способ выделения и органо-типической консервации аллогенного лимбального трансплантата

Формула изобретения

1. Способ предоперационной подготовки аллогенного лимбального трансплантата для пересадки пациентам с лимбальной клеточной недостаточностью, включающий хирургическое выделение лимбальных трансплантатов из трупных донорских глаз, органо-типическую консервацию в течение 28 суток в среде, содержащей инсулин, дексаметазон, сыворотку крови, антибиотик, с заменой среды каждые 3 дня, отмывание, отличающийся тем, что хирургическое выделение лимбальных трансплантатов проводят в ранние сроки после смерти донора, из цельного трупного донорского глазного яблока, исключая его перфорацию, органо-типическую консервацию проводят при температуре 37°C, а среда для органо-типической консервации дополнительно содержит декстран 40000, хепес одномолярный, 7,5%-ный раствор бикарбоната, 40%-ный раствор глюкозы, L-глутамин, амфотерицин В, среду 199 на солях Хенкса, а в качестве антибиотика содержит пенициллин и стрептомицин при следующем соотношении компонентов на 1000 мл раствора:

декстран 40000	50,0 г
хепес одномолярный	15,0 мл
7,5%-ный раствор бикарбоната	10,0 мл
40%-ный раствор глюкозы	5,0 мл
L-глутамин	1,5 г
пенициллин	250000 единиц
стрептомицин	200,0 мг
амфотерицин В	1,4 мг
инсулин «Хумулин регулар»	0,8 мл
дексаметазон с молярностью 10-8	1,0 мл
сыворотка крови человека
или крупного рогатого скота	100,0 мл
среда 199 на солях Хенкса	остальное,

при этом отмывание производят средой, содержащей все вышеперечисленные компоненты, кроме сыворотки крови.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сыворотки крови может быть использована фетальная бычья сыворотка или человеческая сыворотка пуповинной крови или человеческая сыворотка IV группы крови.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к офтальмологии и может быть использовано при хирургическом лечении пациентов с синдромом лимбальной клеточной недостаточности (ЛКН) различной этиологии.

На сегодняшний день все предлагаемые методы лечения ЛКН делятся на две основные группы.

1. Цитотерапия культивированными лимбальными эпителиальными клетками на различных носителях. В качестве носителя могут выступать: амниотическая мембрана [Grueterich M., Scheffer С., Tseng G. Human Limbal Progenitor Cells Expanded on Intact Amniotic Membrane Ex Vivo // Arch Ophthalmol. 2002; 120:783-790; Koizumi N., Cooper L.J., Fullwood N.J. et al. An evaluation of cultivated corneal limbal epithelial cells, using cell-suspension culture Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. 43(7):2114-21], фибриновый субстрат [Sudha В., Madhavan H.N., Sitalakshmi G. et al. Cultivation of human corneal limbal stem cells in Mebiol gel-A thermo-reversible gelation polymer // Indian. J. Med. Res. 2006. Dec; 124(6):655-64] и мягкая гидрогелевая контактная линза [Sangwan V.S. Limbal stem cells in health and disease // BioSci. Rep. 2001. Vol.21. P.385-405].

Недостатком этого способа является техническая сложность и дороговизна выполнения, а также необходимость использования фидерного слоя при культивировании.

2. Лимбальная трансплантация [Kenyon K.R., Tseng S.C. // Ophthalmology. - 1989. - Vol.96. N5. - P.709-722].

Известен способ аутотрансплантации лимбального лоскута, взятого со здорового билатерального глаза реципиента [патент № 2348384 от 10.03.2009].

Недостатком данного способа является невозможность иссечения достаточно большого участка лимба, а также несогласие многих пациентов на такую процедуру.

Известен способ аллогенной трансплантации «свежих» лимбальных лоскутов, выделенных из трупных донорских глаз, поступивших в офтальмологические учреждения, занимающиеся пересадкой роговицы [Dua HS, Blanco AA. Allolimbal transplantation in patients with limbal stem cell defi ciency // Br J Opthalmol., 1999. 83: 414-19; Патент РФ № 2361550 от 20.07.2009].

Недостатком этого метода является высокий риск отторжения трансплантата вследствие содержания в нем большого количества клеток Лангерганса, экспрессирующих HLA-DR-антигены, что создает необходимость в длительной иммуносупрессивной терапии.

Наиболее близким аналогом является способ выделения и органо-типического культивирования лимбальных трансплантатов, описанный в публикации Zito-Abbad E, Borderie VM, Baudrimont M et al. Corneal epithelial cultures generated from organ-cultured limbal tissue: factors influencing epithelial cell growth // Curr Eye Res. 2006 May; 31(5): 391-9.

Способ заключается в том, что органо-типическому культивированию подвергаются корнеосклеральные кольца, оставшиеся после изъятия роговичного трансплантата для сквозной или послойной кератопластики, включающий: обработку 0,05%-ным раствором трипсина в течение 1 часа и диспазой II (1,2 U/ml) в течение 15 минут при 37°C, дальнейшее культивирование с использованием фидерного слоя человеческих кератоцитов в среде DMEM/F12 (Dulbecco s Modified Eagle s Medium Nutrient Mixture F-12 НАМ), с добавлением фетальной бычьей сыворотки, инсулина, дексаметазона, холерного токсина, гентамицина в течение 28 дней в CO₂-инкубаторе при температуре 31°C, с 5%-ным содержанием CO₂ и 99% влажности, с заменой среды через каждые 3 дня. Преимуществом данного способа является снижение экспрессии HLA-DR-антигенов за счет естественной элиминации клеток Лангерганса из лимбального трансплантата вследствие длительного (28 дней) органо-типического культивирования [Holland E.J, DeRuyter D.N., Doughman D.J. Langerhans cells in organ-cultured corneas // Arch Ophthalmol 1987; 105: 542-5].

Однако описанный способ имеет ряд недостатков:

- для органо-типического культивирования используются донорские корнеосклеральные кольца, после изъятия роговичного трансплантата, в связи с этим длительность временного интервала от смерти донора до выкраивания лимбальных трансплантатов составляет не менее 72 часов, что неблагоприятно сказывается на выживаемости и пролиферативной активности лимбальных эпителиальных стволовых клеток;

- необходимость использования специальных приспособлений для выкраивания лимбальных аллотрансплантатов, а также невозможность сформировать лимбальный трансплантат равномерной толщины и необходимой формы с помощью ножей-расслаивателей из корнесклеральных колец;

- используемая во время обработки корнеосклерального кольца высокая концентрация ферментов (трипсина и диспазы II) приводит к большой потере лимбальных эпителиальных клеток (Фигура 1, 2).

- культивирование при 31°C способствует пролиферации только эпителиальных клеток лимба, что приводит к необходимости использовать при культивировании фидерный слой (Фигура 3).

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа предоперационной подготовки (хирургического выделения и органо-типической консервации) аллогенного лимбального трансплантата для пересадки пациентам с ЛКН.

Техническим результатом является достижение стабильной, длительной эпителизации, восстановление дефектов стромы и профилактика конъюнктивизации роговицы при лимбальной клеточной недостаточности.

Технический результат достигается тем, что в способе предоперационной подготовки аллогенного лимбального трансплантата для пересадки пациентам с лимбальной клеточной недостаточностью, включающем хирургическое выделение лимбальных трансплантатов из трупных донорских глаз, органо-типическую консервацию в течение 28 суток в среде, содержащей инсулин, дексаметазон, сыворотку, антибиотики, с заменой среды каждые 3 дня, отмывание, согласно изобретению хирургическое выделение лимбальных трансплантатов проводят из цельного трупного донорского глазного яблока, исключая его перфорацию, органо-типическую консервацию проводят при температуре 37°C, а среда для органо-типической консервации дополнительно содержит декстран 40000, хепес одномолярный, 7,5%-ный раствор бикарбоната, 40%-ный раствор глюкозы, L-глутамин, амфотерицин В и среду 199 на солях Хенкса, а в качестве антибиотика содержит пенициллин и стрептомицин при следующем соотношении компонентов на 1000 мл раствора:

декстран 40000	50,0 г
хепес одномолярный	15,0 мл
7,5%-ный раствор бикарбоната	10,0 мл
40%-ный раствор глюкозы	5,0 мл
L-глутамин	1,5 г
пенициллин	250000 единиц
стрептомицин	200,0 мг
амфотерицин В	1,4 мг
инсулин «Хумулин регулар»	0,8 мл
дексаметазон с молярностью 10-8	1,0 мл
сыворотка крови человека
или крупного рогатого скота	100,0 мл
среда 199 на солях Хенкса	остальное

при этом отмывание от сыворотки производят заявленной средой, не содержащей сыворотки.

В качестве сыворотки может быть использована фетальная бычья сыворотка или человеческая сыворотка пуповинной крови или человеческая сыворотка IV группы крови.

Каталожный номер среды 199 на солях Хенкса - С230 ООО «ПанЭко».

Достоинством способа является возможность забора лимбального трансплантата в ранние сроки после смерти донора, составляющие не более 18 часов, что способствует сохранению резервов жизнеспособности клеток (Фигура 4).

Преимуществом способа является техническая простота выкраивания лимбального трансплантата со всей окружности лимба цельного трупного донорского глаза, при этом достигается равномерная толщина трансплантата, не более ½ толщины склеры, что исключает перфорацию донорского глазного яблока, для возможности выполнения последующего выкраивания корнеосклерального диска, его консервации и проведения плановой сквозной или послойной кератопластики.

Предложенный способ органо-типической консервации лимбальных трансплантатов позволяет сохранить естественное микроокружение лимбальных эпителиальных прогениторных клеток, а именно мезенхимальные стволовые клетки, которые благодаря своим паракринным свойствам выполняют функцию фидерного слоя.

Сохранение структуры лимбального трансплантата с жизнеспособными, пролиферирующими прогениторными клетками в процессе осуществления способа дает возможность дальнейшей криоконсервации лимбальных трансплантатов и длительного хранения их в жидком азоте при температуре -196° для создания Банка лимбальных трансплантатов (Фигура 5, 6).

Способ осуществляется следующим образом. Из трупного глазного яблока, подготовленного для забора донорской роговицы по медицинской технологии «Алгоритм заготовки трупных донорских роговиц человека для трансплантации» (ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова») в условиях стерильного бокса, после деэпителизации роговицы и удаления бульбарной конъюнктивы со всей поверхности, алмазным или металлическим лезвием производятся 2 круговых надреза: один - склеры, отступая на 2 мм от прозрачной части роговицы на глубину 0,5 мм; другой - по границе между лимбальной и прозрачной зонами роговицы. Далее на ту же глубину, перпендикулярно выполненному разрезу, в сторону роговицы производятся 4 надреза на 3, 6, 9 и 12 часах, затем ножом-расслаивателем отсепаровывается слой ткани на заданной глубине, придерживая образующиеся лоскуты роговичным пинцетом, в результате получаются лимбальные трансплантаты, представляющие собой полоску ткани шириной 2 мм и толщиной 0,5 мм по всей длине (Фигура 7, 8, 9).

Полученные лимбальные трансплантаты помещаются в стерильный флакон объемом 25 см² и заливаются 4 мл среды для органо-типической консервации, которая может быть получена смешиванием компонентов согласно формуле изобретения или может быть получена из «Раствора для хранения роговицы» (ТУ № 9398-013-29039336-2008, производимого ООО НЭП «Микрохирургия глаза» Москва, Бескудниковский бульвар, дом 59А), включающего декстран, хепес, бикарбонат, глюкозу, L-глутамин, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В и среду 199 на солях Хенкса, в который дополнительно добавлены инсулин, дексаметазон и сыворотка крови человека или крупного рогатого скота, при соотношении компонентов на 1000 мл раствора: декстран 40000 - 50,0 г, хепес одномолярный - 15,0 мл, 7,5%-ный раствор бикарбоната - 10,0 мл, 40%-ный раствор глюкозы - 5,0 мл, L-глутамин - 1,5 г, пенициллин - 250000 единиц, стрептомицин - 200,0 мг, амфотерицин В - 1,4 мг, инсулин «Хумулин регулар» - 0,8 мл, дексаметазон с молярностью 10^-8 - 1,0 мл, сыворотка крови человека или крупного рогатого скота - 100,0 мл, среда 199 на солях Хенкса - остальное.

Консервацию осуществляют в течение 28 дней при 37°C путем инкубации в атмосфере воздуха с 5% CO₂ при 99% влажности. Замена консервационной среды осуществляется каждые 3 дня. Перед использованием лимбальный трансплантат отмывают в среде такого же состава, но свободной от сыворотки, а именно при соотношении компонентов на 1000 мл раствора: декстран 40000 - 50,0 г, хепес одномолярный - 15,0 мл, 7,5%-ный раствор бикарбоната - 10,0 мл, 40%-ный раствор глюкозы - 5,0 мл, L-глутамин - 1,5 г, пенициллин - 250000 единиц, стрептомицин - 200,0 мг, амфотерицин В - 1,4 мг, инсулин «Хумулин регулар» - 0,8 мл, дексаметазон с молярностью 10^-8 - 1,0 мл, среда 199 на солях Хенкса - остальное.

Затем лимбальный трансплантат переносят в стерильную пробирку со средой такого же состава, в которой отмывали, то есть свободной от сыворотки крови и в термосумке при температуре 4-6°C доставляют в операционную.

Пример. Больная К., 54 лет.

Диагноз: Хроническая рецидивирующая эрозия роговицы обоих глаз.

Anamnesis morbi: страдает в течение 5 лет, получает консервативную терапию.

Anamnesis vitae: 6 лет назад проводилась лучевая и химиотерапия по поводу опухоли молочной железы.

Status localis: острота зрения обоих глаз (OU) 0,1 не коррегирует.

OU - светобоязнь, в центре роговица деэпителизирована.

Под лимбальную конъюнктиву в верхнем сегменте правого глаза произведена пересадка подготовленного по предложенному способу лимбального трансплантата, при этом в качестве сыворотки крови использована человеческая сыворотка IV группы крови.

Операция и послеоперационный период протекали без осложнений, была назначена стандартная локальная иммуносупрессивная терапия. После операции на 7-е сутки отмечалась полная эпителизация роговицы. Через месяц проведена аналогичная операция на левом глазу. При контрольных осмотрах на протяжении всего периода наблюдения (6 месяцев) признаков отторжения лимбальных трансплантатов не отмечалось, роговица эпителизирована полностью, прозрачная, острота зрения обоих глаз 0,6 с коррекцией sph+1,0D=0,9.

Таким образом, предлагаемый способ подготовки (хирургического выделения и органо-типической консервации) аллогенных лимбальных трансплантатов позволяет добиться стабильной и длительной эпителизации роговицы у пациентов с лимбальной клеточной недостаточностью.