ингибитор вируса клещевого энцефалита

Формула изобретения

Применение L-лизин- -оксидазы штамма Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 для ингибирования вируса клещевого энцефалита в клетках in vitro.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к вирусологии и может найти применение в медицине.

Наиболее полно изучена противовирусная активность аналогов природных нуклеозидов. Обобщение работ по ингибирующей активности рибавирина на репродукцию вирусов выполнена R.A.Smith с соавт.(Clinical application of Ribavirin. Ads. by R.A.Smith, V.Knight, J.A.D.Smith. Academic Press Inc, New York, December 1984, 222 pages). В ходе экспериментов было установлено, что рибавирин подавляет репродукцию вирусов, влияя на стадию, следующую за синтезом вирусных РНК и белков. Однако, как было установлено, влияние рибавирина на репродукцию флавивирусов или отсутствует, или сомнительно (Л.К.Березина. Химиопрофилактика и химиотерапия. В книге "Арбовирусы и арбовирусные инфекции". Ред. Львов Д.К, Клименко С.М., Гайдамович С.Я. - М.: Медицина, 1989. - с.156-163). Клещевой энцефалит - острое тяжелое инфекционное заболевание, часто протекающее с поражением центральной нервной системы, вызываемое вирусом клещевого энцефалита (КЭ) семейства Flaviviridae, широко распространенного на территории России и Европы. Единственным клинически апробированным, рекомендованным препаратом, применяемым для лечения КЭ, является йодантипирин (Лепехин А.В., Лукашова Л.В., Жукова Н.Г., Бужак Н.С., Добкина М.Н. Лечение клещевого энцефалита, иксодовых клещевых боррелиозов и других клещевых инфекций. Методические рекомендации для врачей. Издание 2, Томск, 2009, 13 стр.). Йодантипирин не является противовирусным средством, а относится к индукторам интерферона. Однако в случае невозможности индукции собственного интерферона у больного, йодатипипирин не окажет воздействия на течение болезни у человека, уже заболевшего (Худолей В.Н., Замятина Е.В., Кропоткина Е.А., Лукашова Л.В., Лепехин А.В., Данчинова Г.А., Злобин В.И. Результаты исследования эпидемиологической эффективности йодантипирина как средства экстренной профилактики клещевого энцефалита. Материалы 5-й Межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные вопросы неврологии". Новосибирск, 26-27 ноября, 2008 г., с.205-209).

Задачей изобретения является подавление вирусной активности клещевого энцефалита в клетках.

Задача достигается тем, что в качестве ингибитора вируса клещевого энцефалита в клетках in vitro применяют L-лизин- -оксидазу Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180 (Москва, Дорожный 1-й проезд, д.1, ФГУПГосНИИгенетики, 1982 г.).

Морфолого-биохимическая характеристика штамма.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai на среде сусло-агар образует колонии быстрорастущие. Мицелий гриба бесцветный, септированный, распростертый. На 4-5 сутки роста появляются дерновинки с конидиеносцами, подушковидные, сначала белые, со временем желтого или темно-зеленого цвета. Фиалиды бутыльчатые /9-12µ/, расположены мутовками по 3 и более. На каждой фиалиде образуются конидии, склеенные в головку. Конидии гриба округлые, гладкие, мелкие /3-5µ/, в проходящем свете бледно-зеленые, а в массе - темные.

На агаризованной среде Чапека колонии штамма-продуцента быстрорастущие, но слабо спороносящие. Штамм хорошо растет на среде Чапека, однако лучший рост наблюдается на среде сусло-агар. Агар и желатину не разжижает, молоко не пептонизирует. Аэробный гриб. Температурный оптимум +28-+29°С. На картофельно-декстрозном агаре наблюдается снижение интенсивности роста, образование воздушного мицелия и спороношения. Оптимальные условия роста гриба при рН 4-6, однако может расти и при рН от 1,5 до 9.

Trichoderma harziatum Rifai в одинаковой степени усваивает как аммонийные, так и азотнокислые соли. Лучшим источником азота из органических соединений является пептон. Хорошо растет на средах с аспарагином и с глутаминовой кислотой. Лучшими источниками углерода являются ксилоза, глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, маннит, крахмал. На средах с этими сахарами наблюдается интенсивный рост. Слабо усваиваются спирты метиловый, этиловый, дульцит. Хорошо усваивает в качестве источника углерода пшеничные отруби. Инокулят гриба, выросший на среде с пшеничными отрубями, дает положительный результат при использовании его при ферментации на средах разного состава и является индуктором биосинтеза L-лизин- -оксидазы.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai обладает L-лизин- -оксидазной активностью. Активность L-лизин- -оксидазы в культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai рассчитывали по приросту Н₂О₂, количество которой определяли спектрофотометрическим ортодиазидиновым микрометодом. Сущность метода заключается во взаимодействии всей образующейся в реакции Н₂О₂ с О-дианизидингидрохлоридом. Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 250 мкг О-дианизидингидрохлорида и 0.1-0,5 мг белка в 1 мл конечного объема. После 20 минут инкубирования в термостате при температуре +37°С пробы охлаждали до +4°С. Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 540 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы).

Для построения калибровочной кривой молярность свежеприготовленного раствора Н₂О₂ определяли перманганатометрией. Субстратами служили L и DL-формы аминокислот («Reanal», Венгрия). Применяли 0,05 М фосфатный буфер. В качестве катализатора пероксидазной реакции использовали пероксидазу фирмы «Reanal», а в качестве донора протонов - О-дианизидингидрохлорид («Merck»,ФРГ). За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль Н₂О₂ за 1 мин при температуре +37°С.

Удельную активность фермента выражали числом единиц активности на 1 мг белка или 1 мл культуральной жидкости. Белок определяли по методу Лоури. В качестве стандарта использовали 0.05%-ный раствор кристаллического бычьего альбумина («Reanal», Венгрия).

Для оценки чистоты препарата использовали электрофорез в 10% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, а также капиллярный электрофорез на установке Капель 105 производства фирмы Люмекс (Санкт-Петербург).

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai

Ферментация штамма № F-180 производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (г.Пущино).

Использовали ферментер типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г.Кириши, объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментер оснащен магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и рН.

Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор - 0,1%, 1,3% сульфат аммония, значение рН 5.8-6,0 устанавливали 10%-ным раствором НСl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при t° +125°C. Затем подготовленный ферментер засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°С, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину рН в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 часов, конечные значения рН от 5,3 до 7.5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг.Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин в течение часа при температуре +2-+4°С. Затем нативный раствор в объеме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Определение активности L-лизин-а-оксидазы в опытах in vitro на модели вируса клещевого энцефалита

Опыты по определению противовирусной активности в отношении вируса КЭ были выполнены в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона свиньи SPEV. Источником заражения клеток служили вируссодержащие суспензии мозговой ткани инфицированных новорожденных белых мышей. Для приготовления разведений вируса и L-лизин- -оксидазы использовалась питательная среда 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН) с 1% эмбриональной телячьей сыворотки («High Clone», США) - поддерживающая среда. Готовили 10% мозговую суспензию, а затем последовательные 10-кратные разведения вируса (разведения от 10^-2 до 10^-8). Каждое разведение, начиная с верхнего горизонтального ряда (А), вносили по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов («Corning», США) с монослоем клеток SPEV. В ряд (Н) вносили поддерживающую среду без вируса. Контакт вируса с клетками проводили в течение 1 часа при +37°С. После инкубации вируссодержащую среду удаляли из планшета. В лунки с контрольным (сравнительным) титрованием - 4 вертикальных ряда ( № 9-12) - вносили поддерживающую среду, а в лунки, предназначенные для определения противовирусной активности, добавляли поддерживающую среду, содержащую L-лизин- -оксидазу в концентрациях 25 мкг/мл (4 вертикальных ряда ( № 1-4)) и 12,5 мкг/мл (4 вертикальных ряда ( № 5-8)) (Табл.1).

Таблица 1
Схема эксперимента "Определение активности L-лизин- -оксидазы в опытах in vitro на модели вируса клещевого энцефалита". Вид 96-луночного планшета.
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2	-2
B	-3	-3	-3	-3	-3	-3	-3	-3	-3	-3	-3	-3
C	-4	-4	-4	-4	-4	-4	-4	-4	-4	-4	-4	-4
D	-5	-5	-5	-5	-5	-5	-5	-5	-5	-5	-5	-5
E	-6	-6	-6	-6	-6	-6	-6	-6	-6	-6	-6	-6
F	-7	-7	-7	-7	-7	-7	-7	-7	-7	-7	-7	-7
G	-8	-8	-8	-8	-8	-8	-8	-8	-8	-8	-8	-8
H	Контроль токсичности	Контроль токсичности	Контроль клеток
	25 мкг/мл	билайф 12,5 мкг/мл	среда 199

Инкубацию планшетов проводили в термостате с 5% содержанием СО₂ при +37°С. Учет реакции проводили ежедневно в течение 7 дней, наблюдая за развитием ЦПД вируса на клетки (гибель клеток), просматривая лунки планшетов под инвертированным микроскопом ("Leitz", Германия). Титр вируса оценивали в lg ЦПД ₁₀₀. Было установлено, что титр вируса в контроле составил 8,0 lg ЦПД₁₀₀, а с L-лизин- -оксдазой как в концентрации 25 мкг/мл, так и 12,5 мкг/мл составил 5,0 lg ЦПД₁₀₀ (Табл. 2).

Таблица 2

Результат испытания противовирусного действия L-лизин- -оксидазы

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

А

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

В

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

С

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

D

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

Е

ЖК*

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

F

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

G

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЦПД

ЦПД

ЦПД

ЦПД

Н

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

ЖК

* - живые клетки

Так как в контрольном титровании вируса не удалось обнаружить ни одной живой клетки, то обнаружение живых клеток в лунках с L-лизин- -оксидазой свидетельствует о ее противовирусной активности. Индекс противовирусной активности составил 3 lg. L-лизин- -оксидаза в концентрациях менее 1,0 мкг/мл не активна, а в концентрациях более 25,0 мкг/мл обладает выраженным цитотоксическим действием.