способ прогнозирования качества эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения

Формула изобретения

Способ прогнозирования качества эмбриона в программе ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием путем исследования периферической венозной крови, отличающийся тем, что до начала овариальной стимуляции в лейкоцитах определяют полиморфизм генов HLA II класса и при обнаружении носительства аллелей DQBl*06 и/или DRBl*13 прогнозируют высокое качество эмбрионов, а при отсутствии носительства аллелей DQBl*06 и DRBl*13 прогнозируют низкое качество эмбрионов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования качества эмбрионов перед проведением программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором.

Актуальность. Согласно результатам эпидемиологических исследований, частота бесплодия в браке колеблется от 8 до 29% (Кулаков В.И. Репродуктивное здоровье населения России // Акушерство и гинекология. - 2002. - № 2. - С.4-7). При этом для 42,6-65,3% бесплодных супружеских пар проблема деторождения связана с нарушением репродуктивной функции женщины. Среди причин женской инфертильности прежде всего следует выделить трубный фактор (непроходимость либо отсутствие маточных труб), как наиболее распространенный (частота последнего составляет 37,5-37,7%) (Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению/под ред. В.И.Кулакова. - М: ГЭОТАР - Медиа, 2005. - 616 с.). Диагноз трубного бесплодия у женщины на сегодняшний день является одним из показаний к применению вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в частности метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов (ПЭ) в полость матки. Несмотря на широкое распространение и опыт в проведении данной методики, частота наступления беременности после ЭКО и ПЭ остается невысокой и по данным разных авторов колеблется от 20% до 40% (Гришенко В.И., Петрушко М.П., Пиняев В.И. Результативность программы ЭКО в зависимости от количества и качества переносимых эмбрионов // Проблемы репродукции. - 2000. - № 1. - С.44-47).

Известно, что успех проведения процедуры ЭКО во многом определяется качеством переносимых в полость матки эмбрионов. Несмотря на то что градация по качеству несколько отличается в различных лабораториях, общепризнанным считается, что максимальную способность к имплантации имеют эмбрионы с наибольшей скоростью дробления, бластомеры которых имеют регулярную форму, а безъядерные фрагменты отсутствуют. Такие эмбрионы относят к классу 1 (А). Эмбрионы с неравными бластомерами и/или фрагментами цитоплазмы, занимающими менее 10% объема, соответствуют классу 2 (В); при наличии фрагментации 10,0-50,0% - классу 3 (С), более 50,0% - классу 4 (D) (Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского бесплодия (теоретические и практические подходы): руководство для врачей / под ред. В.И. Кулакова, Б.В. Леонова. - М., 2001. - 782 с). Таким образом, прогнозирование качества эмбрионов до вступления женщины в программу ЭКО позволит повысить эффективность процедуры и даст возможность своевременно скорректировать тактику ведения пациентки.

Аналоги.

Существует способ прогнозирования качества эмбрионов и ооцитов на основе измерения уровней активности фермента кислой церамидазы на 3 и 5 день после оплодотворения в питательной среде, с которой непосредственно взаимодействуют эмбриональные клетки. Уровни активности этого фермента положительно коррелируют с качеством эмбрионов, развивающихся in vitro. При снижении активности кислой церамидазы прогнозируют понижение качества и/или гибель эмбриона на ранних этапах эмбриогенеза (после стадии 2-х клеток) (Patent WO 2010127355 Method to determine embryo and oocyte quality based on ceramidase, Sinai School Medicine Schuchman Edward H., Eliyahu Efrat. [Электронный ресурс]: // http://worldwide.espacenet.com/publicationDetails/biblio?DB=EPODOC&adjacent=true&locale=ru_ru&FT=D&date=20101104&CC=WO&NR=2010127355A1&KC=A1).

Недостатками указанного метода являются:

1. При осуществлении способа высок риск возникновения осложнений, связанных с выполнением трансвагинальной пункции фолликулов, которая проводится под общим наркозом и может осложниться кровотечением.

2. Использование способа возможно только после забора яйцеклеток.

3. Способ осуществляется после овариальной стимуляции, на этапе, когда невозможно скорректировать тактику ведения пациентки.

4. Для осуществления способа необходимо наличие комплекта, включающего агент для определения кислой церамидазы и индикатор, показывающий степень активности фермента.

Известен способ прогнозирования качества эмбрионов, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости определяют содержание ингибина Б и при его низких значениях (10,9-103,9 нг/мл) прогнозируют получение эмбрионов низкого качества. (The concentration of inhibin В in follicular fluid: relation to oocyte maturation and embryo development / C.L.Chang, Т.Н.Wang, S.G.Horng et all. // Hum. Reprod. - 2002. - Vol.17, № 7. - P.1724-1728.) Однако этот способ имеет ряд недостатков:

1. При осуществлении способа высок риск возникновения осложнений, связанных с выполнением трансвагинальной пункции фолликулов, которая проводится под общим наркозом, и может осложниться кровотечением.

2. Из данных литературы известно, что продукция ингибина Б у женщин уменьшается после 40 лет, что связано с возрастным снижением овариального резерва (Gougeon A. The biological aspects of risks of infertility due to age: the female side // Rev Epidemiol. Sante. Publique. - 2005. - Vol.53, № 2. - P.2S37-45.).

3. Отсутствуют данные о точности способа.

Известен способ прогнозирования качества эмбрионов с помощью определения концентрации лактоферрина в фолликулярной жидкости. При высоких значениях этого показателя (500,2±35,5 нг/мл) прогнозируют высокое качество эмбрионов, а при низких значениях (379,7±45,1 нг/мл) - снижение качества эмбрионов (High concentrations of lactoferrin in the follicular fluid correlate with embryo quality during in vitro fertilization cycles / A.Yanaihara, K.Mitsukawa, S.Iwasaki et all. // Fertil. Steril. - 2007. - Vol.87, № 2. - P.279-282).

Способ имеет ряд недостатков:

1. Прогнозирование по данному способу проводится после окончания протокола овариальной стимуляции и забора фолликулярной жидкости, т.е. на этапе, когда уже невозможно скорректировать тактику ведения пациентки.

2. При осуществлении способа высок риск возникновения осложнений, связанных с выполнением трансвагинальной пункции фолликулов, которая проводится под общим наркозом и может осложниться кровотечением.

3. Известно, что при трубном факторе бесплодия концентрация лактоферрина в фолликулярной жидкости не изменяется в зависимости от успеха или неуспеха ЭКО (Профилактика репродуктивных потерь и плацентарной недостаточности. Белки, цитокины и антигенспецифические иммунокомплексы фолликулярной жидкости и сыворотки крови у женщин при экстракорпоральном оплодотворении / Л.В.Маркина, P.M.Зорина, В.Н.Зорина и др. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2008. - Т.7, № 5. - С.29-33.).

4. Отсутствуют данные о точности способа.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ прогнозирования качества эмбриона, базирующийся на определении в периферической крови уровня лептина у женщин, которым проводилась овариальная стимуляция по длинному протоколу. При низких значениях сывороточного содержания лептина (50,05±5,6 нг/мл) прогнозируют получение эмбрионов высокого качества, при высоких показателях (59,48±7,6 нг/мл, Р=0,047) прогнозируют получение эмбрионов низкого качества (Serum and follicular fluid leptin levels are correlated with human embryo quality / G.Anifandis, E.Koutselini, I.Stefanidis et all. // Reproduction. - 2005. - Vol.130. - P.917-921).

Данный способ имеет ряд недостатков:

1. Способ осуществляется после овариальной стимуляции, на этапе, когда невозможно скорректировать тактику ведения пациентки.

2. Применим только для женщин, которые проходили стимуляцию суперовуляции по длинному протоколу.

3. В литературе имеются противоречивые данные о возможности использования данного показателя для прогнозирования качества эмбриона. Ряд исследователей указывает на отсутствие связи между сывороточным уровнем лептина и качеством эмбриона в IVF-ICSI циклах (Intrafollicular and circulating concentrations of leptin do not predict the outcome in IVF-ICSI cycles / B.Asimakopoulos, F.Koster, R.Felberbaum et all. // Reprod Sci. - 2009. - Vol.16, № 1. - P.113-119.).

4. Известно, что лептин вырабатывается адипоцитами и его содержание коррелирует с показателями индекса массы тела, поэтому индивидуальный разброс этого показателя в зависимости от массы тела женщин может повлиять на точность прогноза в случае его использования для прогнозирования качества эмбриона (Leptin concentrations in the peritoneal fluid of women with ovarian endometriosis are different according to the presence of a 'deep' or 'superficial' ovarian disease / C.Alviggi, R.Clarizia, G.Castaldo et all. // Gynecol Endocrinol. - 2009. - Vol.25, № 9. - P.610-615.).

5. Отсутствуют данные о точности, чувствительности и специфичности способа.

Техническим результатом является повышение точности прогнозирования качества эмбриона в программе ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием. Способ позволяет прогнозировать качество эмбриона до начала овариальной стимуляции, что обеспечивает возможность подбора наиболее подходящей схемы индукции суперовуляции для получения достаточного количества эмбрионов, удовлетворяющих по качеству условиям, необходимым для имплантации.

Технический результат достигается тем, что у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием до начала овариальной стимуляции в лейкоцитах периферической крови определяют полиморфизм генов HLA II класса и при выявлении носительства аллелей DQB1*06 и/или DRB1*13 прогнозируют высокое качество эмбрионов, а при отсутствии носительства аллелей DQB1*06 и DRB1*13 прогнозируют низкое качество эмбрионов.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать качество эмбриона в программе ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием до начала овариальной стимуляции путем определения полиморфизма генов HLA II класса в лейкоцитах периферической крови.

Ранее указанный показатель использовался для прогнозирования риска развития ряда заболеваний, в патогенезе которых большое значение имеет аутоиммунный компонент. Имеются данные о значении определенных аллелей, генотипов и гаплотипов по системе HLA в формировании предрасположенности или резистентности к таким заболеваниям как инсулинозависимый сахарный диабет (Ахмедова Ш.У., Рахимова Д.А. Полиморфизм генов HLA II класса у больных инсулин-зависимым сахарный диабетом в узбекской популяции // Иммунология. - 2002. - № 5. - С.298-300.), анкилозирующий спондилит, ревматоидный артрит, болезнь Рейтера, рассеянный склероз, онкопатология (Коненков В.И. Медицинская и экологическая иммуногенетика. - Новосибирск, 1999. - 250 с.). Широко дискутируется проблема аллоиммунных отношений при беременности с учетом совместимости супругов и, соответственно, матери и плода по антигенам системы HLA (Иммунологическая загадка беременности / под ред. Н.Ю.Сотниковой. - Иваново: МИК, 2005. - 276 с.).

В настоящее время доказана ведущая роль цитоплазмы яйцеклетки в детерминации развития (Lei Li, Ping Zheng, Jurrien Dean. Maternal control of early mouse development // Development. - 2010. - Vol.137(6). - P.859-870). В незрелой яйцеклетке (ооците) экспрессируются практически все гены, и в цитоплазме ооцита накапливается большое количество материнских белков и мРНК, которые и управляют первыми этапами дробления зародыша. В этом заключается эффект материнской ооплазмы. Можно предположить, что наличие в генотипе женщины аллелей DQB1*06 и/или DRB1*13 ассоциировано с накоплением в цитоплазме ооцита тех белковых продуктов, которые обеспечивают нормальное течение процесса дробления, то есть являются своеобразными транскрипционными факторами, необходимыми для функциональной активности генов, определяющих высокое качество эмбриона.

По данным ряда авторов присутствие в генотипе человека аллелей DQB1*06 и/или DRB1*13 ассоциировано с более высокой точностью распознавания чужеродных антигенов клетками иммунной системы, что определяет у этих лиц, в частности, хороший противовирусный иммунитет (HIV controllers with HLA-DRB1*13 and HLA-DQB1*06 alleles have strong, polyfunctional mucosal CD4+T-cell responses / A.L.Ferre, P.W.Hunt, D.H.McConnell et all. // J Virol. - 2010. - Vol.84(21). -P.11020-11029; Association between human leukocyte antigen class II alleles and human papillomavirus-mediated cervical cancer in Indian women / I.Kohaar, S.Hussain, N.Thakur et all. / Hum Immunol. - 2009. - Vol.70(4). - P.222-229). Возможно в силу хорошей распознаваемости своих и чужеродных антигенов клетками иммунной системы при наличии указанных аллелей происходит меньшее повреждение ооцитов, что в дальнейшем способствует более высокому качеству эмбрионов.

Заявляемый нами способ осуществляется по стандартной методике следующим образом.

I. Забор крови для исследования.

Кровь у пациенток получают методом венепункции локтевой вены (объем 3 мл) в одноразовые пластиковые пробирки с консервантом. В качестве консерванта используют 0,5 М раствор ЭДТА в соотношении консервант:кровь - 1:10.

II. Выделение и очищение ДНК.

Выделение ДНК осуществляют из лейкоцитов периферической крови с использованием набора реактивов «Комплект реагентов для выделения ДНК из образцов крови» («ДНК-технология», Россия) по протоколу производителя.

III. Полимеразная цепная реакция и детекция продуктов амплификации.

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводят методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия). Приготовление реакционной смеси, программирование термоциклера и детекцию продуктов амплификации осуществляют по протоколу производителя («ДНК-технология», Россия). При выявлении носительства аллелей DQB1*06 и/или DRB1*13 прогнозируют высокое качество эмбрионов, а при отсутствии носительства аллелей DQB1*06 и DRB1*13 прогнозируют низкое качество эмбрионов.

Отличительные признаки способа. До начала овариальной стимуляции в лейкоцитах определяют полиморфизм генов HLA II класса и при выявлении носительства аллелей DQB1*06 и/или DRB1*13 прогнозируют высокое качество эмбрионов, а при отсутствии носительства аллелей DQBP1*06 и DRB1*13 прогнозируют низкое качество эмбрионов.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:

Пример 1. Больная Д., 32 года, проходила обследование и лечение в ФГУ «Ивановский НИИ Материнства и детства им. В.Н.Городкова» по поводу бесплодия трубно-перитонеального генеза. При анализе генов HLA II класса было определено гетерозиготное носительство аллеля DQB1*06, дан благоприятный прогноз. Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции получено 3 зрелых ооцита. В результате стандартной процедуры экстракорпорального оплодотворения было получено две полноценные зиготы с двумя пронуклеусами. На 2-е сутки после оплодотворения оба эмбриона состояли из двух бластомеров. На 3-и сутки один из эмбрионов состоял из 6 бластомеров, второй - из 4 бластомеров. Ни в одном из полученных эмбрионов не отмечалось вакуолизации или фрагментации цитоплазмы бластомеров (категория А). В тот же день был произведен перенос эмбрионов в полость матки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сутки после переноса эмбрионов сдана кровь для исследования содержания хорионического гонадотропина, которое показало, что лечение закончено наступлением беременности (197 мМ ед/мл, положительный результат).

Пример 2. Больная С, 30 лет, проходила обследование и лечение в ФГУ «Ивановский НИИ Материнства и детства им. В.Н.Городкова» по поводу бесплодия трубно-перитонеального генеза. При анализе генов HLA II класса было определено гетерозиготное носительство аллеля DRB1*13, дан благоприятный прогноз. Стимуляция суперовуляции проводилась по длинному протоколу. В результате трансвагинальной пункции было получено 2 ооцита, в том числе один зрелый. В результате стандартной процедуры экстракорпорального оплодотворения ооцита сформировалась зигота с двумя пронуклеусами. На 2-е сутки после оплодотворения эмбрион состоял из двух бластомеров. На 3-и сутки количество бластомеров составляло 4. Признаков вакуолизации или фрагментации цитоплазмы бластомеров не отмечалось (категория А). В тот же день был произведен перенос эмбриона в полость матки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сутки после переноса эмбриона сдана кровь для исследования содержания хорионического гонадотропина, которое показало, что лечение закончено наступлением беременности (341 мМ ед/мл, положительный результат).

Пример 3. Больная С, 35 лет, проходила обследование и лечение в ФГУ «Ивановский НИИ Материнства и детства им. В.Н.Городкова» по поводу бесплодия трубно-перитонеального генеза. При анализе генов HLA II класса было определено носительство аллелей DQB1*06 и DRB1*13, дан благоприятный прогноз. Стимуляция суперовуляции проводилась по длинному протоколу. В результате трансвагинальной пункции было получено 3 ооцита, все полученные ооциты были зрелыми. В результате стандартной процедуры экстракорпорального оплодотворения ооцитов сформировались 3 зиготы с двумя пронуклеусами. На 2-е сутки после оплодотворения эмбрионы состояли из двух бластомеров. На 3-и сутки два эмбриона состояли из 4 бластомеров, один - из 6 бластомеров. Ни в одном из полученных эмбрионов не отмечалось вакуолизации или фрагментации цитоплазмы бластомеров (категория А). В тот же день был произведен перенос эмбрионов в полость матки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сутки после переноса эмбрионов сдана кровь для исследования содержания хорионического гонадотропина, которое показало, что лечение закончено наступлением беременности (226 мМ ед/мл, положительный результат).

Пример 4. Больная Ф., 36 лет, проходила обследование и лечение в ФГУ «Ивановский НИИ Материнства и детства им. В.Н.Городкова» по поводу бесплодия трубно-перитонеального генеза. При анализе генов HLA II класса носительства аллелей DQB1*06 и DRB1*13 выявлено не было, дан прогноз на низкое качество эмбрионов. Стимуляция суперовуляции проводилась по длинному протоколу. В результате трансвагинальной пункции было получено 8 ооцитов, 6 ооцитов были зрелыми. В результате стандартной процедуры экстракорпорального оплодотворения ооцитов сформировались 4 зиготы с двумя пронуклеусами. 3 эмбриона вступили в фазу дробления. На 2-е сутки после оплодотворения эмбрионы состояли из двух бластомеров. На 3-и сутки два эмбриона состояли из 4 бластомеров, один - из 6 бластомеров. В двух эмбрионах отмечались существенные морфологические дефекты: вакуолизация цитоплазмы бластомеров (категория С и D), один эмбрион соответствовал категории В по качеству. Перенос эмбрионов в полость матки произведен на 3-и сутки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сутки после переноса эмбрионов сдана кровь для исследования содержания хорионического гонадотропина: 7,2 мМ ед/мл - отрицательный результат (беременность не наступила).

Клиническая апробация способа дала следующие результаты.

Показатель	Количество
Всего обследовано	62
Истинно-положительный результат	23
Ложно-положительный результат	4
Истинно-отрицательный результат	28
Ложно-отрицательный результат	7

Чувствительность метода: 76,7%

Специфичность метода: 87,5%

Точность метода: 82,3%

Преимущества заявляемого метода:

1. Способ может быть использован для прогнозирования качества эмбрионов при использовании различных протоколов овариальной стимуляции у женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором.

2. Прогнозирование качества эмбрионов указанным способом осуществляется до начала овариальной стимуляции, что дает возможность своевременно скорректировать тактику ведения пациентки.

3. Так как метод основан на оценке полиморфизма генов, исследование проводится один раз в жизни.

4. Высокая точность - 82,3%, специфичность - 87,5% и чувствительность - 76,7%.