собой натрий и калий, наиболее предпочтительно натрий.

Термин "аминокислота" означает L- или D-аминокислоту, аналог аминокислоты (например, нафтилаланин) или миметик аминокислоты, которые могут быть естественного происхождения или получены тонким синтезом, и могут быть оптически чистыми, то есть в виде индивидуального энантиомера и поэтому хиральными, или в виде смеси энантиомеров. Для обозначения аминокислот в данном описании использованы общепринятые 3-буквенные или однобуквенные сокращения. Предпочтительно, аминокислоты по настоящему изобретению являются оптически чистыми. Термин "миметик аминокислоты" означает синтетические аналоги существующих в природе аминокислот, которые являются изостерами, то есть разработаны так, чтобы имитировать стерическую и электронную структуру природного соединения. Такие изостеры хорошо известны специалистам в данной области техники и включают депсипептиды, ретро-инверсо-пептиды, тиоамиды, циклоалканы или 1,5-дизамещенные тетразолы, но не ограничены ими [см. М. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)].

Термин "пептид" означает соединение, содержащее две или более аминокислот, как определено выше, связанных пептидной связью (то есть амидной связью, присоединяющей амин одной аминокислоты к карбоксилу другой аминокислоты). Термин "миметик пептида" или "миметик" относится к биологически активным соединениям, которые имитируют биологическую активность пептида или белка, но более не являются пептидными по химической природе, то есть они более не содержат никаких пептидных связей (то есть амидных связей между аминокислотами). Здесь термин «миметик пептида» используют в более широком смысле для включения молекул, которые более не являются полностью пептидными по природе, таких как псевдопептиды, полупептиды и пептоиды.

Термин "оптическая репортерная визуализируемая группировка" (IM) означает флуоресцентный краситель или хромофор, способный к обнаружению прямо или опосредованно в процедуре оптической визуализации с использованием света в диапазоне длин волн в области спектра от зеленой до ближней инфракрасной (500-1200 нм, предпочтительно 600-1000 нм). Предпочтительно IM имеет флуоресцентные свойства.

Предусмотрено, что одна из ролей линкерной группы -(А)_m- формулы I заключается в том, чтобы отдалять IM от активного сайта сМВР-пептида. Это особенно важно, когда визуализируемая группировка является относительно объемной, так чтобы не препятствовать взаимодействию с ферментом. Этого можно достичь комбинацией гибкости (например, простые алкильные цепи), так что эта объемная группа имеет свободу для саморасположения вдали от активного сайта, и/или жесткости, такой как циклоалкильный или арильный спейсер, который ориентирует IM вдали от активного сайта. Природа линкерной группы может также быть использована для модификации биораспределения агента визуализации. Таким образом, например, включение эфирных групп в линкер будет способствовать минимизации связывания с белками плазмы. Когда -(А)_m- содержит полиэтиленгликолевую (PEG) структурную единицу или пептидную цепь из 1-10 аминокислотных остатков, линкерная группа может иметь функцию модифицирования фармакокинетических параметров и скорости клиренса из крови агента визуализации in vivo. Такие "биомодифицирующие" линкерные группы могут ускорять клиренс агента визуализации из фоновой ткани, такой как мышечная или печеночная, и/или из крови, тем самым давая лучшее диагностическое изображение вследствие меньших фоновых помех. Биомодифицирующая линкерная группа может также быть использована для того, чтобы способствовать конкретному пути экскреции, например, через почки, в противоположность пути через печень.

Термин "сахар" означает моно-, ди- или трисахарид. Подходящие сахара включают: глюкозу, галактозу, мальтозу, маннозу и лактозу. Возможно, сахар может быть функционализирован, чтобы обеспечить легкое сочетание с аминокислотами. Таким образом, например, глюкозаминное производное аминокислоты может быть конъюгировано с другими аминокислотами через пептидные связи. Глюкозаминное производное аспарагина (имеющееся в продаже от NovaBiochem) представляет собой один из таких примеров:

Предпочтительные признаки

Молекулярная масса агента визуализации составляет подходящим образом вплоть до 8000 Дальтон. Предпочтительно, молекулярная масса находится в диапазоне от 2800 до 6000 Дальтон, наиболее предпочтительно от 3000 до 4500 Дальтон, особенно предпочтительно от 3200 до 4000 Дальтон.

Предпочтительные агенты визуализации по настоящему изобретению имеют оба пептидных конца, защищенных группами M^IG, то есть предпочтительно оба Z¹ и Z² представляют собой M^IG , которые будут, как правило, разными. Как указано выше, один из Z¹/Z² может возможно представлять собой -(L)_n[IM]. Наличие обоих замещенных пептидных концов в данном случае важно для применений визуализации in vivo, так как в противном случае ожидается быстрый метаболизм с последующей потерей аффинности избирательного связывания в отношении cMet. Когда оба Z¹ и Z² представляют собой M ^IG, предпочтительно Z¹ представляет собой ацетил, и Z² представляет собой первичный амид. Наиболее предпочтительно, Z¹ представляет собой ацетил, и Z² представляет собой первичный амид, и группировка -(L)_n[IM] присоединена к -аминогруппе боковой цепи остатка лизина в сМВР.

Предпочтительные сМВР-пептиды по настоящему изобретению имеют K_D в отношении связывания cMet с комплексом cMet/HGF менее чем приблизительно 10 нМ (на основе анализа измерений поляризации флуоресценции), наиболее предпочтительно в диапазоне от 1 до 5 нМ, в идеальном случае менее чем 3 нМ,

Пептидная последовательность (SEQ-1):

Cys^a-X ¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³ -Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴ -X⁵-X⁶ (SEQ-1)

сМВР формулы I представляет собой последовательность 17-мерного пептида, ответственную главным образом за избирательное связывание с cMet. Когда сМВР-пептид по настоящему изобретению содержит более чем 17 аминокислотных остатков, остальные аминокислоты могут представлять собой любую аминокислоту, за исключением цистеина. Дополнительно, незащищенные остатки цистеина могут вызывать нежелательное скремблирование определенных дисульфидных мостиков Cys^a-Cys^b и Cys^c-Cys^d. Дополнительные пептиды предпочтительно содержат по меньшей мере один аминокислотный остаток с боковой цепью, подходящей для легкой конъюгации группировки -(L) _n[IM]. Подходящие такие остатки включают остатки Asp или Glu для конъюгации с группами -(L)_n[IM], функционализированными аминогруппами, или остаток Lys для конъюгации с группой -(L) _n[IM], функционализированной карбоксигруппами или активным сложным эфиром. Аминокислотные остатки для конъюгации -(L) _n[IM] подходящим образом локализованы вдали от 17-мерного связывающего участка сМВР-пептида (SEQ-1) и предпочтительно локализованы на С- или N-конце. Предпочтительно, аминокислотный остаток для конъюгации представляет собой остаток Lys.

Замещение остатка триптофана SEQ-1 оценивали с известными аминокислотными заместителями фенилаланином и нафтилаланином. Однако была обнаружена потеря аффинности в отношении cMet, подтверждая тот факт, что остаток триптофана важен для активности.

Предпочтительно, когда сМВР-пептид дополнительно содержит N-концевой остаток серина с получением 18-мера (SEQ-2):

Ser-Cys^a -X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X ³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X ⁴-X⁵-X⁶ (SEQ-2)

В дополнение к SEQ-1 или предпочтительно SEQ-2, сМВР наиболее предпочтительно дополнительно включает одно из следующего:

(1) остаток Asp или Glu в пределах 4 аминокислотных остатков пептидного С- или N-конца сМВР-пептида, и -(L)_nIM функционализирована аминогруппой, которая конъюгирована с карбоксилом боковой цепи указанного остатка Asp или Glu с получением амидной связи;

(2) остаток Lys в пределах 4 аминокислотных остатков пептидного С- или N-конца сМВР-пептида, и -(L)_nIM функционализирована карбоксильной группой, которая конъюгирована с -аминогруппой боковой цепи указанного остатка Lys с получением амидной связи.

Предпочтительные сМВР-пептиды содержат 22-мерную аминокислотную последовательность (SEQ-3):

Ala-Gly-Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X ²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys ^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶-Gly-Thr (SEQ-3)

сМВР-пептиды по настоящему изобретению предпочтительно имеют X³, представляющий собой Arg.

сМВР-пептид предпочтительно дополнительно содержит, в дополнение к SEQ-1, SEQ-2 или SEQ-3, по любому из N- или С-концов линкерный пептид, выбранный из:

-Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4), -Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5) или

-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6).

Остаток Lys линкерного пептида является наиболее предпочтительной точкой локализации для конъюгации группировки -(L)_n[IM]. Особенно предпочтительные сМВР-пептиды содержат SEQ-3 вместе с линкерным пептидом SEQ-4, давая 26-мерную аминокислотную последовательность (SEQ-7):

Ala-Gly-Ser-Cys ^a-Tyr-Cys^c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys ^d-Trp-Cys^b-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys (SEQ-7)

сМВР-пептиды с SEQ-1, SEQ-2, SEQ-3 и SEQ-7 предпочтительно имеют Z¹ и Z², оба представляющих собой M^IG, и, наиболее предпочтительно, имеют Z ¹, представляющий собой ацетил, и Z², представляющий собой первичный амид.

Группировка -(L)_n [IM] подходящим образом присоединена к одной из групп Z¹ или Z² или аминоксилотному остатку сМВР-пептида, который отличается от cMet-связывающей последовательности SEQ-1. Предпочтительные аминокислотные остатки и сайты конъюгации являются такими, как описано выше. Когда группировка -(L)_n[IM] присоединена к Z¹ или Z², она может занимать место Z¹ или Z² при конъюгации по N- или С-концу и блокировать метаболизм in vivo таким образом.

Предпочтительные группы IM имеют распространенную делокализованную систему электронов, например, цианины, мероцианины, индоцианины, фталоцианины, нафталоцианины, трифенилметины, порфирины, пирилиевые красители, тиапирилиевые красители, скварилиевые красители, крокониевые красители, азулениевые красители, индоанилины, бензофеноксазиниевые красители, бензотиафенотиазиниевые красители, антрахиноны, нафтохиноны, индатрены, фталоилакридоны, трисфенохиноны, азокрасители, красители с внутримолекулярным и межмолекулярным переносом заряда и комплексы красителей, тропоны, тетразины, бис(дитиолен)овые комплексы, бис(бензол-дитиолат)ные комплексы, иоданилиновые красители, бис(S,O-дитиолен)овые комплексы. Флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и модификации GFP, которые имеют различные свойства поглощения/испускания, также являются полезными. Комплексы некоторых редкоземельных металлов (например европия, самария, тербия или диспрозия) используют в некоторых контекстах, так как они являются флуоресцентными нанокристаллами (квантовые точки).

Конкретные примеры хромофоров, которые могут быть использованы, включают флуоресцеин, сульфородамин 101 (техасский красный), родамин В, родамин 6G, родамин 19, индоцианиновый зеленый, Су2, Су3В, Су3.5, Су5, Су5.5, Су7, Су7.5, Marina Blue, Pacific Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 514, тетраметилродамин, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700 и Alexa Fluor 750. Цианиновые красители являются особенно предпочтительными. Licha et al. приводят обзор по красителям и конъюгатам с красителями для оптической визуализации in vivo [Topics Curr. Chem., 222, 1-29 (2002); Adv.Drug Deliv.Rev., 57, 1087-1108 (2005)].

Предпочтительные цианиновые красители, которые являются флуорофорами, представлены формулой II:

где каждый X' независимо выбран из: -С(СН₃)₂, -S-, -О- или -С[(СН₂ )_аСН₃][(СН₂)_bM]-, где а равен целому числу от 0 до 5, b равен целому числу от 1 до 5, и М представляет собой группу G или выбран из SO₃ M¹ или Н;

каждый Y' независимо представляет собой 1-4 группы, выбранные из группы, состоящей из:

H, -CH₂NH₂, -SO ₃M¹, -СН₂СООМ¹, -NCS и F, и где указанные группы Y' находятся по любому положению ароматического кольца;

Q' независимо выбран из группы, состоящей из: H, SO₃M¹, NH ₂, COOM¹, аммония, сложноэфирных групп, бензила и группы G;

М¹ представляет собой Н или B^c;

I равен целому числу от 1 до 3;

и m равен целому числу от 1 до 5;

где по меньшей мере один из X', Y' и Q' включает группу G;

G представляет собой реакционноспособную или функциональную группу, подходящую для присоединения к сМВР-пептиду.

Группа G взаимодействует с комплементарной группой сМВР-пептида, образуя ковалентную связь между флуорофором цианинового красителя и сМВР-пептидом. G может представлять собой реакционноспособную группу, которая может взаимодействовать с комплементарной функциональной группой пептида или, альтернативно, может включать функциональную группу, которая может взаимодействовать с реакционноспособной группой сМВР-пептида. Примеры реакционноспособных и функциональных групп включают: активные сложные эфиры; изотиоцианаты; малеимид; галогеноацетамид; галогенангидрид; гидразид; винилсульфон; дихлортриазин; фосфорамидит; гидроксил; амино; сульфгидрил; карбонил; карбоновую кислоту и тиофосфат. Предпочтительно G представляет собой активный сложный эфир.

Термин "активированный сложный эфир" или "активный сложный эфир" означает сложноэфирное производное ассоциированной карбоновой кислоты, которое является лучшей уходящей группой и поэтому обеспечивает более легкое взаимодействие с нуклеофилом, таким как амины. Примеры подходящих активных сложных эфиров представляют собой: N-гидроксисукцинимид (NHS), сульфо-сукцинимидиловый эфир, пентафторфенол, пентафтортиофенол, пара-нитрофенол, гидроксибензотриазол и РуВОР (то есть гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония). Предпочтительные активные сложные эфиры представляют собой N-гидроксисукцинимидные или пентафторфенольные сложные эфиры, особенно N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры.

В предпочтительном воплощении формулы II:

каждый X' выбран из группы -С(СН₃ )₂- и -С(СН₃)[(СН₂)₄ М]-,

где М представляет собой группу G или -SO ₃M¹;

каждый Y' представляет собой SO₃M¹, Н или 1-4 атома F;

каждый Q' выбран из группы G и SO₃M¹ ;

I предпочтительно равен 2, и m предпочтительно равен 3, 4 или 5;

где, когда один из X' или Q' представляет собой группу G, она наиболее предпочтительно представляет собой сукцинимидиловый сложный эфир.

Особенно предпочтительные цианиновые красители представлены формулой III:

где R¹ и R² независимо представляют собой Н или SO₃M¹, и по меньшей мере один из R¹ и R² представляет собой SO₃M¹, где М¹ представляет собой Н или B^c;

R³ и R⁴ независимо представляют собой С_1-4алкил или C _1-6карбоксиалкил;

R⁵, R⁶ , R⁷ и R⁸ независимо представляют собой группы R^a;

где R^a представляет собой С_1-4алкил, C_1-6карбоксиалкил или -(CH₂)_kSO₃M¹, где k равен целому числу 3 или 4;

при условии, что цианиновый краситель имеет суммарно 1-4 заместителя SO₃ M¹ в группах R¹, R² и R ^a.

Предпочтительные красители формулы III выбраны таким образом, чтобы присутствовала по меньшей мере одна С_1-6карбоксиалкильная группа, для того чтобы облегчить конъюгацию с сМВР.

Предпочтительные индивидуальные красители формулы III перечислены в Таблице 1.

Таблица 1
Химические структуры индивидуальных цианиновых красителей
Таблица 1	Название красителя
	Су5(1)	Су5(2)	Су5**	Alexa647
R1	Н	SO3H	SO3H	SO3H
R2	SO 3H	SO 3H	SO 3H	SO 3H
R3	СН 3	СН3	СН3	Rf
R4	СН3	СН3	СН 3	СН3
R 5	СН3	СН3	СН3	СН3
R6	СН 3	СН3	-(СН2 )4SO3H	СН3
R7	R f	Rf	Rf	-(СН2) 3SO3H
R8	СН 3	Et	-(СН2)4SO3H	-(СН2)3SO3H

где R^f представляет собой -(СН₂)₅СООН.

Особенно предпочтительные красители формулы II представляют собой Су5** и Alexa647, причем Су5** является наиболее предпочтительным.

Когда присутствует синтетическая линкерная группа (L), она предпочтительно содержит концевые функциональные группы, которые облегчают конъюгацию с [IM] и Z¹-[cMBP]-Z ². Когда L содержит пептидную цепь из 1-10 аминокислотных остатков, эти аминокислотные остатки предпочтительно выбраны из глицина, лизина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или серина. Когда L содержит группировку PEG, она предпочтительно содержит структурные единицы, полученные при олигомеризации монодисперсных PEG-подобных структур формул IA или IB:

17-амино-5-оксо-6-аза-3,9,12,15-тетраоксагептадекановая кислота формулы IA, где p равен целому числу от 1 до 10. Альтернативно, может быть использована PEG-подобная структура на основе производного пропионовой кислоты формулы IB:

где p является таким, как определено для формулы IA, и q равен целому числу от 3 до 15.

В формуле IB, p предпочтительно равен 1 или 2, и q предпочтительно равен числу от 5 до 12.

Когда линкерная группа не содержит PEG или пептидную цепь, предпочтительные группы L имеют основную цепь соединенных атомов, образующих группировку -(А)_m- из 2-10 атомов, наиболее предпочтительно из 2-5 атомов, особенно предпочтительно из 2 или 3 атомов. Минимальная линкерная группа с основной цепью из 2 атомов дает преимущество в том, что визуализируемая группировка хорошо отделена, так что какое-либо нежелательное взаимодействие минимизировано.

В формуле I, n предпочтительно равен 0 или 1, наиболее предпочтительно 0, то есть не присутствует никаких линкерных групп.

Предпочтительные агенты визуализации по настоящему изобретению представлены формулой IV:

где группа (L)_n[IM] присоединена к -аминогруппе остатка Lys. Предпочтительные агенты визуализации формулы IV имеют M^IG (N-концевой Ala), представляющую собой ацетил, и M^IG (С-концевой Lys), представляющую собой первичный амид. В формуле IV, n предпочтительно равен нулю, и IM предпочтительно представляет собой цианиновый краситель, наиболее предпочтительно цианиновый краситель формулы II, Особенно предпочтительные агенты визуализации формулы IV имеют IM, представляющую собой Су5** или Alexa647, наиболее предпочтительно Су5**.

Пептиды формулы Z¹-[cMBP]-Z² по настоящему изобретению могут быть получены способом получения, включающим:

(1) твердофазный пептидный синтез линейного пептида, который имеет такую же пептидную последовательность, как и желаемый сМВР-пептид, и в котором Cys^a и Cys ^b не защищены, а остатки Cys^c и Cys^d имеют защитные группы для тиола;

(2) обработку пептида со стадии (1) водным основанием в растворе с получением моноциклического пептида с первой дисульфидной связью, соединяющей Cys^a и Cys^b;

(3) удаление с Cys^c и Cys^d защитных групп для тиола и циклизацию с получением второй дисульфидной связи, соединяющей Cys^c и Cys^d, с получением желаемого бициклического пептидного продукта Z¹-[cMBP]-Z².

Термин "защитная группа" означает группу, которая ингибирует или подавляет нежелательные химические реакции, но которая предназначена быть достаточно реакционноспособной, так чтобы ее можно было удалить с интересующей функциональной группы в достаточно мягких условиях, которые не изменяют остальную часть молекулы. После удаления защиты получают желаемый продукт. Защитные группы для амино хорошо известны специалистам в данной области техники, и они подходящим образом выбраны из: Boc (где Boc представляет собой трет-бутоксикарбонил), Fmoc (где Fmoc представляет собой флуоренилметоксикарбонил), трифторацетила, аллилоксикарбонила, Dde [то есть 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-этил] или Npys (то есть 3-нитро-2-пиридинсульфенил). Подходящие защитные группы для тиола представляют собой Trt (тритил), Асm (ацетамидометил), t-Bu (трет-бутил), трет-бутилтио, метоксибензил, метилбензил или Npys (3-нитро-2-пиридинсульфенил). Использование других защитных групп описано в "Protective Groups in Organic Synthesis", Theorodora W. Greene и Peter G.M.Wuts, (John Wiley & Sons, 1991). Предпочтительные защитные группы для амино представляют собой Воc и Fmoc, наиболее предпочтительно Boc. Предпочтительные защитные группы для амино представляют собой Trt и Acm.

В Примерах 1 и 2 предложено дополнительное конкретное описание. Дополнительные подробности твердофазного пептидного синтеза описаны в Р. Lloyd-Williams, F. Albericio and E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997. сМВР-пептиды лучше всего хранить в атмосфере инертного газа и выдерживать в морозильной камере. При использовании в растворе лучше избегать значений рН выше 7, так как это повышает риск скремблирования дисульфидных мостиков.

Агенты визуализации могут быть получены как описано в третьем аспекте (ниже).

Во втором аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая агент визуализации по первому аспекту вместе с биосовместимым носителем, в форме, подходящей для введения млекопитающему.

"Биосовместимый носитель" представляет собой жидкость, в частности жидкость, в которой агент визуализации может быть суспендирован или растворен, так чтобы композиция была физиологически переносимой, то есть могла быть введена в организм млекопитающего без проявления токсичности или чрезмерного дискомфорта. Биосовместимый носитель представляет собой подходящим образом инъецируемый жидкий носитель, такой как стерильная апирогенная вода для инъекций; водный раствор, такой как физиологический раствор (который может быть преимущественно отрегулирован так, чтобы конечный продукт для инъекции был изотоническим); водный раствор одного или более чем одного вещества, регулирующего тоничность (например, соли катионов плазмы с биосовместимыми противоионами), сахара (например глюкоза или сахароза), сахарные спирты (например сорбит или маннит), гликоли (например глицерин) или другие неионные полиолы (например полиэтиленгликоли, пропиленгликоли и тому подобное). Предпочтительно, биосовместимый носитель представляет собой апирогенную воду для инъекций или изотонический физиологический раствор.

Агенты визуализации и биосовместимый носитель каждый предложены в подходящих флаконах или сосудах, включающих герметичный контейнер, который обеспечивает поддержание стерильной целостности и/или радиоактивной безопасности, а также, возможно, инертный газ в свободном пространстве над продуктом (например, азот или аргон), в то же время обеспечивая возможность добавления и извлечения растворов шприцем или канюлей. Предпочтительный такой контейнер представляет собой закрытый герметичной мембраной флакон, где газонепроницаемая крышка прижата дополнительным укупорочным средством (как правило, алюминиевым). Указанная крышка является подходящей для прокалывания шприцем или многократного прокалывания иглой для подкожных инъекций (например, герметичная крышка с прижатой мембраной), в то же время сохраняя стерильную целостность. Такие контейнеры имеют дополнительное преимущество в том, что крышка может выдерживать вакуум при необходимости (например, для смены газа в свободном пространстве над продуктом или дегазации растворов) и выдерживать изменения давления, такие как падения давления, не давая возможности при этом проникновения внешних атмосферных газов, таких как кислород или пары воды.

Предпочтительные многодозовые контейнеры включают флакон с единым содержимым (например, объемом от 10 до 30 см³), который содержит множество доз для пациента, причем разовые дозы для пациента могут таким образом быть извлечены в шприцы для клинического применения в различные интервалы времени в течение приемлемого срока годности препарата в соответствии с данной клинической ситуацией. Предварительно заполненные шприцы разработаны для содержания однократной дозы для человека, или "стандартной дозы" и, таким образом, предпочтительно представляют собой одноразовые или другие шприцы, подходящие для клинического применения. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно имеют дозировку, подходящую для индивидуального пациента, и предложены в подходящем шприце или контейнере, как описано выше.

Фармацевтическая композиция возможно может содержать дополнительные эксципиенты, такие как противомикробный консервант, рН-регулирующий агент, наполнитель, стабилизатор или агент, регулирующий осмоляльность. Термин "противомикробный консервант" означает агент, ингибирующий рост потенциально вредных микроорганизмов, таких как бактерии, дрожжи или плесневые грибы. Противомикробный консервант может также проявлять некоторые бактерицидные свойства, в зависимости от используемой дозировки. Основная роль противомикробного(ых) консерванта(ов) по настоящему изобретению заключается в том, чтобы ингибировать рост любого такого микроорганизма в фармацевтической композиции. Однако, противомикробный консервант возможно также может быть использован для ингибирования роста потенциально вредных микроорганизмов в одном или более чем одном компоненте наборов, используемых для приготовления указанной композиции перед введением. Подходящие противомикробные консерванты включают: парабены, то есть метил-, этил-, пропил- или бутилпарабен или их смеси; бензиловый спирт; фенол; крезол; цетримид и тиомерсал. Предпочтительные противомикробные консерванты представляют собой парабены.

Термин "рН-регулирующий агент" означает соединение или смесь соединений, применяемых для обеспечения того, чтобы значение рН композиции находилось в пределах приемлемых границ (приблизительно рН от 4,0 до 10,5) для введения человеку или млекопитающему. Подходящие такие рН-регулирующие агенты включают фармацевтически приемлемые буферы, такие как трициновый, фосфатный или TRIS [то есть трис(гидроксиметил)-аминометан], и фармацевтически приемлемые основания, такие как карбонат натрия, бикарбонат натрия или их смеси. Когда композицию используют в форме набора, рН-регулирующий агент возможно может быть предложен в отдельном флаконе или контейнере, так чтобы пользователь данного набора мог регулировать значение рН как часть многостадийной процедуры.

Термин "наполнитель" означает фармацевтически приемлемый наполняющий агент, который может облегчить обработку материала во время производства и лиофилизации. Подходящие наполнители включают неорганические соли, такие как хлорид натрия, и водорастворимые сахара или сахарные спирты, такие как сахароза, мальтоза, маннит или трегалоза.

Фармацевтические композиции по второму аспекту могут быть изготовлены в асептических условиях производства (например, стерильной комнате) с получением желаемого стерильного апирогенного продукта. Предпочтительно, когда ключевые компоненты, особенно ассоциированные реагенты, а также те части оборудования, которые вступают в контакт с агентом визуализации (например, флаконы), были стерильными. Компоненты и реагенты могут быть стерилизованы способами, известными в данной области техники, включая: стерильную фильтрацию, терминальную стерилизацию с использованием, например, гамма-облучения, автоклавирования, сухого нагрева или химической обработки (например, этиленоксидом). Предпочтительно стерилизовать некоторые компоненты заранее, так чтобы требовалось осуществлять минимальное количество манипуляций. Однако, в качестве меры предосторожности, предпочтительно включать по меньшей мере стадию стерильной фильтрации в качестве конечной стадии в изготовлении фармацевтической композиции.

Фармацевтическая композиция по второму аспекту возможно может быть приготовлена из набора, как описано для четвертого аспекта ниже.

В третьем аспекте настоящего изобретения предложен способ получения агента визуализации по первому аспекту, включающий одну из стадий (1)-(4):

(1) взаимодействие сМВР-пептида формулы Z¹-[cMBP]-Z², где Z¹ представляет собой Н, и Z² представляет собой M^IG, с соединением формулы Y¹-(L) _n-[IM], с получением агента визуализации формулы I, где [IM] конъюгирован по положению Z¹;

(2) взаимодействие сМВР-пептида формулы Z¹-[cMBP]-Z ², где Z¹ и Z² оба представляют собой M^IG, и сМВР содержит остаток Asp или Glu в пределах 4 аминокислотных остатков с C- или N-конца сМВР-пептида, а все остальные остатки Asp/Glu сМВР-пептида защищены, с соединением формулы Y²-(L)_n-[IM], с получением агента визуализации формулы I, где [IM] конъюгирован по указанному остатку Asp или Glu данного сМВР-пептида;

(3) взаимодействие сМВР-пептида формулы Z¹-[cMBP]-Z³, где Z¹ представляет собой M^IG, и Z³ представляет собой группу Z² или активированный сложный эфир, а все остальные остатки Asp/Glu сМВР-пептида защищены, с соединением формулы Y²-(L)_n-[IM], с получением агента визуализации формулы I, где [IM] конъюгирован по положению Z²;

(4) взаимодействие сМВР-пептида формулы Z¹-[cMBP]-Z², где Z¹ и Z² оба представляют собой M^IG, и сМВР содержит Lys в пределах 4 аминокислотных остатков с C- или N-конца сМВР-пептида, с соединением формулы Y¹-(L)_n -[IM], с получением агента визуализации формулы I, где [IM] конъюгирован по остатку Lys данного сМВР-пептида;

где Z ¹, сМВР, Z², M^IG, L, n и IM являются такими, как определено в первом аспекте (выше), и

Z³ представляет собой группу Z² или активированный сложный эфир;

Y¹ представляет собой карбоновую кислоту, активированный сложный эфир, изотиоцианатную или тиоцианатную группу;

Y² представляет собой аминогруппу.

Термины "активированный сложный эфир" или "активный сложный эфир" и их предпочтительные воплощения являются такими, как описано выше. Y² предпочтительно представляет собой первичную или вторичную аминогруппу, наиболее предпочтительно первичную аминогруппу.

Соединение Z¹-[cMBP]-Z² предпочтительно имеет оба Z¹ и Z², представляющих собой M^IG. Предпочтительные сМВР-пептиды и группы Z ¹/Z² являются такими, как описано в первом аспекте. В частности, предпочтительно когда сМВР-пептид содержит остаток Asp, Glu или Lys для облегчения конъюгации, как описано для предпочтительных сМВР-пептидов по первому аспекту. Особенно предпочтительно, когда сМВР-пептид содержит остаток Lys, как описано на стадии (4).

Получение Z¹-[cMBP]-Z² описано в первом воплощении (выше). Пептид Z¹-[cMBP]-Z ³, где Z³ представляет собой активный сложный эфир, может быть получен из Z¹-[cMBP]-Z² , где Z² представляет собой ОН или биосовместимый катион (B^c), общепринятыми способами.

Оптические репортерные красители (IM), функционализированные подходящим образом для конъюгации с пептидами, доступны в продаже от GE Healthcare Limited, Atto-Tec, Dyomics, Molecular Probes и других. Большинство таких красителей доступно в виде NHS сложных эфиров.

Способы конъюгирования подходящих оптических репортеров (IM), в частности красителей, с аминокислотами и пептидами описаны Licha (см. выше), а также Flanagan et al. [Bioconj. Chem., 8, 751-756 (1997)]; Lin et al, [ibid, 13, 605-610 (2002)] и Zaheer [Mol. Imaging, 1(4), 354-364 (2002)]. В способах конъюгирования линкерной группы (L) с сМВР-пептидом используют химические технологии, аналогичные тем, в которых участвуют красители в отдельности (см. выше), и они известны в данной области техники.

В четвертом аспекте настоящего изобретения предложен набор для приготовления фармацевтической композиции по второму аспекту, содержащий агент визуализации по первому аспекту в стерильной твердой форме, так что после разбавления стерильной добавкой биосовместимого носителя по второму аспекту происходящее растворение дает желаемую фармацевтическую композицию.

В этом отношении агент визуализации и другие возможные эксципиенты, как описано выше, могут быть предложены в виде лиофилизированного порошка в подходящем флаконе или контейнере. В таком случае агент предназначен для разведения желаемым биосовместимым носителем с получением фармацевтической композиции в стерильной апирогенной форме, готовой для введения млекопитающему.

Предпочтительная стерильная твердая форма агента визуализации представляет собой лиофилизированное твердое вещество. Стерильная твердая форма предпочтительно предложена в контейнере фармацевтической категории, как описано для фармацевтической композиции (выше). Когда набор лиофилизирован, препарат возможно может содержать криопротектор, выбранный из сахарида, предпочтительно маннита, мальтозы или трицина.

В пятом аспекте настоящего изобретения предложен способ оптической визуализации организма млекопитающего in vivo, включающий использование агента визуализации по первому аспекту или фармацевтической композиции по второму аспекту с получением изображений сайтов сверхэкспрессии или локализации cMet in vivo.

Термин "оптическая визуализация" означает любой способ, в котором получают изображение, для детектирования, определения стадии заболевания или диагностики заболевания, отслеживания развития заболевания или для отслеживания лечения заболевания, на основе взаимодействия со светом в области спектра от красной до ближней инфракрасной (длина волны 600-1200 нм). Оптическая визуализация дополнительно включает все способы от прямой визуализации без использования какого-либо устройства, и включая использование устройств, таких как различные видеоизмерительные приборы, катетеры и оборудование для оптической визуализации, например автоматизированное оборудование для томографических изображений. Средства и способы измерений включают: люминесцентную визуализацию; эндоскопию; флуоресцентную эндоскопию; оптическую когерентную томографию; визуализацию по коэффициенту пропускания; регулируемую по времени визуализацию по коэффициенту пропускания; конфокальную визуализацию; нелинейную микроскопию; фотоакустическую визуализацию; акустооптическую визуализацию; спектроскопию; отражательную спектроскопию; интерферометрию; когерентную интерферометрию; диффузную оптическую томографию и опосредованную флуоресценцией диффузную оптическую томографию (системы, работающие в непрерывном режиме, временные и частотные системы), и измерение светорассеяния, поглощения, поляризации, люминесценции, времени жизни флуоресценции, квантового выхода и гашения флуоресценции, но не ограничены ими. Дополнительные подробности этих методик предложены в: (Tuan Vo-Dinh (редактор): "Biomedical Photonics Handbook" (2003), CRC Press LCC; Mycek & Pogue (редакторы): "Handbook of Biomedical Fluorescence" (2003), Marcel Dekker, Inc.; Splinter & Hopper: "An Introduction to Biomedical Optics" (2007), CRC Press LCC.

Область спектра от зеленой до ближней инфракрасной предпочтительно представлена длинами волн 600-1000 нм. Способ оптической визуализации предпочтительно представляет собой флуоресцентную эндоскопию. Организм млекопитающего по пятому аспекту предпочтительно представляет собой организм человека. Предпочтительные воплощения агента визуализации являются такими, как описано для первого аспекта (выше). В частности, предпочтительно, когда используют флуоресцентный краситель.

В способе по пятому аспекту агент визуализации или фармацевтическую композицию предпочтительно предварительно вводят в указанный организм млекопитающего. Термин "предварительно вводят" означает, что данная стадия, включающая участие лечащего врача, который дает агент визуализации пациенту, например, в виде внутривенной инъекции, уже была осуществлена до визуализации. Это воплощение включает использование агента визуализации по первому воплощению для производства диагностического агента для диагностической визуализации болезненных состояний организма млекопитающего in vivo, в которые вовлечен cMet.

Предпочтительный способ оптической визуализации по пятому аспекту представляет собой флуоресцентную отражательную визуализацию (Fluorescence Reflectance Imaging, FRI). При FRI агент визуализации по настоящему изобретению вводят субъекту, подлежащему диагностике, и затем поверхность ткани субъекта просвечивают возбуждающим светом, как правило, с возбуждением незатухающих волн (CW). Свет возбуждает репортерную молекулу (IM). Флуоресценцию от агента визуализации, которая генерируется возбуждающим светом, детектируют с использованием детектора флуоресценции. Отраженный свет предпочтительно фильтруют для отделения флуоресцентного компонента (исключительно или частично). На основе флуоресцентного свечения формируют изображение. Как правило, проводят минимальную обработку (не используя процессор для расчета оптических параметров, таких как время жизни, квантовый выход и другие), и данное изображение отображает интенсивность флуоресценции. Агент визуализации предназначен для концентрирования в пораженной области, вызывая более высокую интенсивность флуоресценции. Таким образом, болезненная область дает положительный контраст в картине интенсивности флуоресценции. Изображение предпочтительно получают с использованием ПЗС-камеры или чипа, так что возможна визуализация в режиме реального времени.

Длину волны возбуждения варьируют в зависимости от типа используемого красителя. Оборудование для генерирования возбуждающего света может представлять собой традиционный источник возбуждающего света, такой как: лазер (например ионный лазер, лазер на красителях или полупроводниковый лазер); источник галогенового света или источник ксенонового света. Различные оптические фильтры возможно могут быть использованы для получения оптимальной длины волны возбуждения.

Предпочтительный способ FRI включает следующие стадии:

(1) поверхность интересующей ткани в организме млекопитающего просвечивают возбуждающим светом;

(2) используя детектор флуоресценции, детектируют флуоресценцию от агента визуализации, генерируемую путем возбуждения визуализируемой группировки (IM);

(3) свет, детектируемый детектором флуоресценции, возможно фильтруют для отделения флуоресцентного компонента;

(4) из флуоресцентного свечения на стадиях (2) или (3) формируют изображение указанной поверхности интересующей ткани.

На стадии (1) возбуждающий свет предпочтительно представляет собой незатухающую волну (CW) по природе. На стадии (3) детектируемый свет предпочтительно фильтруют. Особенно предпочтительный способ FRI представляет собой флуоресцентную эндоскопию.

В альтернативном способе визуализации по пятому аспекту используют миграцию фотонов в частотной области (frequency-domain photon migration, FDPM). Это имеет преимущества перед способами, использующими незатухающую волну (CW), где важна более глубокая степень детектирования IM в ткани [Sevick-Muraca et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 6, 642-650 (2002)]. Для такой частотной/временной визуализации предпочтительно, если IM имеет флуоресцентные свойства, которые можно модулировать в зависимости от глубины поражения ткани, подлежащей визуализации, и типа используемого оборудования.

Способ FDPM осуществляют следующим образом:

(а) светорассеивающую биологическую ткань указанного организма млекопитающего, имеющую гетерогенный состав, подвергают воздействию света от источника света с заранее установленной варьируемой по времени интенсивностью для возбуждения агента визуализации, при котором наблюдают многократное рассеяние возбуждающего света в указанной ткани;

(б) детектируют многократно рассеянное световое излучение от ткани в ответ на указанное воздействие;

(в) проводят количественное определение параметра флуоресценции по всей ткани на основании этого излучения путем установления ряда показателей с использованием процессора, где каждый из показателей соответствует уровню параметра флуоресценции в различных положениях в пределах этой ткани и где данный уровень параметра флуоресценции варьирует согласно гетерогенному составу этой ткани; и

(г) генерируют изображение этой ткани путем построения изображения гетерогенного состава ткани в соответствии с показателями стадии (в).

Параметр флуоресценции стадии (в) предпочтительно соответствует захвату агента визуализации и предпочтительно дополнительно включает сопоставление ряда количественных показателей в соответствии с коэффициентами поглощения и рассеяния в данной ткани до введения агента визуализации. Параметр флуоресценции стадии (в) предпочтительно соответствует по меньшей мере одному из следующих: времени жизни флуоресценции, квантовому выходу флуоресценции, выходу флуоресценции и захвату агента визуализации. Параметр флуоресценции предпочтительно не зависит от интенсивности испускания и не зависит от концентрации агента визуализации.

Количественное определение на стадии (в) предпочтительно включает: (1) установление оценочного показателя, (2) определение рассчитанного испускания как функции данного оценочного показателя, (3) сравнение рассчитанного испускания с испусканием при указанном детектировании для определения ошибки, (4) предложение модифицированного оценочного показателя флуоресценции как функции ошибки. Количественное определение предпочтительно включает определение показателей на основе математической зависимости, моделирующей поведение многократного рассеяния света данной тканью. Способ по первому варианту предпочтительно включает мониторинг метаболического свойства ткани in vivo путем детектирования варьирования указанного параметра флуоресценции.

Оптическую визуализацию по пятому аспекту предпочтительно используют для облегчения тактики ведения больных колоректальным раком (CRC). Термин "тактика ведения больных CRC" означает использование в детектировании, определении стадии заболевания, диагностике, мониторинге прогрессирования заболевания или мониторинге лечения. Дополнительные подробности подходящих способов оптической визуализации рассмотрены Sevick-Muraca et al. [Curr. Opin. Chem. Biol., 6, 642-650 (2002)].

В шестом аспекте настоящего изобретения предложен способ детектирования, определения стадии заболевания, диагностики заболевания, мониторинга прогрессирования заболевания или мониторинга лечения колоректального рака (CRC) организма млекопитающего, включающий способ оптической визуализации in vivo по пятому аспекту.

Данное изобретение проиллюстрировано неограничивающими Примерами, подробно описанными ниже. В Примере 1 предложен синтез сМВР-пептида по изобретению (Соединение 1). В Примере 2 предложен синтез родственного пептида в качестве отрицательного контроля, в котором пептидная последовательность Соединения 1 подвергнута скремблированию. В Примере 3 предложен синтез цианинового красителя Су5**, предпочтительного красителя согласно изобретению. В Примере 4 предложен синтез активного сложного эфира Су5**. В Примере 5 предложена конъюгация цианиновых красителей по изобретению с пептидами (сМВР-пептидом и контролем). Соединения 3-7 сравнивали таким образом. В Примере 6 предложен способ определения аффинности пептидов в отношении cMet in vitro. Результаты показывают, что связывание является избирательным, даже когда присоединена оптическая репортерная визуализируемая группировка (цианиновый краситель). В Примере 7 предложены данные по тестированию in vivo Соединений 5 и 7 на животной модели рака. Показаны превосходные соотношения опухоль:фон для Соединения 5, в то время как для Соединения 7 (отрицательный контроль) не выявлено никаких отличий между опухолью и фоном.

Сокращения

Использованы общепринятые однобуквенные или 3-буквенные сокращения аминокислот.

Асm:	ацетамидометил
ACN (или MeCN):	ацетонитрил
Boc:	трет-бутилоксикарбонил
DCM:	дихлорметан
DMF:	диметилформамид
DMSO:	диметилсульфоксид
Fmoc:	9-флуоренилметоксикарбонил
HBTU:	гексафторфосфат O-бензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилурония
ВЭЖХ:	высокоэффективная жидкостная хроматография
HSPyU	гексафторфосфат O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметиленурония
NHS:	N-гидрокси-сукцинимид
NMM:	N-метилморфолин
NMP:	1-метил-2-пирролидинон
Pbf:	2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил
PBS:	забуференный фосфатом физиологический раствор
tBu:	трет-бутил
TFA:	трифторуксусная кислота
TIS:	триизопропилсилан
Trt:	тритил

Таблица 2
Структуры соединений по изобретению
No.	Структура соединений
1	AC-AGSCYCSGPPRFECWCYETEGTGGGK-NH2
2	AC-TGECTCPYWEFRPCECGSYSGAGGGK-NH 2 (отрицательный контроль)
3
	Ac-AGSCYCSGPPRFECWCYETEGTGGGK( -Cy5)-NH2
4
	(отрицательный контроль)

5
	Ac-AGSCYCSGPPRFECWCYETEGTGGGK( -Cy5**)-NH2
6	Ac-AGSCYCSGPPRFECWCYETEGTGGGK( -Alexa647)-NH2
7	Ac-TGECTCPYWEFRPCECGSYSGAGGGK( -Cy5**)-NH2 (отрицательный контроль)

Пример 1: Синтез Соединения 1

Стадия (а): синтез защищенного линейного пептида-предшественника

Линейный пептид-предшественник имеет структуру:

Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-GIy-Gly-Lys-NH ₂

Пептидил-смолу H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr( ^Me,Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-полимер синтезировали на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 433A с использованием Fmoc-химии, начиная с 0,1 ммоль смолы Rink Amide Novagel. На следующих стадиях сочетания наносили избыток 1 ммоль предварительно активированных аминокислот (используя HBTU). В эту последовательность встраивали Glu-Thr-псевдопролин (Novabiochem 05-20-1122). Смолу переносили в продуваемый азотом аппарат и обрабатывали раствором уксусного ангидрида (1 ммоль) и NMM (1 ммоль), растворенного в DCM (5 мл) в течение 60 минут. Раствор ангидрида удаляли путем фильтрования и смолу промывали DCM и сушили в потоке азота.

Одновременное удаление защитных групп боковой цепи и отщепление пептида от смолы осуществляли в TFA (10 мл), содержащей 2,5% TIS, 2,5% 4-тиокрезола и 2,5% воды в течение 2 часов 30 минут. Смолу удаляли путем фильтрования, TFA удаляли в вакууме и к остатку добавляли диэтиловый эфир. Образованный осадок промывали диэтиловым эфиром и сушили на воздухе с получением 264 мг неочищенного пептида.

Очистка посредством препаративной ВЭЖХ (градиент: 20-30% B в течение 40 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 10 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 5µ С18 (2) 250×21,20 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 30 мин) неочищенного пептида дала 100 мг чистого линейного предшественника Соединения 1. Чистый продукт анализировали посредством аналитической ВЭЖХ (градиент: 10-40% B в течение 10 мин, где А представляет собой H₂ O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 0,3 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 3µ С18 (2) 50×2 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 6,54 мин). Дополнительную характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением ( рассчитано: 1464,6, обнаружено: 1465,1).

Стадия (б): Образование моноциклического Cys4-16 дисульфидного мостика

Cys4-16; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH ₂

Линейный предшественник со стадии (а) (100 мг) растворяли в смеси 5% DMSO/вода (200 мл) и рН этого раствора доводили до значения рН 6, используя аммиак. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 суток. Затем рН этого раствора доводили до значения рН 2, используя TFA, и наибольшую часть растворителя удаляли путем выпаривания в вакууме. Остаток (40 мл) впрыскивали порциями в колонку для препаративной ВЭЖХ для очистки продукта.

Очистка посредством препаративной ВЭЖХ (градиент: 0% B в течение 10 мин, затем 0-40% B в течение 40 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 10 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250×21,20 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 44 мин) остатка дала 72 мг чистого моноциклического предшественника Соединения 1.

Чистый продукт (в виде смеси изомеров Р1-Р3) анализировали посредством аналитической ВЭЖХ (градиент: 10-40% B в течение 10 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой АСN/0,1% TFA, скорость потока: 0,3 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50×2 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 5,37 мин (Р1); 5,61 мин (Р2); 6,05 мин (Р3)). Дополнительную характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением ( рассчитано: 1463,6, обнаружено: 1464,1 (Р1); 1464,4 (Р2); 1464,3 (Р3)).

Стадия (в): Образование вторичного Cys6-14 дисульфидного мостика (Соединение 1)

Моноциклический предшественник со стадии (б) (72 мг) растворяли в смеси 75% АсОН/вода (72 мл) под защитным слоем азота. Добавляли 1 М HCl (7,2 мл) и 0,05 М I₂ в АсОН (4,8 мл) в указанном порядке и эту смесь перемешивали в течение 45 мин. Добавляли 1 М аскорбиновую кислоту (1 мл) с получением бесцветной смеси. Наибольшую часть растворителей выпаривали в вакууме и остаток (18 мл) разбавляли смесью вода/0,1% TFA (4 мл) и продукт очищали, используя препаративную ВЭЖХ.

Очистка посредством препаративной ВЭЖХ (градиент: 0% B в течение 10 мин, затем 20-30% B в течение 40 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 10 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250×21,20 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 43-53 мин) данного остатка дала 52 мг чистого Соединения 1.

Чистый продукт анализировали посредством аналитической ВЭЖХ (градиент: 10-40% B в течение 10 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 0,3 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50×2 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 6,54 мин). Дополнительное определение характеристик осуществляли с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением ( рассчитано: 1391,5, обнаружено: 1392,5).

Пример 2: Синтез Соединения 2

Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH ₂

Соединение 2 представляет собой отрицательный контроль, где пептидная последовательность Соединения 1 была подвергнута скремблированию.

Стадия (а): синтез защищенного линейного пептида-предшественника

Пептидил-смолу H-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Pro-Tyr(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Ser( ^Me,Mepro)-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-полимер синтезировали на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 433A с использованием Fmoc-химии, начиная с 0,1 ммоль смолы Rink Amide Novagel. На стадиях сочетания наносили избыток 1 ммоль предварительно активированных аминокислот (используя HBTU). В эту последовательность встраивали Tyr-Ser-псевдопролин (Novabiochem 05-20-1014). Смолу переносили в продуваемый азотом аппарат и обрабатывали раствором уксусного ангидрида (1 ммоль) и NMM (1 ммоль), растворенного в DCM (5 мл) в течение 60 минут. Раствор ангидрида удаляли путем фильтрования и смолу промывали DCM и сушили в потоке азота.

Одновременное удаление защитных групп боковой цепи и отщепление пептида от смолы осуществляли в TFA (10 мл), содержащей 2,5% TIS, 2,5% 4-тиокрезола и 2,5% воды в течение 2 часов 10 минут. Смолу удаляли путем фильтрования, TFA удаляли в вакууме и к остатку добавляли диэтиловый эфир. Образованный осадок промывали диэтиловым эфиром и сушили на воздухе с получением 216 мг неочищенного пептида.

Очистка посредством препаративной ВЭЖХ (градиент: 20-30% B в течение 40 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 50 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250×50 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 34,1 мин) неочищенного пептида дала чистый DX-1662 отрицательный контроль линейного предшественника, растворенного в 200 мл смеси ACN/вода. Чистый продукт анализировали посредством аналитической ВЭЖХ (градиент: 10-40% B в течение 5 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 0,6 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 20×2 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 3,52 мин). Дополнительную характеристику продукта осуществляли с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением ( рассчитано: 1464,6, обнаружено; 1464,9).

Стадия (б): Образование моноциклического Cvs4-16 дисульфидного мостика

Cys4-16; Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH ₂

К раствору отрицательного контроля линейного предшественника со стадии (а) (200 мл, см. 4.3.1) добавляли DMSO (10 мл) и рН этого раствора доводили до значения рН 7, используя аммиак. Реакционную смесь нагревали при 40°C в течение 18 часов, затем при 60°C в течение 60 мин. Значение рН этого раствора доводили до рН 2, используя TFA, и ACN удаляли путем выпаривания в вакууме. Этот остаток подвергали очистке препаративной ВЭЖХ.

Очистка посредством препаративной ВЭЖХ (градиент: 0% B в течение 5 мин, затем 20-30% B в течение 60 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой АСМ/0,1% TFA, скорость потока: 50 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250×50 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 29,6 мин) остатка дала чистый отрицательный контроль моноциклического предшественника в 100 мл смеси ACN/вода. Чистый продукт анализировали посредством аналитической ВЭЖХ (градиент: 10-40% B в течение 5 мин, где А представляет собой H₂ O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 0,6 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 20×2 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 3,46 мин). Дополнительное определение характеристик осуществляли с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением ( рассчитано: 1463,6, обнаружено: 1463,7).

Стадия (в): Образование вторичного Cys6-14 дисульфидного мостика (Соединение 2)

Cys4-16, 6-14; Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH ₂

Раствор отрицательного контроля моноциклического предшественника со стадии (б) (100 мл) разбавляли АсОН (100 мл). Добавляли 1 М HCl (5 мл) и 0,05 М I₂ в АсОН (7 мл) в указанном порядке под защитным слоем аргона и эту смесь перемешивали в течение 20 мин. Добавляли 1 М аскорбиновую кислоту (1 мл) с получением бесцветной смеси. Наибольшую часть растворителей выпаривали в вакууме и остаток (30 мл) разбавляли смесью вода/0,1% TFA (100 мл) и продукт очищали, используя препаративную ВЭЖХ.

Очистка посредством препаративной ВЭЖХ (градиент: 0% B в течение 10 мин, затем 20-30% B в течение 60 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 50 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 250×50 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 32,8 мин) данного остатка дала 30 мг чистого Соединения 2. Чистый продукт анализировали посредством аналитической ВЭЖХ (градиент: 10-40% B в течение 10 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% TFA, и В представляет собой ACN/0,1% TFA, скорость потока: 0,3 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 3µ C18 (2) 50×2 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 6,54 мин). Дополнительное определение характеристик осуществляли с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением ( рассчитано: 1391,5, обнаружено: 1392,5).

Пример 3: Синтез цианинового красителя 2-{(1Е,3Е,5Е)-5-[1-(5-карбоксипентил)-3,3-диметил-5-сульфо-1,3-дигидро-2H-индол-2-илиден]-пента-1,3-диенил}-3-метил-1,3-бис(4-сульфобутил)-3H-индолий-5-сульфоната (Cy5**)

(3а) 5-Метил-6-оксопентан-1-сульсЬоновая кислота

К суспензии гидрида натрия (12,0 г, 60% NaH в минеральном масле) в DMF (100 мл) добавляли по каплям этил-2-метилацетоацетат (50 г) в DMF (25 мл) при охлаждении на ледяной бане в течение 1 часа (внутренняя температура 0-4°C). Эту смесь оставляли нагреваться до температуры окружающей среды в течение 45 мин при перемешивании, а затем снова охлаждали. Затем добавляли по каплям в течение 15 минут раствор 1,4-бутансультона (45 г) в DMF (25 мл). Конечную смесь нагревали при 60°C в течение 18 часов. Растворитель удаляли роторным испарением и остаток распределяли между водой и диэтиловым эфиром. Водный слой собирали, промывали свежей порцией диэтилового эфира и подвергали роторному испарению с получением клейкой пены. Это промежуточное вещество растворяли в воде (100 мл) и добавляли гидроксид натрия (17,8 г) в течение 15 минут при перемешивании. Эту смесь нагревали при 90°C в течение 18 часов. Значение рН охлажденной реакционной смеси доводили до ~рН 2 добавлением концентрированной соляной кислоты (~40 мл). Раствор подвергали упариванию на роторном испарителе и сушили в вакууме. Желтое твердое вещество промывали этанолом, содержащим 2% соляной кислоты (3×150 мл). Этанольный раствор фильтровали, упаривали на роторном испарителе и сушили в вакууме с получением желтого твердого вещества. Выход 70 г.

(3б) Дикалиевая соль 2,3-диметил-3-(4-сульфобутил)-3Н-индол-5-сульфоновой кислоты

4-Гидразинобензолсульфоновую кислоту (40 г), 5-метил-6-оксогептан-1-сульфоновую кислоту (из 3а; 60 г) и уксусную кислоту (500 мл) смешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 6 часов. Растворитель отфильтровывали, выпаривали на роторном испарителе и сушили в вакууме. Твердое вещество растворяли в метаноле (1 л). К нему добавляли 2 М метанольный гидроксид калия (300 мл). Эту смесь перемешивали в течение 3 часов и затем объем растворителя сокращали на 50%, используя роторное испарение. Полученный осадок отфильтровывали, промывали метанолом и сушили в вакууме. Выход 60 г. MS (LCMS): MH⁺ 362. Асс. Mass: Обнаружено 362,0729. МН⁺=C₁₄ H₂₀NO₆S₂ требует m/z 362,0732 (-0,8 млн^-1).

(3в) Дикалиевая соль 2,3-диметил-1,3-бис(4-сульфобутил)-3Н-индолий-5-сульфоната

2,3-Диметил-3-(4-сульфобутил)-3Н-индол-5-сульфоновую кислоту (из 3б; 60 г) нагревали с 1,4-бутансультоном (180 г) и тетраметиленсульфоном (146 мл) при 140°C в течение 16 часов. Полученное красное твердое вещество промывали диэтиловым эфиром, растирали в порошок и сушили в вакууме. Выход 60 г.

(3г) Су5** в виде TFA соли

K ⁺-соль 1-(5'-карбоксипентил)-2,3,3-триметил-индолийбромид-5-сульфоновой кислоты (2,7 г), моногидрохлорид бис(фенилимин)малонового альдегида (960 мг), уксусный ангидрид (36 мл) и уксусную кислоту (18 мл) нагревали при 120°C в течение 1 часа с получением темно-коричнево-красного раствора. Эту реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды. К этой смеси добавляли 2,3-диметил-1,3-бис(4-сульфобутил)-3Н-индолий-5-сульфонат (из 3в; 8,1 г) и ацетат калия (4,5 г) и перемешивали в течение 18 часов при температуре окружающей среды. Полученный синий раствор осаждали с использованием этилацетата и сушили в вакууме. Неочищенный краситель очищали посредством жидкостной хроматографии (RPC _18. градиент вода + 0,1% TFA/MeCN + 0,1% TFA). Фракции, содержащие основной пик красителя, собирали, объединяли и упаривали в вакууме с получением указанного в заголовке красителя, 2 г. УФ/Vis (вода + 0,1% ТFА): 650 нм. MS (Времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы (MALDI-TOF)): MH+ 887,1. MH⁺=C₃₈H₅₀N₂ O₁₄S₄ требует m/z 887,1.

Пример 4: Синтез диизопропилэтиламинной соли 2-[(1Е,3Е,5Е)-5-(1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-3,3-диметил-5-сульфо-1,3-дигидро-2H-индол-2-илиден)пента-1,3-диенил]-3-метил-1,3-бис(4-сульфобутил)-3H-индолий-5-сульфоната (NHS сложный эфир Су5**)

Су5** (Пример 3; 10 мг) растворяли в безводном DMSO (3 мл); к нему добавляли HSPyU (20 мг) и N,N'-диизопропилэтиламин (80 мкл). Полученный раствор перемешивали в течение 3 часов, по окончании которых TLC (RPC18 вода/МеСN) выявила завершение реакции. Краситель выделяли путем осаждения в этилацетате/диэтиловом эфире, отфильтровывали, промывали этилацетатом и сушили в вакууме. УФ/Vis (вода) 650 нм. MS (MALDI-TOF) MH+ 983,5. MH⁺ =C₄₂H₅₃N₃O₁₆S ₄ требует m/z 984,16.

Пример 5: Конъюгация красителей, синтез Соединений 3-7

Cys4-16, 6-14; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(Cy5)-NH ₂ (Соединение 3)

Соединение 1 (10 мг), NMM (4 мкл) и NHS сложный эфир Су5 (5,7 мг; GE Healthcare PA15104) растворяли в NMP (1 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 7 часов. Затем эту реакционную смесь разбавляли смесью 5% ACN/вода (8 мл) и продукт очищали, используя препаративную ВЭЖХ.

Очистка посредством препаративной ВЭЖХ (градиент: 5-50% B в течение 40 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% HCOOH, и В представляет собой ACN/0,1% HCOOH, скорость потока: 10 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 5µ С18 (2) 250×21,20 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 35,5 мин) неочищенного пептида дала 8,1 мг чистого Соединения 3. Чистый продукт анализировали посредством аналитической ВЭЖХ (градиент: 5-50% B в течение 10 мин, где А представляет собой H₂O/0,1% HCOOH, и В представляет собой ACN/0,1% HCOOH, скорость потока: 0,3 мл/мин, колонка: Phenomenex Luna 3µ С18 (2) 50×2 мм, детектирование: УФ 214 нм, время удерживания продукта: 8,15 мин). Дополнительное определение характеристик осуществляли с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением ( рассчитано: 1710,6, обнаружено: 1711,0).

Соединение 4 получали аналогичным образом; масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением ( рассчитано: 1710,6, обнаружено: 1710,9).

Другие конъюгаты краситель-пептид (Соединения 5-7) получали аналогичными способами. Alexa647 был предоставлен Molecular Probes (А20106):

Соединение 5 ( рассчитано: 1825,7, обнаружено: 1825,9),

Соединение 6 ( рассчитано: 1811,7, обнаружено: 1812,0),

Соединение 7 ( рассчитано: 1825,7, обнаружено: 1826,2).

Пример 6: анализ поляризации флуоресценции in vitro

Принцип метода поляризации флуоресценции может быть вкратце описан следующим образом:

Монохроматический свет проходит через горизонтальный поляризующий фильтр и возбуждает флуоресцентные молекулы в образце. Только те молекулы, которые правильно ориентированы в вертикально поляризованной плоскости светопоглощения, возбуждаются и затем испускают излучение. Испускаемое излучение измеряют как в горизонтальной, так и в вертикальной плоскостях. Показатель анизотропии (А) представляет собой соотношение между интенсивностями света согласно следующему уравнению:

Измерения анизотропии флуоресценции осуществляли в 384-луночных микропланшетах в объеме 10 мкл в буфере для связывания (забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), 0,01% Tween-20, pH 7,5) с использованием планшет-ридера поляризации флуоресценции Tecan Safire (Tecan, США) при возб.646/испуск.678 нм. Концентрацию меченого красителем пептида сохраняли постоянной (20 нМ) и концентрации человеческих или мышиных c-Met/Fc химер (R&D Systems) или Semaphorin 6A (R&D Systems) варьировали в диапазоне 0-150 нМ. Смеси для связывания уравновешивали в микропланшете в течение 10 минут при 30°C. Наблюдаемое изменение в анизотропии подгоняли под уравнение:

где r_obs представляет собой наблюдаемую анизотропию, r_free представляет собой анизотропию свободного пептида, r_bound представляет собой анизотропию связанного пептида, K_D представляет собой константу диссоциации, cMet представляет собой общую концентрацию c-Met, и Р представляет собой общую концентрацию меченого красителем пептида. Это уравнение допускает, что синтетический пептид и рецептор образуют обратимый комплекс в растворе в стехиометрическом соотношении 1:1. Аппроксимацию данных проводили через нелинейную регрессию используя программное обеспечение GraphPad Prism, с получением значения K_D (связывание по одному сайту).

Соединения 3 и 4 были протестированы в отношении связывания человеческого и мышиного c-Met (Fc химера). Результаты показали, что К_D составляет 3+/-1 нМ в отношении связывания Соединения 3 с человеческим с-Met. Никакого связывания не наблюдалось для Соединения 4 с человеческим с-Met. Кроме того, Соединения 3 и 4 не показали никакого связывания с мышиным c-Met в тестированном диапазоне.

С использованием этого же метода было обнаружено, что Соединение 5 имеет K_D 1,1 нМ в отношении человеческого cMet.

Пример 7: тестирование Соединений 5 и 7 in vivo

(а) Животная модель

В данном исследовании использовали бестимусных мышей 54 Female BALB с/А с мутацией по гену nude (Bom). Использование этих животных одобрено местным комитетом по соблюдению этических норм исследования. BALB с/А nude представляет собой инбредную мышиную линию с нарушенной иммунологической реактивностью, имеющую высокую степень развития человеческих опухолей по сравнению с другими мышиными линиями nude. Мыши были 4-недельного возраста после прибытия и имели массу тела приблизительно 20 грамм в начале исследования. Животных содержали в индивидуальных проветриваемых клетках (IVC, Scanbur BK) с фильтруемым через высокоэффективный воздушный фильтр (НЕРА) воздухом. Животные имели неограниченный доступ к корму "Rat и Mouse nr. 3 Breeding" (Scanbur BK) и водопроводной воде, подкисляемой добавлением HCl до молярной концентрации 1 мМ (рН 3,0).

Клетки колоректального рака НСТ-15 имеют происхождение из человеческих карцином толстого кишечника и экспрессируют c-Met, как сообщалось согласно Zeng et al. [Clin. Exp. Metastasis, 21, 409-417. (2004)]. Доказано, что эта клеточная линия является онкогенной при подкожной инокуляции мышам nude [Flatmark et al., Eur. J. Cancer 40, 1593-1598 (2004)].

Клетки НСТ-15 выращивали и готовили для подкожной инокуляции в среде RPMI (Sigma, номер по каталогу # R0883) с 10% сывороткой и пенициллином/стрептомицином. Штаммы подвергали четырем пассажам и пассаж номер четыре (Р4) замораживали для хранения в жидком азоте при концентрации 3×10 ⁷ клеток/флакон в культуральной среде, содержащей 5% диметилсульфоксид (DMSO). В день трансплантации клетки подвергали быстрому оттаиванию в водяной бане на 37°C (приблизительно 2 мин), промывали и ресуспендировали в PBS/2% сыворотке (центрифугирование при 1200 об/мин в течение 10 мин). Тщательное перемешивание клеток во флаконах обеспечивали каждый раз при их аспирации в дозирующий шприц. Клеточные суспензии объемом 0,1 мл инъецировали подкожно (s.c.) в лопаточную область и область спины, используя иглу с отверстием небольшого размера (25 G), в то время как животные находились под действием анестезии легким газом. Затем животных возвращали в свои клетки и оставляли для роста опухолей на 13-17 суток. Животным давали период акклиматизации по меньшей мере 5 суток перед процедурой инокуляции.

(б) Процедура

Все тестируемые вещества разбавляли PBS из лиофильно высушенного порошка. Небольшую стопку белой бумаги для принтера подвергали визуализации с получением плоскостного изображения, которое использовали для коррекции неоднородностей просвечивания. Тестируемые вещества инъецировали внутривенно в латеральную часть хвостовой вены при физической фиксации. Инъецируемый объем составлял 0,1 мл, что соответствует дозе 1 нмоль тестируемого вещества на животное. После инъекции животных возвращали в свои клетки. Животных умерщвляли непосредственно перед визуализацией путем смещения шейных позвонков. Для каждого тестируемого вещества отмечали момент времени оптимальной визуализации, основываясь на сравнении скоростей вымывания в коже и в мышечной ткани у ограниченного количества животных (n равен 1-6). Момент времени визуализации для Соединений 3 и 4 составил 120 минут после инъекции. Для каждого животного производили подкожные паталогоанатомические срезы выросших опухолей. Тонкую пластинку толщиной приблизительно 1,6 мм и 3-4 мм в диаметре отделяли с края одной из опухолей. Этот срез опухоли затем подвергали визуализации против участка нормальной толстой кишки из того же самого животного.

(в) Визуализация

Визуализацию осуществляли через клинический лапароскоп, адаптированный для использования источника света для возбуждения репортера и фильтрующей системы для извлечения флуоресцентного компонента. Лазер 635 нм использовали для возбуждения репортерной молекулы. Камеру Hamamatsu или СА ERG CCD использовали в качестве детектора. Эта камера использует функцию Binning Mode 2×2 с нулевым усилением. Стандартное время воздействия для визуализации толстой кишки составляло 10 сек. Калибровочные измерения системы показывают, что это 10-секундное время воздействия с использованием данной системы визуализации животного соответствует 40-миллисекундному воздействию с использованием клинически релевантных источника света, поля зрения и расстояния до поверхности ткани. Распределение интенсивности в изображении корректировали в отношении неоднородностей излучения через систему калибровки данных. Соотношение мишень:фон рассчитывали из интересующих участков, помещенных поверх опухоли, и нормальной фоновой толстой кишки. Изображения оценивали визуально, используя стандартную систему оценки, применяемую получателем, выполняющим характеристический анализ.

(г) Результаты

Соединение 5 показало соотношение опухоль:нормальная ткань 1,46:1, а соответствующий скремблированный контрольный пептид с тем же самым красителем (Соединение 7) показал соотношение 1,04:1. С Соединением 5 имели легко идентифицируемую опухоль, в то время как ничего невозможно было различить против фона при использовании Соединения 7.