вакцина mycobacterium tuberculosis

Формула изобретения

1. Применение по меньшей мере одной живой микобактерии из комплекса M.tuberculosis, у которой функция гена zmp1 по меньшей мере частично инактивирована, предпочтительно инактивирована, для получения лекарства для профилактики или лечения болезней или заболеваний, затрагиваемых экспрессией антигенов и/или иммуногенов у микобактерии.

2. Применение по п.1, в котором микобактерия представляет собой M.bovis, предпочтительно M.bovis BCG, либо M.tuberculosis.

3. Применение по п.1, в котором микобактерия не является вирулентной.

4. Применение по п.1, в котором микобактерия содержит генетический материал, кодирующий антиген и/или иммуноген, экзогенный или чужеродный для микобактерии.

5. Применение по п.4, в котором антиген и/или иммуноген выбирается из группы, состоящей из антигенов и иммуногенов вирусов, простейших, раковых клеток, бактерий и грибов, предпочтительно из группы, состоящей из антигенов и/или иммуногенов, происходящих из H.pylori, вируса краснухи, вируса свинки, вируса кори, B.burgdorferi, вируса герпеса, вируса папилломы, Pneumococcus spp, раковых клеток, лейшмании, HIV и SIV.

6. Применение по любому из пп.1-5 для профилактики и/или лечения болезней или заболеваний, затрагиваемых экспрессией антигенов и/или иммуногенов у микобактерии.

7. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активной субстанции по меньшей мере одну живую микобактерию из комплекса M.tuberculosis, у которой функция гена zmp1 по меньшей мере частично инактивирована, предпочтительно инактивирована, для профилактики или лечения болезней или заболеваний, затрагиваемых экспрессией антигенов и/или иммуногенов у микобактерии, необязательно в сочетании с фармацевтически приемлемыми эксципиентами и/или носителями.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, в которой микобактерия представляет собой M.bovis, предпочтительно M.bovis BCG, либо M.tuberculosis.

9. Фармацевтическая композиция по п.7, в которой микобактерия не является вирулентной.

10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.7-9, в которой микобактерия содержит генетический материал, кодирующий антиген и/или иммуноген, экзогенный или чужеродный для микобактерии.

11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.7-9, в которой антиген и/или иммуноген выбирается из группы, состоящей из антигенов и иммуногенов вирусов, простейших, раковых клеток, бактерий и грибов, предпочтительно из группы, состоящей из антигенов и/или иммуногенов, происходящих из H.pylori, вируса краснухи, вируса свинки, вируса кори, B.burgdorferi, вируса герпеса, вируса папилломы, столбнячного токсина, дифтерийного токсина, Pneumococcus spp, раковых клеток, лейшмании, HIV и SIV.

12. Способ лечения или профилактики заболеваний, затрагиваемых экспрессией антигенов и/или иммуногенов у микобактерии, включающий стадию введения фармацевтической композиции по любому из пп.7-11 нуждающемся в этом пациенту-млекопитающему, предпочтительно пациенту-человеку.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение касается применения живой микобактерии из комплекса М.tuberculosis, в которой инактивирована функция гена zmp1, для изготовления лекарства, фармацевтических композиций, приготовленных из таких микобактерий, а также способа лечения и/или профилактики заболевания или медицинского состояния с применением указанной фармацевтической композиции.

Уровень техники

Mycobacterium tuberculosis является одним из наиболее успешных патогенов, известных на сегодняшний день, который каждый год убивает миллионы человек по всему миру. Характерной чертой инфекции М.tuberculosis является то, что после фагоцитоза микроорганизмы препятствуют своей доставке в лизосомы, оставаясь вместо этого внутри фагосом, которые не сливаются с лизосомами. Фаголизосомы обладают специальной системой для образования комплексов пептид-МНС II (главный комплекс гистосовместимости). Предполагается, что ингибирование слияния фаголизосом и представляет собой тот механизм, с помощью которого М.tuberculosis избегает эффективной презентации антигена комплексами МНС II хозяина. Кроме того, перекрестная презентация пептидов, принадлежащих конкретным антигенам и использующих обычный путь МНС I, может осуществляться посредством предполагаемого механизма фагосома-цитозоль. Альтернативно этому, это может осуществляться путем слияния и разделения на части фагосом везикулами, происходящими из эндоплазматического ретикулума и содержащими заново синтезированные молекулы МНС I.

Противотуберкулезная вакцина BCG (БЦЖ) представляет собой живую ослабленную вакцину, полученную из М.bovis еще в 1919 году. По всему миру было введено более трех миллиардов доз этой вакцины. Хотя БЦЖ является относительно безопасной и недорогой вакциной, ее эффективность является очень вариабельной (Fine, Р.Е. М., Lancet 346, 1339-1345, 1995). Причины вариабельной эффективности БЦЖ в защите против туберкулеза плохо понятны. Одно из объяснений базируется на наблюдении, что БЦЖ теряет важные гены в процессе получения ослабленной вакцины в лаборатории (Behr et al., Nature 389, 133-134, 1997). Была проделана огромная работа - с переменным успехом - для улучшения эффективности БЦЖ путем введения добавочных копий существующих генов (Horwitz et al., PNAS, USA 97, 13853-13858, 2000) или путем повторного введения некоторых из генов, которые были потеряны во время процесса ослабления вакцины in vitro (Pym et al., Nat. Med. 9, 533-539, 2003). Альтернативные стратегии вакцинации живой вакциной сфокусированы на ослабленной М.tuberculosis. Обычно предполагается, что заболевание туберкулезом будет защищать, по меньшей мере, частично, против последующих повторных инфекций. Однако неспособность естественного заболевания обеспечить защиту против повторного заболевания, в конечном счете, указывает на то, что вызванный природной инфекцией иммунитет является ограниченным, что отчасти объясняет относительную неэффективность вакцинации с применением БЦЖ. Ограниченный постинфекционный иммунитет может также указывать на то, что М.tuberculosis активно избегает контроля со стороны иммунной системы.

Недавно авторы настоящего изобретения сообщили о том, что предполагаемая цинковая металлопротеаза микобактерий zmp1 может играть важную роль в патогенезе заболевания за счет нарушения двух путей защиты от патогена: активации инфламмасом и созревания фагосом (Master et al., Mycobacterium tuberculosis prevents inflammasome activation. Cell Host Microbe 3, 224-232, 2008).

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление лекарства на основе живой микобактерии с улучшенной иммуногенностью и улучшенной эффективностью защиты.

Эта цель достигается путем применения для изготовления лекарства, по меньшей мере, одной живой микобактерии из комплекса М.tuberculosis, в которой функция гена zmp1 является, по меньшей мере, частично инактивированной, предпочтительно инактивированной.

Было обнаружено, что живые микобактерии, у которых функция гена zmp1 является, по меньшей мере, частично инактивированной, предпочтительно в значительной степени или полностью инактивированной, обеспечивают повышенную иммуногенность и защитную эффективность по сравнению с микобактериями с активным геном zmp1.

Термин «живая микобактерия из комплекса М.tuberculosis» в используемом здесь значении обозначает вид или штамм микобактерии, который является членом комплекса М.tuberculosis, который включает, но ими не ограничивается, М.tuberculosis, М.bovis BCG, М.bovis, М.africanum и М.microti.

Предпочтительно для изготовления лекарства согласно настоящему изобретению применяется микобактерия М.bovis, предпочтительно М.bovis BCG, или М.tuberculosis.

Микобактерия, применяемая в настоящем изобретении, является живой, то есть способной к размножению в хозяине, в частности в хозяине-млекопитающем, предпочтительно в хозяине-человеке.

Очевидно, что живые микобактерии для медицинского применения должны быть ослаблены до такой степени, чтобы они не были опасны для пациентов, которые в них нуждаются. Следовательно, микобактерия, применяемая в настоящем изобретении, является предпочтительно не вирулентной, то есть гены, отвечающие за вирулентность, должны быть инактивированы и не должны вызывать или, по меньшей мере, вызывать минимальные симптомы заболевания микобактериальной инфекцией у млекопитающего, предпочтительно у человека.

Микобактерии из комплекса М.tuberculosis продуцируют эндогенные антигены, которые являются перекрестно-реактивными с М.tuberculosis. Антитела, выработанные против такого перекрестно-реактивного антигена, будут также специфически связываться с одним или более антигенами из М.tuberculosis и являются способными вызывать и/или усиливать иммунный ответ против инфекции М.tuberculosis у млекопитающего. Например, перекрестно-реактивные антигены М.bovis BCG будут вызывать и/или усиливать иммунный ответ против инфекции М.tuberculosis.

Микобактерии из комплекса М.tuberculosis являются не только пригодными для экспрессии перекрестно-реактивных антигенов, но также могут применяться в качестве системы доставки для экспрессии экзогенных или чужеродных антигенов и/или иммуногенов. Эффективность этой системы доставки связана с длительной устойчивостью в иммунизированном хозяине (Stover et al., Nature, 351, 456-460, 1991; Aldovini and Young, Nature, 351, 479-482, 1991).

Примеры пригодных антигенов для доставки с помощью микобактерий из комплекса М.tuberculosis включают вирусные антигены, антигены простейших, антигены, происходящие из опухолевых клеток, бактерий и грибов. Например, могут использоваться антигены, происходящие из Н.pylori, вируса краснухи, вируса свинки, вируса кори, В.burgdorferi (например, OspA), вируса герпеса, вируса папилломы, Pneumococcus spp (например, поверхностный белок А), опухолевых клеток, лейшмании (например, поверхностная протеиназа gp63), HIV (ВИЧ) или SIV (вирус иммунодефицита обезьян). Такой антиген может быть пригодным для лечения язв, краснухи, свинки, кори, болезни Лайма, герпеса, рака, столбняка, дифтерии, лейшманиоза или СПИДа.

В предпочтительном воплощении микобактерии для применения в настоящем изобретении могут также включать генетический материал, кодирующий антиген и/или иммуноген, экзогенный или чужеродный для данной микобактерии. Более предпочтительно, экзогенный или чужеродный антиген и/или иммуноген выбирается из группы, состоящей из антигенов и иммуногенов вирусов, простейших, происходящих из опухолевых клеток, бактерий и грибов, предпочтительно выбирается из группы, состоящей из антигенов и/или иммуногенов из H.pylori, вируса краснухи, вируса свинки, вируса кори, В.burgdorferi, предпочтительно белка ospA из В.burgdorferi, вируса герпеса, вируса папилломы, Pneumococcus spp, предпочтительно белка А из Pneumococcus spp., опухолевых клеток, лейшмании, предпочтительно поверхностной протеиназы gp63 из лейшмании, HIV и SIV.

Таким образом, микобактерия для применения в изготовлении лекарства согласно настоящему изобретению является пригодной для профилактики и/или лечения заболеваний или состояний здоровья, связанных с экспрессией антигена и/или иммуногена данной микобактерии. Антиген стимулирует выработку антител у хозяина, иммуноген оказывает влияние на иммунную систему хозяина.

Наиболее очевидным, а также наиболее предпочтительным является то, что лекарства, изготовленные из микобактерии с инактивированным геном zmp1 согласно настоящему изобретению, являются пригодными для профилактики и/или лечения микобактериальных инфекций, предпочтительно инфекции М.tuberculosis.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение направлено на применение согласно настоящему изобретению для профилактики и/или лечения заболевания или медицинского состояния, выбираемого из группы, состоящей из язв, краснухи, свинки, кори, болезни Лайма, герпеса, рака, столбняка, дифтерии, лейшманиоза и СПИДа.

В изготовлении лекарства согласно настоящему изобретению могут применяться один или более видов и/или штаммов живых микобактерий с, по меньшей мере, частично инактивированной функцией гена zmp1.

Термин «функция гена zmp1» в используемом здесь значении предназначен для обозначения функции предполагаемой цинковой металлоротеазы zmp1 микобактерий в активации инфламмасом, в каспаза-1-зависимой активации и секреции IL-1 , а также в созревании фагосом в макрофагах млекопитающего, в частности человека.

Таким образом, функция гена zmp1 у микобактерии может быть прямо проверена и/или количественно измерена с помощью исследования активации инфламмасом, каспаза-1-зависимой активации, и/или секреции IL-1 , и/или созревания фагосом в макрофагах млекопитающего, в частности человека, в условиях инфекции исследуемой микобактерии. Конечно, другие прямые и непрямые эффекты белка zmp1, например эффекты, являющиеся следствием активации и/или секреции IL-1 , также являются показателями функции гена zmp1 и могут также применяться вместо или в дополнение к указанным выше прямым показателям.

Термин «по меньшей мере, частично инактивированный» в используемом здесь значении предназначен для обозначения потери функции гена zmp1, прямо и/или не прямо связанной с экспрессией гена zmp1. Конечно, инактивация и степень инактивации может лучше всего быть определена путем прямого сравнения с микобактерией того же самого штамма в идентичных экспериментальных условиях, но имеющей полностью функциональный и экспрессируемый ген zmp1. Предпочтительно, термин «по меньшей мере, частично инактивированный» относится к потере больше чем 10%, предпочтительно больше чем 50%, более предпочтительно больше чем 70%, наиболее предпочтительно больше чем 90% функции, прямо и/или не прямо связанной с экспрессией гена zmp1 в микобактерии.

Частичная и/или полная инактивация генов в микобактериях из комплекса М.tuberculosis для применения в настоящем изобретении может быть достигнута любым стандартным методом для генных мутаций, применяемым в данной области техники, например, рекомбинантной вставкой, заменой, делецией, сдвигом рамки считывания и/или гомологичной рекомбинацией. Пригодные специфические методы для частичной и/или полной инактивации генов, в частности гена zmp1 в микобактериях, описаны в патенте WO 02/50262 (rеcA мутанты). Master et al., supra, и в приведенных ниже примерах.

Было установлено, что порог для индукции иммунного ответа на антигены М.tuberculosis у иммунизированных млекопитающих был в десять раз ниже для млекопитающих, иммунизированных zmp1-дефицитными штаммами микобактерий, по сравнению с порогом, необходимым для индукции иммунного ответа у млекопитающих, иммунизированных соответствующим штаммом микобактерии дикого типа, то есть zmp1-активным штаммом. Вследствие этого, лекарства, приготовленные из микобактерий согласно настоящему изобретению, обеспечивают значительно более высокую иммуногенность, связанную с повышенным пролиферативным и цитокин-секретирующим иммунными ответами.

Более того, было показано, что эффективность защиты у млекопитающих, иммунизированных данным лекарством, то есть фармацевтической композицией/вакциной, приготовленной согласно настоящему изобретению, против заражения М.tuberculosis была значительно выше по сравнению с эффективностью защиты, достигаемой у млекопитающих, иммунизированных соответствующим штаммом микобактерии дикого типа. Например, сравнение показало, что млекопитающие, иммунизированные согласно настоящему изобретению, демонстрировали при заражении М.tuberculosis более выраженную и более частую инфильтрацию лимфоцитов в легкие.

И последнее, но не менее важное, то, что повышенная иммуногенность и эффективность защиты лекарств, приготовленных согласно настоящему изобретению, проявляется в том, что при заражении вирулентной М.tuberculosis иммунизированные млекопитающие демонстрируют значительно более длительное среднее время выживания.

Вследствие этого, лекарства, приготовленные согласно настоящему изобретению, обеспечивают значительный прогресс в плане терапевтического, профилактического и других медицинских или ветеринарных применений микобактерий для доставки эндогенных, экзогенных и/или чужеродных антигенов и/или иммуногенов млекопитающему, которое в этом нуждается.

Второй аспект настоящего изобретения касается фармацевтических композиций, включающих в качестве активной субстанции, по меньшей мере, одну живую микобактерию из комплекса М.tuberculosis, у которой функция гена zmp1 является, по меньшей мере, частично инактивированной, предпочтительно инактивированной, не обязательно и предпочтительно в комбинации с фармацевтически приемлемыми стандартными наполнителями и/или носителями.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению представляет собой любую композицию, предпочтительно вакцину, предназначенную для прямого медицинского введения пациенту, который в этом нуждается, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку.

Предпочтительно, микобактерия в фармацевтической композиции представляет собой М.bovis, предпочтительно М.bovis BCG, или М.tuberculosis. Также предпочтительно, чтобы применяемая микобактерия была не вирулентной.

В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению представляет собой такую композицию, в которой микобактерия включает генетический материал, кодирующий антиген и/или иммуноген, экзогенный или чужеродный для микобактерий, где антиген и/или иммуноген предпочтительно выбираются из группы, состоящей из антигенов и иммуногенов, происходящих из раковых клеток, бактерий и грибов, более предпочтительно выбирается из группы, состоящей из антигенов и/или иммуногенов, происходящих из Н.pylori, вируса краснухи, вируса свинки, вируса кори, В.burgdorferi, предпочтительно белка ospA из В.burgdorferi, вируса герпеса, вируса папилломы, Pneumococcus spp, предпочтительно белка А из Pneumococcus spp., опухолевых клеток, лейшмании, предпочтительно поверхностной протеиназы gp63 из лейшмании, HIV и SIV.

Предпочтительно, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению представляет собой композицию, пригодную для профилактики и/или лечения заболевания или медицинского состояния, вызываемых экспрессией антигена и/или иммуногена микобактерии, более предпочтительно для профилактики и/или лечения микобактериальных инфекций, предпочтительно инфекции М.tuberculosis, a также более предпочтительно для профилактики и/или лечения заболевания или медицинского состояния, выбираемого из группы, состоящей из язв, краснухи, свинки, кори, болезни Лайма, герпеса, рака, столбняка, дифтерии, [рака], лейшманиоза и СПИДа.

Применение

Лекарства, то есть фармацевтические композиции, вакцины и т.д. являются пригодными для медицинского лечения и/или профилактики. Вследствие этого, дополнительный аспект настоящего изобретения касается способа лечения и/или профилактики заболевания или медицинского состояния, включающего стадию введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению пациенту-млекопитающему, предпочтительно пациенту-человеку, который в этом нуждается.

В предпочтительном аспекте, настоящее изобретение направлено на указанный выше способ, где заболевание и/или состояние здоровья выбирается из группы, состоящей из микобактериальных инфекций, предпочтительно инфекции М.tuberculosis, язв, краснухи, свинки, кори, болезни Лайма, герпеса, рака, столбняка, дифтерии, [рака], лейшманиоза и СПИДа.

В целях терапевтического и/или профилактического применения, фармацевтические композиции настоящего изобретения могут вводиться в виде любой стандартной лекарственной формы любым стандартным способом. Пути введения включают, но ими не ограничиваются, внутривенное, внутримышечное, подкожное, интраназальное, внутрисуставное введение, введение путем инфузии, подъязычное, трансдермальное, пероральное, топическое (местное) введение или введение путем ингаляции. Предпочтительными путями введения являются подкожное, внутривенное и интраназальное введение.

Микобактерии могут вводиться сами по себе или в комбинации с адъювантами, которые повышают стабильность и/или иммуногенность микобактерий, облегчают введение содержащих микобактерии фармацевтических композиций, обеспечивают улучшенное растворение или диспергирование, повышенную пропагативную активность, обеспечивают вспомогательную терапию и тому подобное, включая другие активные ингредиенты.

Как упоминалось выше, фармацевтические лекарственные формы микобактерий, описанные в настоящем изобретении, включают фармацевтически приемлемые носители и/или адъюванты, известные специалисту среднего уровня квалификации в данной области техники. Эти носители и адъюванты включают, например, ионообменники, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки крови, буферные вещества, воду, соли, электролиты, вещества на основе целлюлозы, желатин, [воду], вазелин, животное или растительное масло, минеральное или синтетическое масло, солевой раствор, декстрозу или другие сахаридные и гликольные соединения, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль, или полиэтиленгликоль, антиоксиданты, молочную кислоту и т.д. Предпочтительные лекарственные формы включают таблетки, капсулы, растворы, суспензии, эмульсии, растворимые порошки и трансдермальные пластыри. Способы изготовления лекарственных форм являются хорошо известными, смотри, например, Н.С.Ansel and N.G.Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5^th ed., Lea and Febiger (1990) и, в особенности, Pastoret et al., Verterinary Vaccinology, Elsevier (March 1999). Уровни и требования к дозировкам хорошо известны в данной области техники и могут быть выбраны специалистом средней квалификации в данной области техники из доступных методов и способов, подходящих для конкретного пациента. Как должен понимать квалифицированный специалист, в зависимости от конкретных факторов могут требоваться более низкие или более высокие дозировки. Например, специфические дозировки и режимы введения будут зависеть от таких факторов, как общее состояние здоровья пациента, тяжесть заболевания и течение болезни у конкретного пациента или его предрасположенность к заболеванию, и решение лечащего врача.

Например, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться тем же самым способом, что и обычные фармацевтические композиции на основе живых микобактерий или на основе других бактерий.

В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция включает живую бактерию М.bovis BCG zmp1.

Более предпочтительно, микобактерии лиофилизируются и стабилизируются с применением обычных стабилизирующих агентов, таких как сахара, например сахароза, и/или желатины. Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде таблеток или в других твердых формах и может позже быть растворена в воде для получения раствора для введения, например, перорально, путем инъекции или интраназально.

Необходимо подчеркнуть, что фармацевтические композиции настоящего изобретения могут вводиться в более низких дозировках, чем обычные фармацевтические композиции на основе живых микобактерий, поскольку микобактерии, применяемые в настоящем изобретении, являются более иммуногенными и вызывают повышенную защитную эффективность по сравнению с композициями с обычными микобактериями, например бактериями дикого типа М.bovis BCG.

Далее настоящее изобретение будет более детально проиллюстрировано со ссылкой на конкретные воплощения, которые не должны рассматриваться как ограничивающие рамки настоящего изобретения, определенные в прилагаемой Формуле изобретения.

Чертежи

Фигура 1: Группы мышей линии C57BL/6 были иммунизированы 100, 1000 или 10000 КОЕ BCG WT (дикого типа) или BCG zmp1 и заражены внутрикожно PPD (сухим туберкулином) в подошву ноги в день 21. DTH (реакция кожной гиперчувствительности замедленного типа) подошвы ноги была измерена через 48 часов.

Фигура 2: Группы мышей линии C57BL/6 были иммунизированы 1000 [КОЕ] BCG WT (белые столбики) или BCG zmp1 (черные столбики). Через 4 недели спленоциты (селезеночные макрофаги) были рестимулированы in vitro PPD (сухим очищенным туберкулином), или пептидами Ag85A или ТВ 10.3. Секреция IFN- (ELISA) и пролиферация (включение 3Н-тимидина) были измерены в день 3 и день 4 соответственно. *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001 (критерий Манна-Уитни).

Фигура 3: Анализ IFN- -продуцирующих CD4 и CD8 положительных Т клеток после вакцинации мышей BCG WT, BCG zmp1 или физиологическим раствором (не обработанные). Спленоциты были рестимулированы PdBu или PPD, и внутриклеточный IFN- был проанализирован с помощью проточной цитометрии. (А) Гистограммы демонстрируют частоту IFN- -продуцирующих CD8 Т клеток (среднее значение±стандартная ошибка). (В, С) Данные на диаграммах показывают частоту IFN- -продуцирующих CD8 (В) или CD4 (С) Т клеток. Столбики показывают 25-й и 75-й процентили и медиану, а «усики» (границы разброса) показывают 10-й и 90-й процентили; представлен один из двух репрезентативных экспериментов.

Фигура 4: Эффективность защиты BCG zmp1 в модели смертности у мышей. Группы мышей, которые вакцинировались BCG, BCG zmp1 или не вакцинировались (контроль), были заражены М.tuberculosis, после чего анализировалось их выживание.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Материалы и методы

Штаммы микобактерий и условия выращивания

Mycobacterium bovis BCG выращивались на чашках с агаром Миддлбрука 7Н10, обогащенным олеиновой кислотой, альбумином, декстрозой и каталазой (OADC) (Becton Dickinson), на агаре Дюбо, в жидкой среде 7Н9, обогащенной OADC, в присутствии Твина 80 (0,05%) или в бульоне Дюбо, и инкубировались при 37°С.

Конструирование BCG zmp1 нокаутного мутанта было описано ранее (Master et al., supra). Коротко, NotI - фрагмент размером 4,4 т.п.н., включающий М.tuberculosis zmp1 (Rv0198c) и его фланкирующий участок, был выделен из ВАС клона Rv165 (Brosch et al. Infect. Immun. 66, 2221-2229, 1998), части zmp1 (770 пн) были делегированы с помощью расщепления Nhel и заменены на кассету, обеспечивающую устойчивость к канамицину. Полученный суицидный вектор (вектор-самоубийца) был трансформирован в BCG штамм 1721, селекция проводилась на агаре 7Н10, обогащенном OADC, в присутствии подходящих антибиотиков (Sander et al., rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Mol. Microbiol. 16, 991-1000, 1995). Замена хромосомного локуса zmp1 на инактивированный аллель была продемонстрирована с помощью Саузерн-блот анализа.

Иммунизация мышей для анализа DTH, пролиферации спленоцитов, секреции цитокинов и FACS

Мышей иммунизировали разными дозами BCG или BCG zmp1 путем подкожной инъекции. Инокуляты разводили в буферном растворе, и объем инъекции составлял 100 мкл. Через три недели мышей заражали с помощью инъекции 5 мкг очищенного белкового производного туберкулина - PPD (Statens Serums Institut, Copenhagen, Denmark), растворенного в 50 мкл физиологического раствора, в подошву задней правой стопы. Через два дня анализировали реакцию DTH (реакция кожной гиперчувствительности замедленного типа) путем измерения размера отека подошвы с использованием пружинного цифрового микрометра (Mitutoyo, Kawasaki, Japan).

Для исследования in vitro пролиферации спленоцитов и секреции цитокинов через четыре недели после иммунизации мышей подвергали эвтаназии и изолировали селезенку. Коротко, 6×10 ⁵ свободных от эритроцитов спленоцитов инкубировали в круглодонных 96-луночных планшетах с PPD или с полученными из М.tuberculosis антигенами Ag85A (LTSELPGWLQANRHVKPTGS) и ТВ 10.3 (GTHESNTMAMLARDG) в обогащенной среде RPMI. Через три дня супернатанты собирали и замораживали для последующего анализа секреции IFN- с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (R&D Systems, Abingdon, United Kingdom). К оставшимся клеткам был добавлен пульс 1 мкКи ³H-меченого тимидина в течение 16 часов для анализа пролиферации с помощью сцинтилляционного счетчика -излучения.

Для анализа с использованием флуоресцентной сортировки клеток (FACS) мышей первично и повторно вакцинировали с интервалом в четыре недели. Через семь дней выделяли спленоциты для анализа синтеза IFN- с помощью проточной цитометрии. Суспензия одиночных клеток, содержащая примерно 2×10⁶ свободных от эритроцитов спленоцитов, была рестимулирована в 24-луночных планшетах в течение 5 часов в присутствии 5 мкг/мл PPD или 0,5 мкг/мл форбол-12,13-дибутирата (PdBu; Sigma, Buchs, Switzerland) в присутствии 5 мкг/мл брефелдина A (Brefeldin A, Sigma). После этого клетки промывали, инкубировали на льду в течение 5 минут с антителами, направленными против CD16/CD32, в 2% PBS/FCS в присутствии 0,01% азида натрия для блокирования Fc-рецепторов, и поверхность клеток окрашивали антителами против CD4 (мечеными ФИТЦ) и против CD8 (мечеными РеrСР) на льду в течение 20 минут. После фиксации в свободном от белков 1% PBS/PFA в течение 10 минут и пермеабилизации клеток в 0,1% PBS/NP40 в течение 3 минут клетки были окрашены на внутриклеточный INF- (APC) в 2% PBS/FCS на льду в течение 35 минут. Образцы вносили в прибор FACSCanto и анализировали с использованием программного обеспечения FACS Canto Diva software фирмы BD Biosciences (San Jose, CA).

Эксперименты по вакцинации

В экспериментах использовались самки мышей возрастом 8-10 недель на начало эксперимента. Была получена свободная от комков суспензия микобактерий в середине логарифмической фазы роста и инокуляты были прямо оценены путем микроскопического исследования профильтрованных суспензий микобактерий на обычном гемоцитометре, после чего были доведены до желаемой концентрации клеток. Подсчет числа бацилл в инокуляте был проведен путем высевания 3-кратных серий разведений и подсчета микроколоний и видимых колоний через 3 и 20 дней инкубации при 37°С, соответственно, и подтвердил, что точность микроскопического подсчета КОЕ составила >90%. Мыши были вакцинированы путем подкожного введения 10⁶ КОЕ BCG, BCG zmp1 или оставались невакцинированными (контроль с физиологическим раствором). Через шесть недель после вакцинации мышей заражали 10² КОЕ вирулентной М.tuberculosis H37Rv путем аэрозольного инфицирования с использованием системы для ингаляции (Glas-Col, Terre Haute, IN). Для оценки микобактериального заражения селезенок и легких, 0,1 мл из серии 10-кратных разведении гомогенатов целых органов из четырех индивидуальных мышей в каждой временной точке высевали на агар и подсчитывали число колоний через 18-20 дней инкубации при 37°С. Для построения кривых выживания использовали группы по 6-9 мышей. Умирающие животные умерщвлялись.

Гистопатология

Через двадцать две недели после инфицирования мышей М.tuberculosis ткани легких были проанализированы на наличие патологии. Ткань легких (средняя правая доля) была заморожена с применением градиента температуры от -60°С до -20°С в электронном криотоме, и были получены серии срезов толщиной 6-8 мкм через самую широкую часть доли легкого. Срезы были прокрашены гематоксилином и эозином и исследованы опытным патологом.

Статистический анализ

Непараметрические данные были проанализированы с использованием двустороннего U-критерия Манна-Уитни для двух независимых образцов или с помощью Н-критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом Дана для трех или более образцов. Был проведен двухфакторный дисперсионный анализ переменной (одномерный GLM анализ переменной) в отношении опухоли подошвы ноги, секреции IFN- или пролиферации в качестве зависимых переменных и штамма BCG

(+/- zmp1) или дозы иммунизации (10² -10⁴ КОЕ) в качестве постоянных (фиксированных) факторов. Перед проведением дисперсионного анализа ANOVA был рассчитан критерий Левена для оценки равенства дисперсий ошибок двух выборок, и если было необходимо, к данным применялось преобразование значимости для обеспечения допущения о равенстве дисперсий ошибок. Был задан 5% уровень значимости.

Пример 2. Делеция zmp увеличивает иммуногенность BCG

Для исследования роли zmp1 в иммуногенности BCG мыши были иммунизированы титрованными дозами штаммов дикого типа и штаммов, дефицитных по zmp1. Измерение ответа DTH после инфицирования подошвы стопы PPD наблюдался разный порог для индукции для этих двух штаммов, использованных для вакцинирования. Тогда как для получения достоверного отека стопы был необходим инокулят штамма дикого типа, содержащий 10 ³ КОЕ, только одна десятая от этой дозы была достаточна для получения эквивалентного ответа в случае мутанта zmp1, где максимальный отек наблюдался при применении от 10⁴ до 10⁵ КОЕ (данные не представлены). Мы дополнительно проанализировали степень отека стопы при использовании инокулятов, содержащих 10²-10⁴ КОЕ. Как показано на фигуре 1, мутант zmp1 индуцировал достоверно более сильный ответ DTH по сравнению с BCG дикого типа при дозе 10³ (Р=0,0006; критерий Манна-Уитни) и 10⁴ (Р=0,0262) КОЕ. Эксперимент был повторен, и однофакторный анализ дисперсии для объединенных данных показал, что независимо от размера инокулята, BCG zmp1 вызывал более сильный ответ DTH по сравнению с BCG дикого типа (Р<0,001).

Повышенная иммуногенность дефицитного по zmp1 штамма BCG была связана с повышенными пролиферативным и цитокин-секретирующим in vitro иммунными ответами спленоцитов мышей, иммунизированных либо BCG дикого типа, либо BCG zmp1. Фигура 2 иллюстрирует это на инокуляте с 10³ КОЕ: спленоциты из мышей, иммунизированных BCG zmp1, демонстрируют достоверно большую продукцию IFN- , чем спленоциты мышей, иммунизированных диким типом, после рестимуляции in vitro PPD (Р=0,0147 согласно критерию Манна-Уитни) или антигенами М.tuberculosis Ag85A (Р=0,0133) или ТВ10.3 (Р=0,0005). Подобно этому пролиферация клеток была достоверно повышена в клетках из мышей, иммунизированных BCG zmp1 (фигура 2). Двусторонний анализ ANOVA, проведенный для всех данных, независимо от дозы BCG in vivo или типа используемого антигена для рестимуляции in vitro, показал, что мутант zmp1 вызывал более эффективную секрецию INF- (Р=0.023) и пролиферацию (Р0.001), чем вызывал BCG дикого типа.

Для выяснения, обеспечивается ли секреция IFN- CD8 или CD4 положительными Т-клетками, спленоциты из иммунизированных мышей были прокрашены и проанализированы с помощью проточной цитометрии. Оба подтипа Т-клеток были способны продуцировать IFN- с частотой на уровне 7-9% (фигура 3). Однако при сравнении частот CD8 IFN- -продуцирующих клеток у BCG-вакцинированных мышей с таковыми у контрольных (необработанных) мышей, штамм дикого типа не отличался достоверно от фоновых уровней при анализе с помощью критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом Дана для множественного сравнения (Р>0,1). В противоположность этому, штамм BCG zmp1 продуцировал достоверные уровни INF- как в CD4, так и в CD8 Т-клетках, при рестимуляции либо PdBu, либо PPD (Р<0,05). Прямое сравнение двух штаммов BCG показало, что независимо от подтипа Т-клеток (CD4 или CD8) или от агента для рестимуляции (PdBu или PPD), BCG zmp1 вызывал значительно более высокую продукцию INF- .

Пример 3. Делеция zmp1 увеличивает защитную эффективность BCG

Эффективность защиты мутанта М.bovis BCG zmp1 была проанализирована на модели туберкулеза у мышей. Группы мышей (C57BL/6) были иммунизированы подкожной инъекцией BCG, мутанта BCG zmp1 или оставались необработанными. Через шесть недель мыши были заражены низкой дозой (10² КОЕ) М.tuberculosis H37Rv путем аэрозольного инфицирования, после чего проводился мониторинг КОЕ, патологии легких и смертности. Через три недели после аэрозольного заражения, легкие контрольных мышей содержали большое число М.tuberculosis. Вакцинация снижала бактериальное заражение в легких и в селезенке примерно на 1-2 порядка в первые три недели инфекции. Между третьей и двадцать второй неделями после заражения мыши были способны контролировать инфекцию, и число КОЕ стабилизировалось.

Через двадцать две недели после инфицирования в срезах легких всех трех групп животных (не вакцинированный контроль, вакцинированные BCG, вакцинированные BCG zmp1) были выявлены области паренхимы легких с уменьшенным открытым альвеолярным пространством, измененной шириной альвеолярных стенок и заполненным макрофагами воздушным пространством, причем уровни неспецифического диффузного воспаления, поражающие паренхиму легких, были самыми низкими у мышей, вакцинированных BCG zmp1. Инфильтраты лимфоцитов, присутствующие вокруг кровеносных сосудов и в непосредственной близости от эпителия бронхов, были увеличены у вакцинированных групп по сравнению с не вакцинированным контролем, и были наиболее выражены у животных, вакцинированных BCG zmp1. При сканировании с увеличением было обнаружено, что инфильтраты лимфоцитов у мышей, вакцинированных BCG zmp1, были самыми плотными с тенденцией к конфлюентности (слиянию), тогда как не вакцинированные и вакцинированные BCG животные имели менее плотные лимфоидные инфильтраты только с маленькими агрегатами. Для дальнейшей количественной оценки степени инфильтрации лимфоцитов в разных группах животных был выбран морфометрический подход с использованием системы AnalySIS-system (Olympus, Switzerland). В каждом срезе легкого животного было идентифицировано 20 агрегатов лимфоцитов. Был измерен средний диаметр лимфоидных инфильтратов и подсчитано количество лимфоидных инфильтратов на один срез легкого. Средний диаметр в группе, вакцинированной BCG zmp1, составил 0,31 мм по сравнению с 0,13 мм в группе, вакцинированной BCG дикого типа, и 0,18 мм в контрольной группе. Кроме того, процент лимфоидных агрегатов на один срез легкого был увеличен в группе BCG zmp1 (7,2%) по сравнению с группой BCG дикого типа (1,85%) и контрольными животными (2,2%).

Биологический эффект разрушения zmp1 на защитную эффективность BCG был дополнительно исследован у мышей путем анализа среднего времени выживания (mean survival times, MST) после инфицирования. Результаты, представленные на фигуре 4, показывают, что не вакцинированные животные начали умирать на 106 день после заражения и все не вакцинированные контрольные животные умерли через 270 дней, вакцинированные BCG мыши начали умирать через 189 дней, и последняя мышь умерла на 305 день, а мыши, иммунизированные BCG zmp1, начали умирать через 244 дня, и последняя мышь умерла на 364 день. MST составило 203,8+/-13,9 дней для контрольных мышей, 254,8+/-15,7 дней для BCG-вакцинированных и 297,1+/-15,0 дней для BCG zmp1-иммунизированных мышей (логарифмический ранговый критерий BCG против не иммунизированных р=0,02; BCG zmp1 против BCG р=0,082; BCG zmp1 против не иммунизированных р=0,00009). По сравнению с BCG мутант BCG zmp1 был почти в два раза более эффективным в увеличении выживаемости ( MST для не вакцинированных контролей 94 дня для BCG zmp1 по сравнению с 51 днями для BCG); относительные риски (hazard ratios, HR), рассчитанные по кривым выживания, составили для BCG против не иммунизированных 33% и р=0,032; BCG zmp1 против BCG HR=26% и р=0,01; BCG zmp1 против неиммунизированных HR=11% и р=0,000001.