ранозаживляющее средство
Классы МПК: | A61K36/71 Ranunculaceae (семейство лютиковых), например живокость, печеночница, желтокорень канадский, водосбор или золотая печать A61K31/015 карбоциклические A61P17/02 для обработки ран, язв, ожогов, шрамов, келоидов или подобных заболеваний |
Автор(ы): | Зюзьков Глеб Николаевич (RU), Поветьева Татьяна Николаевна (RU), Семенов Аркадий Алексеевич (RU), Жданов Вадим Вадимович (RU), Крапивин Александр Владимирович (RU), Нестерова Юлия Владимировна (RU), Суслов Николай Иннокентьевич (RU), Фомина Татьяна Ивановна (RU), Дыгай Александр Михайлович (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ фармакологии" СО РАМН) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-02-27 публикация патента:
20.02.2013 |
Изобретение относится к фармацевтике, а именно к ранозаживляющим средствам. Предлагается применение напеллина в качестве ранозаживляющего средства. Напеллин эффективен в качестве ранозаживляющего средства. 5 табл., 1 пр.
Формула изобретения
Применение напеллина в качестве ранозаживляющего средства.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям.
Высокая частота встречаемости травматических повреждений поверхностных тканей является основанием для разработки высокоэффективных ранозаживляющих средств.
Известно большое количество препаратов, гелей и мазей, обладающих способностью стимулировать процесс заживления ран (на основе метилурацила, солкосерила, облепихового масла и др.) [1, 2].
Недостатком данных средств является зачастую их недостаточная эффективность [2].
Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала высокоэффективных ранозаживляющих средств.
Поставленная задача достигается применением напеллина в качестве ранозаживляющего средства.
Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве ранозаживляющего средства напеллина.
Используемое оригинальное средство напеллин было разработано и получено ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г. Томск) совместно с Национальным исследовательским Иркутским Государственным Техническим Университетом (г. Иркутск) и представляло собой 0,00025% водный раствор данного алкалоида. Напеллин извлекался из растительного сырья (травы растений семейства лютиковых) в виде свободных оснований экстракцией стандартным методом [3].
Интенсивность репаративной регенерации зависит от большого количества факторов: состояния иммунной системы, микроциркуляторного русла, функциональных возможностей клеток стромы кожи и др. [4]. При этом важная роль в процессе заживления больших дефектов тканей в последнее время отводится реализации ростового потенциала прогениторных, в том числе стволовых (СК), клеток [4, 5]. При этом существует фармакологическая стратегия регенеративной медицины, заключающаяся в стимуляции функций эндогенных СК. Причем активация последних может являться следствием как прямого воздействия фармакологических агентов на прогениторные элементы, так результатом стимуляции клеток микроокружения тканей, опосредованно определяющих ускоренное течение репаративных процессов [5].
Ранее нами было показано ускорение заживления ран кожи комплексными экстрактами и алкалоидной фракцией живокости высокой [6]. При этом максимальный ранозаживляющий эффект наблюдался при использовании суммы алкалоидов, среди которых доминирующим является элатин [7]. В то же время с помощью метода тонкослойной хроматографии в алкалоидной фракции было установлено содержание других алкалоидов, в том числе напеллина. Напеллин (C22H33NO3),
представляет собой гетероциклическое азотсодержащее органическое соединение растительного происхождения. Чаще всего его извлекают из растений рода Аконит, хотя он встречается и в других растениях [6, 8]. При этом влияние напеллина на процессы регенерации тканей не изучено. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.
Факт применения напеллина с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции процесса заживления ран, для специалиста не является очевидным.
Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.
Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Эксперименты были проведены на 76 беспородных мышах-самцах. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.
Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005).
Пример 1
Фармакологические свойства средства изучали на модели плоскостной кожной раны [9]. На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали.
Предлагаемое средство получали из травы аконита байкальского и живокости высокой. Надземная часть растений, собранная в период цветения в Иркутской области, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и подвергалась непрерывной экстракции хлороформом в течение 5 суток. Хлороформный экстракт упаривали до небольшого объема и тщательно экстрагировали 5% серной кислотой. Кислотную вытяжку подщелачивали карбонатом натрия до рН 9-10 и последовательно экстрагировали сначала эфиром, затем хлороформом. Эфирный экстракт упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве эфира и хроматографировали на дезактивированной окиси алюминия в системе гексан-ацетон (90 50%). Эфирорастворимую фракцию подвергли дробной экстракции буферными растворами с увеличивающимися значениями рН. Эфирный раствор, оставшийся после экстракции наиболее щелочным буфером, упаривали досуха и хроматографировали на окиси алюминия в системе гексан-метанол с элюцией напеллина. Вещество растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 0,00025%.
Полученное средство применяли наружно, начиная с первого дня после моделирования раны, ежедневно в течение всего периода заживления. Раствор наносили в объеме 50 мкл. В качестве средств сравнения использовали гель «Солкосерил» (Ай Си Эн Швейцария АГ, Швейцария) и «Облепиховое масло» (ОАО Нижфарм, Россия), которые применяли по той же схеме и в эквивалентном количестве, что и раствор напеллина.
Критериями ранозаживляющего действия служили средний диаметр раны и результаты гистологического исследования биоптатов кожи мышей, полученных на 15-е сутки из края раневого дефекта. Биопсийные образцы раневого дефекта кожи окрашивали гематоксилин-эозином. В каждом препарате оценивали: рельеф регенерата кожи, степень и характер инфильтрации, наличие и выраженность отека, количество новообразованных сосудов, волосяных фолликулов и потовых желез. Изучали такие патоморфологические процессы, как акантоз, гиперкератоз, дискератоз [10]. На 3-и и 5-е сут методом клонирования определяли содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в раневой поверхности [11], а также методом колониеобразования в тест-системе изучали продукцию гуморальных факторов стромальными клетками кожи (колониеобразующую активность супернатантов адгезирующих клеток с раневой поверхности в отношении КОЕ-Ф костного мозга) [11]. Кроме того, изучали прямое влияние напеллина на КОЕ-Ф. Для этого его вносили в культуру миелокариоцитов в концентрации 50 нМ, после чего на 7-е сут подсчитывали количество колоний [11]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.
Использование напеллина способствовало значительному ускорению процессов регенерации. Заживление дефекта в данном случае наблюдалось к 14 сут опыта, в то время как при применении средств сравнения таковое отмечалось лишь к 16 сут. Кроме того, при нанесении напеллина на раневую поверхность существенно ниже, чем в группе контроля, был и диаметр раны (таблица 1).
При этом анализ морфологических процессов, протекающих в области раневого дефекта кожи мышей, показал, что в контрольной группе имело место формирование неполноценного регенерата. В подавляющем большинстве случаев поверхностный эпителий наблюдался не на всем протяжении, встречались небольшие участки отслойки эпидермиса от дермы с наличием субэпидермальных щелей, отмечалось резкое утолщение эпителиального пласта с нечеткой дифференцировкой слоев и увеличение количества базального, зернистого и рогового слоев. Внутриэпителиально обнаруживались нейтрофильные лейкоциты с формированием микроабсцессов, наблюдались слабовыраженные явления акантоза, гипер- и дискератоза. Подлежащая ткань была представлена созревающими грануляциями с умеренной гистиоцитарно-лейкоцитарной инфильтрацией, явлением отека и очагами кровоизлияний в верхних слоях дермы. Во всех образцах в прилежащей к зоне дефекта ткани отмечается малое количество волосяных фолликулов и потовых желез. Регенерат кожи у животных контрольной группы характеризовался умеренным воспалением, что привело к усиленной пролиферации эпителия, для которой характерны атипические разрастания и изменения эпителия в виде акантоза, гипер- и дискератоза. Изучение гистоструктуры раневого дефекта в группе животных, получавших терапию напеллином, показало практически во всех случаях формирование полноценного соединительно-тканного рубца, покрытого эпителием. В остальных образцах (группы сравнения) эпителиальный слой был резко неравномерный, с утолщением в зоне дефекта за счет клеток базального слоя. Подлежащая ткань - грануляционная, местами с очаговой умеренной нейтрофильной инфильтрацией. В области, прилежащей к дефекту, во всех образцах ткани отмечалось умеренное количество волосяных фолликулов и потовых желез. При этом количество животных, у которых произошла полная эпителизация при использовании предлагаемого средства, было достоверно выше, чем в контроле (таблица 2).
Исследование механизмов регенеративной активности данного средства выявило ряд уникальных феноменов. Так, напеллин оказывал значительное стимулирующее влияние в отношении мезенхимальных клеток-предшественников раневой поверхности (таблица 3). Причем возрастание данного показателя наблюдалось на фоне повышения продукции ростовых факторов стромальными клетками кожи (таблица 4). В то же время было выявлено и выраженное прямое влияние данного алкалоида на прогениторные клетки. Внесение напеллина в культуру миелокариоцитов сопровождалось значительным увеличением выхода в метилцеллюлозной среде числа КОЕ-Ф (таблица 5). Изучение влияния средств сравнения на данные параметры не выявило статистически значимых изменений их динамики (таблица 3-5).
Полученные результаты свидетельствуют о выраженной ранозаживляющей активности напеллина, связанной с активацией популяции мезенхимальных клеток-предшественников, содержащих в своем составе не только стромальные прекурсоры, но и истинные (мультипотентные) СК, способные дифференцироваться в эпителиоциты [12].
Таблица 1 | ||||
Динамика среднего диаметра ран, в см (Х±m) | ||||
Сроки исследования сутки | Контроль | Напеллин | Солкосерил | Облепиховое масло |
1 | 1,09±0,01 | 1,08±0,04 | 1,06±0,03 | 1,03±0,02 |
3 | 0,98±0,02 | 0,92±0,03 | 1,0±0,02 | 0,92±0,04 |
5 | 0,9±0,02 | 0,79±0,02* | 0,78±0,03* | 0,9±0,03 |
7 | 0,76±0,03 | 0,66±0,02* | 0,73±0,02 | 0,67±0,02* |
9 | 0,57±0,02 | 0,51±0,01* | 0,51±0,01* | 0,54±0,03 |
12 | 0,28±0,03 | 0,16±0,05* | 0,21±0,01* | 0,2±0,01* |
14 | 0,1±0,03 | 0,0±0,0 | 0,07±0,01 | 0,06±0,02 |
16 | 0,06±0,03 | 0,0±0,0 | 0,0±0,0 | 0,0±0,0 |
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05 |
Таблица 2 | |||
Доля животных с полной эпителизацией места дефекта кожи, в % (Х±m) | |||
Контроль | Напеллин | Солкосерил | Облепиховое масло |
4,6±0,9 | 86,8±5,9* | 56,4±10,3* | 51,7±9,4* |
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05 |
Таблица 3 | ||||
Содержание мезенхимальных клеток-предшественников в раневой поверхности, на 2,5×105 нуклеаров, (Х±m) | ||||
Сроки исследования сутки | Контроль | Напеллин | Солкосерил | Облепиховое масло |
3 | 0,67±0,21 | 3,0±0,37* | 0,7±0,3 | 0,65±0,19 |
5 | 1,17±0,3 | 2,67±0,33* | 1,0±0,22 | 0,92±0,43 |
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05 |
Таблица 4 | ||||
Колониестимулирующая активность супернатантов стромальных клеток кожи, в усл. Ед×105, (Х±m) | ||||
Сроки исследования сутки | Контроль | Напеллин | Солкосерил | Облепиховое масло |
3 | 8,08±0,57 | 12,1±0,95* | 11,3±2,42 | 7,65±0,78 |
5 | 0,17±0,11 | 2,83±0,34* | 1,0±0,57 | 0,19±0,03 |
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05 |
Таблица 5 | |||
Число КОЕ-Ф в культуре клеток костного мозга при добавлении стимуляторов регенерации, на 2,5×105 миелокариоцитов, (X±m) | |||
Контроль | Напеллин | Солкосерил | Облепиховое масло |
12,25±0,85 | 19,75±0,85* | 13,7±0,64 | 10,32±0,79 |
* - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05 |
Литература
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: ОО «Изд-во Новая Волна», 2008. - 1206 с.
2. Котельников В.П. Раны и их лечение. - М.: Знание. 1991. - 123 с.
3. Погодаева Н.Н., Жапова Ц., Верещагин А.Л., Горшков А.Г., Семенов А.А. / Изучение алкалоидного состава некоторых видов сибирских аконитов. // Раст. ресурсы, вып.2, 2000 г., С.79-84.
4. Бабаева А.Г. Регенерация: факты и перспективы. - М.: Изд-во РАМН, 2009. - 336 с.
5. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы. // Наука в России. - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - № 1. С.4-8.
6. Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Нагорняк Ю.Г., Перова А.В., Андреева Т.И., Рослякова Е.П., Суслов Н.И. Механизмы влияния комплексных и выделенных веществ на репаративную активность тканей в эксперименте. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т.72, № 3. - С.40-43.
7. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: Учебник 3-е изд. - М.: Медицина, 2002.
8. Осадчий С.А., Ганбаатар Ж., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Алкалоиды сибирских видов живокости и аконита и их превращения. // Материалы Первой Международной конференции "Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов" (том 1), Москва, 9-12 октября 2001 г.
9. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.
10. Микроскопическая техника. / Под ред. Д.С.Саркисова. М., 1996.
11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992.
12. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: Изд-во: ООО «Печатная мануфактура», 2011. - 149 с.
Класс A61K36/71 Ranunculaceae (семейство лютиковых), например живокость, печеночница, желтокорень канадский, водосбор или золотая печать
Класс A61K31/015 карбоциклические
Класс A61P17/02 для обработки ран, язв, ожогов, шрамов, келоидов или подобных заболеваний