способ получения полимерного цемента медицинского назначения

Формула изобретения

1. Способ получения полимерного цемента медицинского назначения, включающий смешивание рецептурного количества порошкообразного полимера, жидкого мономера, антибактериального компонента и перемешивание смеси, отличающийся тем, что в качестве антибактериального компонента используют раствор, содержащий бактериофаг или смесь из нескольких различных бактериофагов, обладающих литической активностью, в концентрации не менее 10⁶ БОЕ/мл, в количестве 5,0-6,5 мас.%, при этом антибактериальный компонент вносят в цемент после охлаждения смеси до температуры 4-10°С.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве порошкообразного полимера и жидкого мономера используют любые коммерчески доступные компоненты, разрешенные к применению в медицине.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве бактериофага(ов), обладающего литической активностью, используют бактериофаг(и) против бактерий рода Pseudomonas, Staphylococcus, Bacillus.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют бактериофаг или смесь из нескольких различных бактериофагов, обладающих литической активностью, индивидуально подобранные для конкретного патогена, для чего предварительно проводят типирование возбудителя инфекционного процесса бактериальной этиологии у конкретного пациента.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения полимерного цемента, обладающего антибактериальными свойствами, используемого при эндопротезировании, фиксации отломков кости, для замещения отсутствующей костной ткани, а также в челюстно-лицевой хирургии, пластической хирургии и стоматологии.

Известен способ получения полимерного цемента, включающий смешивание рецептурного количества порошкообразного полимера, жидкого мономера с добавлением антибиотика гентамицин гидрохлорида, либо гентамицин сульфата (патент US 4059684, оп. 22.11.1977). Получаемый известным способом полимерный цемент предназначен для формирования костноподобных структур искусственного происхождения произвольной формы и одновременной профилактики развития инфекционного процесса в зоне контакта между полимерным цементом в зоне контакта «цемент-кость» за счет присутствия антибиотика в составе композиции изделия.

Недостатком известного способа является низкое качество целевого продукта, а именно низкие антибактериальные свойства, связанные с наличием в составе полимерного цемента антибиотика гентамицин гидрохлорида либо гентамицин сульфата, который в современных условиях может оказаться неэффективным ввиду целого ряда факторов, включающих в себя эмиссию антибиотика в окружающие ткани и устойчивость микроорганизмов к конкретному антибиотику.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения полимерного цемента, включающий смешивание порошкообразного полимера и жидкого мономера с добавлением антибиотика гентамицин гидрохлорида в количестве 0,5-1,0 мас.% от общего количества компонентов композиции (патент RU 2195320, оп. 27.12.2002).

Недостатком известного способа является низкое качество целевого продукта, обусловленное следующими причинами:

1) Отсутствие диффузии антибиотика в ткани при хорошо гомогенизированном цементе ввиду отсутствия пор в структуре полимерного цемента (A.S.Baker, L.W.Greenham. Release of gentamicin from acrylic bone cement. Elution and diffusion studies. J. Bone Joint Surg. Am. 1988; 70: 1551-1557).

2) Недостаточная эффективность используемых антибиотиков в случае наличия резистентной к ним микробиоты либо низкая концентрация импрегнированного в цемент антибиотика или ее нелинейное снижение с течением времени, что может привести к формированию резистентных штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

3) Необходимость увеличения концентрации антибиотика при неэффективности элиминации патогенной микробиоты, что ведет к нарушению гомогенности структуры цемента и ухудшению его прочностных свойств.

4) Возможность токсических побочных явлений, связанных с наличием в составе полимерного цемента импрегнированного антибиотика, в частности гентамицина.

5) При наличии аллергических реакций на конкретный антибиотик, входящий в состав цемента, невозможно быстрое удаление аллергена из макроорганизма.

Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет повышения антибактериальных свойств полимерного цемента.

Техническим результатом решения поставленной задачи является обеспечение возможности получения полимерного цемента, обладающего повышенной антибактериальной активностью в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, ответственных за развитие инфекционно-воспалительного процесса в месте имплантации изделия из цемента.

Поставленная задача достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.

Смешивают коммерчески доступные и разрешенные для медицинского применения компоненты композиции полимерного цемента, включающие порошкообразный полимер и жидкий мономер, смесь перемешивают, охлаждают для снижения теплового выхода экзотермической реакции полимеризации до температуры 4-10°С и добавляют раствор, содержащий бактериофаг или смесь из нескольких различных бактериофагов, обладающих литической активностью против возбудителя(ей) инфекционного процесса бактериальной этиологии с концентрацией частиц бактериофага, равной не менее 10⁶ БОЕ/мл (бляшкообразующие единицы на миллилитр) в количестве 5,0-6,5 мас.%. Далее полимерный цемент повторно перемешивают и придают нужную форму изделию.

В преимущественном варианте, проводят подбор специфического бактериофага(ов), для чего предварительно осуществляют типирование (определение) возбудителя инфекционного процесса бактериальной этиологии у конкретного больного путем культивирования микроорганизма(ов), полученного из взятого у пациента образца биоматериала, с тестируемым набором бактериофагов.

В частном случае, используют заранее подготовленный бактериофаг или смесь из нескольких различных штаммов бактериофагов, проявляющих свою активность в отношении наиболее частых возбудителей инфекционных процессов в месте имплантации изделий из полимерного цемента, таких как бактерии рода Pseudomonas, Staphylococcus и Bacillus. При этом используют либо коммерчески доступный бактериофаг(и), либо бактериофаг(и), находящийся (депонированный) в доступных коллекциях микроорганизмов.

Сырьем для антибактериального компонента служат фаголизаты микробных культур, подвергнутые стерилизации мембранной фильтрацией через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

В результате получают полимерный цемент медицинского назначения с размерами микропор порядка 100-200 нм, обладающий антибактериальной активностью в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, ответственных за развитие инфекционно-воспалительного процесса в месте имплантации изделия, либо системы медицинского назначения. Приготовленный полимерный цемент может храниться в течение 10 дней при температуре 6-10°С без потери антибактериальной активности.

Определяющими отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются:

1. В качестве антибактериального компонента в цемент добавляют раствор, содержащий бактериофаг или смесь из нескольких различных бактериофагов, обладающих литической активностью против возбудителя(ей) инфекционного процесса бактериальной этиологии с концентрацией частиц бактериофага, равной не менее 10⁶ БОЕ/мл в количестве 5,0-6,5 мас.%, что позволяет получить полимерный цемент с повышенными антибактериальными свойствами, одновременно обладающий такими качествами, как отсутствие аллергических реакций на бактериофаг, прекращение действия бактериофага после лизиса патогенных бактерий с последующей самостоятельной элиминацией из макроорганизма.

2. Раствор, содержащий бактериофаг или смесь из нескольких различных бактериофагов, обладающих литической активностью, вносят в реакционную смесь после ее охлаждения до 4-10°С, что позволяет понизить температуру экзотермической реакции полимеризации с 110-120°С до 45-50°С и исключить инактивацию активности бактериофага(ов) против возбудителя(ей) инфекционного процесса.

3. В качестве бактериофага(ов), обладающего литической активностью, используют бактериофаг(и) против бактерий рода Pseudomonas, Staphylococcus или Bacillus, что позволяет расширить спектр и специфичность действия используемого бактериофага(ов).

4. Преимущественно используют бактериофаг или смесь из нескольких различных бактериофагов, обладающих литической активностью, индивидуально подобранный для конкретного патогена, для чего предварительно проводят типирование возбудителя инфекционного процесса бактериальной этиологии у конкретного пациента для наработки соответствующего ему литического бактериофага, что позволяет усилить антибактериальные свойства целевого продукта и обеспечить индивидуальный подбор литического бактериофага для специфической фаготерапии и фагопрофилактики инфекционно-воспалительного процесса бактериальной этиологиии.

Наличие в структуре полимерного цемента микропор размерами порядка 100-200 нм позволяет использовать такой цемент как носитель бактериофага(ов), обладающего(их) литической активностью, размеры пор которого достаточны для размещения бактериофага(ов) полимерного цемента, что в дальнейшем обеспечивает эмиссию бактериофага(ов) из полимерного цемента как на границе «цемент-кость», так и в окружающие ткани в концентрациях, достаточных для поддержания минимальной, подавляющей инфекцию, концентрации бактериофага в тканях, окружающих имплантируемое устройство или систему медицинского назначения.

На фиг.1 представлено изображение внутренней структуры полимерного цемента в образце размером 2×2 мкм, полученное с помощью атомно-силовой микроскопии, в композиции которого отсутствуют модифицирующие компоненты, например бактериофаги, но отчетливо визуализируется пористость, достаточная для размещения в таких порах бактериофагов, представляющих собой наноразмерные частицы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Предварительно провели типирование возбудителя инфекционного процесса бактериальной этиологии для конкретного больного и соответствующего ему бактериофага с литической активностью. Далее смешали 1 г стерильного порошкообразного полимера полиметилметакрилата [Poly [(Methyl Methacrylate)-Co-Styrene] Copolymer], 0,5 мл жидкого мономера метилметакрилата (Methyl methacrylate). Смесь перемешали и охладили на ледяной бане в течение 5 минут до температуры 7°С. Затем добавили 0,079 мл раствора, содержащего патогенспецифичный коммерчески доступный «стафилококковый бактериофаг» против Staphylococcus aureus 209 (производства ФГУП «НПО «Микроген», Россия) с концентрацией частиц бактериофага 1,1×10⁷ БОЕ/мл в количестве 5,0 мас.%. Произвели тщательное перемешивание и придали нужную форму полимерному цементу.

В результате получили полимерный цемент следующего состава, мас.%:

Полиметилметакрилат (порошкообразный полимер) 63,3

Метилметакрилат (мономер) 31,7

Бактериофаг против Staphylococcus aureus 209 с количеством частиц бактериофага 1,1×10⁷ БОЕ 5,0

Пример 2

Предварительно провели типирование возбудителя инфекционного процесса бактериальной этиологии для конкретного больного и наработку соответствующего ему бактериофага с литической активностью. Далее смешали 1 г стерильного порошкообразного полимера полиметилметакрилата [Methyl methacrylate - styrene copolymer and Poly methacrylate], 0,5 мл жидкого мономера метилметакрилата (Methyl methacrylate), смесь перемешали и охладили на ледяной бане в течение 10 минут до температуры 4°С. Затем добавили 0,1 мл раствора, содержащего патогенспецифичный бактериофаг против Pseudomonas aeruginosa, депонированный в коллекции НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор», г.Новосибирск под регистрационным номером V-357 с концентрацией частиц бактериофага 1,4×10⁷ БОЕ/мл в количестве 6,25 мас.%. Произвели тщательное перемешивание и придали нужную форму полимерному цементу.

В результате получили полимерный цемент следующего состава, мас.%:

Полиметилметакрилат (порошкообразный полимер) 62,5

Метилметакрилат (мономер) 31,25

Бактериофаг против Pseudomonas aeruginosa V-357 с количеством частиц бактериофага 1,4×10⁷ БОЕ 6,25

Пример 3

Приготовление полимерного цемента осуществляли аналогично примеру 2, за исключением того, что в качестве бактериофага использовали смесь бактериофагов, содержащую 0,052 мл бактериофага против Pseudomonas aeruginosa, депонированного в коллекции НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск под регистрационным номером V-357 и 0,052 мл коммерчески доступного «стафилококкового бактериофага» против Staphylococcus aureus 209 с концентрацией частиц бактериофагов 1,25×10⁷ БОЕ/мл.

В результате получили полимерный цемент следующего состава, мас.%:

Полиметилметакрилат (порошкообразный полимер) 62,3

Метилметакрилат (мономер) 31,2

Смесь бактериофагов против Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus 209 с количеством частиц бактериофага 1,25×10 ⁷ БОЕ 6,5

Пример 4

Предварительно провели типирование возбудителя инфекционного процесса бактериальной этиологии для конкретного больного соответствующего ему бактериофага с литической активностью. Далее смешали 1 г стерильного порошкообразного полимера полиметилметакрилата [Methyl methacrylate - styrene copolymer и Poly methacrylate], 0,5 мл жидкого мономера метилметакрилата (Methyl methacrylate), смесь перемешали и охладили на ледяной бане в течение 5 минут до температуры 10°С. Затем добавили 0,1 мл раствора, содержащего патогенспецифичный бактериофаг против Bacillus species, депонированный в коллекции ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск, под регистрационным номером ph41 с концентрацией частиц бактериофага 6,8×10⁸ БОЕ/мл в количестве 6,25 мас.%. Произвели тщательное перемешивание и придали нужную форму полимерному цементу.

В результате получили полимерный цемент следующего состава, мас.%:

Полиметилметакрилат (порошкообразный полимер) 62,5

Метилметакрилат (мономер) 31,25

Бактериофаг против Bacillus species ph41 с количеством частиц бактериофага 6,8×10⁸ БОЕ 6,25

Пример 5

Для исследования пролонгированного действия бактериофага использовали культуру клеток Pseudomonas aeruginosa и полимерный цемент медицинского назначения, содержащий бактериофаг против данной культуры с количеством частиц бактериофага 8,0×10⁶ БОЕ. Инкубирование культуры клеток Pseudomonas aeruginosa с полимерным цементом, содержащим бактериофаг, проводили при температуре 37°С в течение 18-20 ч. Подсчет вирусных частиц вели методом двухслойного агара. Количество вирусных частиц бактериофага, добавленного в цемент, определяли в культуральной жидкости. Концентрация частиц бактериофага составила 1,8×10⁸ БОЕ/мл.

Затем цемент, содержащий бактериофаг, десятикратно отмывали в 1 мл 0,9%-ного раствора NaCl при интенсивном встряхивании на вортексе в течение 1-2 мин. Остатки жидкости удаляли стерильной фильтровальной бумагой. Фракции из аликвот 10 образцов, полученных после отмывки полимерного цемента, исследовали на присутствие фаговых частиц. Все аликвоты содержали вышеназванный бактериофаг. Цемент, отмытый от бактериофага, помещали в пробирку с культурой Pseudomonas aeruginosa. Инкубацию культуры клеток Pseudomonas aeruginosa с отмытым от бактериофага полимерным цементом проводили при температуре 37°С в течение 18-20 ч. Подсчет вирусных частиц проводили методом двухслойного агара. Концентрация частиц бактериофага с отмытого полимерного цемента составила 1×10 ⁸ БОЕ/мл.

Таким образом, показано, что бактериофаг активно элюируется из пор полимерного цемента в окружающую среду, при этом литическая активность бактериофага сохраняется.

Пример 6

Проводили определение длительности сохранения бактерицидной активности в образце полимерного цемента медицинского назначения, содержащего бактериофаг. Образец полимерного цемента, содержащего бактериофаг против Pseudomonas aeruginosa V-357 с количеством частиц бактериофага 8,0×10⁶ БОЕ, выдерживали в течение десяти суток на воздухе при температуре +10°С, а затем определяли количество частиц бактериофага. Для этого образец помещали в пробирку с культурой Pseudomonas aeruginosa и культивировали при 37°С в течение 18-20 ч. Концентрация частиц бактериофага в образце с цементом, хранившимся в течение 10 суток, составила 4,4×10⁹ БОЕ/мл.

Из примера 5 видно, что бактериофаг Pseudomonas aeruginosa V-357, добавленный в цемент, сохраняет свою литическую активность в течение десяти суток при температуре +10°С. Вещества, входящие в состав полимерного цемента, не инактивируют бактериофаг.

Предлагаемым способом можно готовить полимерные цементы медицинского назначения, содержащие бактериофаг, а также смесь бактериофагов против различных инфекционных агентов, таких как бактерии родов Pseudomonas, Staphylococcus, Bacillus и др. Использование предлагаемого способа обеспечивает получение полимерного цемента, одновременно обладающего такими качествами, как отсутствие аллергических реакций на бактериофаг, отсутствие механизмов резистентности со стороны патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из образца биоматериала от пациента, возможность воздействия бактериофага на бактериальную биопленку с ее частичным разрушением, прекращение действия бактериофага после лизиса патогенных бактерий с последующей самостоятельной элиминацией из макроорганизма.