способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, заполняющий материал и способ введения заполняющего материала в проблемную зону

Формула изобретения

1. Способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, характеризующийся тем, что гиалуронат натрия получают из петушиных гребней, выделяют его фракцию с молекулярной массой 1000-2000 кДа, далее замещают катионы натрия катионами цетилпиридиния, полученную аммонийную соль гиалуроната растворяют в апротонном растворителе, получают внутренние эфиры, выделяют модифицированный гиалуронат натрия путем добавления водного раствора хлорида натрия, осаждают гиалуронат натрия в ацетоне, сушат и стерилизуют, после чего модифицированный материал обрабатывают физиологически совместимым водным раствором до полного набухания и механически измельчают до размера частиц 50-100 мкм.

2. Заполняющий материал для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроновой кислоты, отличающийся тем, что он получен способом по п.1.

3. Способ введения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии в проблемную зону, характеризующийся тем, что заполняющий материал, полученный способом по п.1, стерилизуют и вводят инъекционно, при этом диаметр иглы в пределах 25-27 G.

Описание изобретения к патенту

Изобретения относятся к области медицины и могут быть использованы в пластической хирургии и инструментальной косметологии для эстетической коррекции небольших дефектов кожи, преимущественно лица и шеи, и эндопротезирования проблемных зон.

Гиалуроновая кислота (ГК) - природный линейный полисахарид, обладающий уникальными биологическими и физико-химическими свойствами. Гиалуроновая кислота присутствует в различных соединительных тканях животных, таких как кожа и хрящи. Особенно богаты гиалуроновой кислотой пуповина, синовиальная жидкость, стекловидное тело и кожа. В коже и хряще роль гиалуроновой кислоты заключается в связывании воды и поддерживании тонуса и упругости ткани. В межтканевых жидкостях вязкий раствор гиалуроновой кислоты служит смягчающим компонентом, создавая для клеток защитную среду.

В составе живых организмов гиалуроновая кислота преимущественно находится в форме гиалуронатов. Выделяют и используют ее, как правило, в виде натриевой соли гиалуроновой кислоты - гиалуроната натрия.

Далее по тексту, под термином «Гиалуроновая кислота» следует понимать полианион без указания соответствующего катиона и степени диссоциации (также для обозначения полианиона используют термины «гиалуронат» и «гиалуронан»).

Гиалуроновая кислота обладает хорошей биосовместимостью и не вызывает реакции на постороннее тело или аллергической реакции при имплантации. Эти свойства позволяют использовать ее в различных областях медицины, например хирургии, дерматологии, офтальмологии а также в косметологии и косметической хирургии. Сферу применения изделий на основе гиалуроновой кислоты можно значительно расширить, изменив ее физико-химические свойства и повысив устойчивость к деполимеризации, в то же время, сохранив биосовместимость с тканями организмов млекопитающих.

Новые биоматериалы на основе гиалуроновой кислоты могут быть получены с помощью разнообразных реакций по функциональным группам полимера. Химически модифицированная гиалуроновая кислота в организме подвергается деградации с меньшей скоростью, а сшитые молекулы в зависимости от типа химической модификации и степени перекрестного сшивания образуют плотные гидрогели, поддерживающие заданный объем и форму, или нерастворимые пластичные материалы. В то же время они сохраняют биосовместимость природного гиалуроната.

Существуют различные типы модификации. Например, способ сшивания гиалуроновой кислоты с использованием гидрофобного связывания или ионного связывания, который заключается в ведении в нее нуклеофильного реагента [Описание изобретения к патенту US № 4937270 от 18.09.1987, Н.Кл. 514/777, опубл. 26.06.1990].

Известен способ сшивания гиалуроновой кислоты посредством гидрофобного связывания путем ее этерификации [Описание изобретения к патенту US № 4851521 от 02.07.1986, Н.Кл. 536/55.1, опубл. 25.02.1989].

Известен способ сшивания гиалуроновой кислоты посредством ионного связывания поливалентными ионами [Описание изобретения к патенту ЕР № 0507604 А2 от 05.04.1991, МПК А61К 31/40, А61К 31/715, опубл. 07.10.1992].

Недостатками этих способов является то, что они связываются силой, слабой по сравнению с силой ковалентного связывания, они подвержены влияниям внешних изменений, таких как рН, ионная сила, температура и тому подобное. В дополнение, когда они используются как биомедицинские материалы, способность оставаться в живом организме коротка, и трудно регулировать должным образом способность оставаться в организме так, чтобы обеспечить физиологические воздействия гиалуроновой кислоты на организм.

Кроме того, известны типы сшивания молекул гиалуроновой кислоты ковалентным связыванием посредством дивинилсульфона [Описание изобретения к патенту US № 4582865 от 06.12.1984, Н.Кл. 524/29, опубл. 15.04.1986] и сшивание посредством эпоксида [Описание изобретения к патенту US № 4886787 от 13.02.1986, Н.Кл. 514/57, опубл. 12.12.1989]. Недостатками этих способов является то, что сшивающие агенты или сшивающие соединения, использованные в этих сшивках в избытке, являются токсичными. Кроме того, трехмерная сетчатая структура создается путем сшивания в то же самое время, когда дивинилсульфон, эпоксид или тому подобное вводятся в гиалуроновую кислоту и образованный структурированный гель на основе гиалуроновой кислоты переводится в нерастворимое состояние в растворителе, таком как вода и тому подобное. Непрореагировавшие низкомолекулярные соединения, включенные таким образом в сетчатую структуру, трудно отделять и удалять.

С другой стороны, известно сшивание гиалуроновой кислоты путем сшивающей реакции фотоотверждения при облучении ультрафиолетовыми лучами [Описание изобретения к патенту WO № 9718244 (А1) от 15.11.1995, МПК А61К 47/36, опубл. 22.05.1997] (JP-A-6-73102). Этот тип сшивания имеет преимущества в том, что фотореакционноспособное производное гиалуроновой кислоты, в которое вводится фотореакционноспособная сшивающая группа, является растворимым в воде до фотоотверждаемой сшивки, и трехмерная сетчатая структура не образуется в это время, так что непрореагировавшие низкомолекулярные соединения легко могут быть удалены; фотореакция сама по себе является такой чистой реакцией, что дает фотоотвержденное производное сшитой гиалуроновой кислоты без непрореагировавших низкомолекулярных соединений, и получающаяся в результате сшитая структура образуется путем ковалентного связывания, так что контроль способности оставаться в организме фотоотвержденного производного сшитой гиалуроновой кислоты может быть легко осуществлен путем регулирования степени сшивания.

Упомянутое выше фотоотвержденное производное сшитой гиалуроновой кислоты предназначено для применения в качестве биомедицинских материалов, например антиадгезивных материалов, которые исследованы в пленкообразной форме [Matsuda Т., Moghaddam M.J., Miwa H., Sakurai K., Ilda F. Photoinduced prevention of tissue adhesion//ASAIO Journal. - 1992. - V.38(3). - P.M154-M157], однако их трудно использовать для предотвращения спаек в тонких частях тканей или органов. Поэтому существует потребность в пригодном для инъекции геле фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты, который может быть инъецирован в такое тонкое место. Тем не менее, гидрогель фотоотвержденной сшитой гиалуроновой кислоты и способы его получения являются чисто теоретическим исследованием и поэтому их практическое получение неизвестно.

Также известен способ получения биоматериала для предотвращения послеоперационных спаек на основе гиалуроната натрия, который потенциально может быть использован в качестве заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии [Описание изобретения к патенту РФ № 2177332 от 27.12.2001, МПК A61L 31/06, А61Р 41/00, опубл. 27.12.2001]. Способ включает замещение катионов натрия катионами солей четвертичного аммония, растворение аммонийной соли гиалуроната в апротонном растворителе (в частности, диметилсульфоксиде (ДМСО)), получение внутренних эфиров, выделение модифицированного гиалуроната натрия путем добавления водного раствора хлорида натрия, осаждение гиалуроната натрия в ацетоне. Полученный настоящим образом биоматериал представляет собой бензиловый эфир гиалуроновой кислоты, в котором от 75 до 100% карбоксильных групп гиалуроновой кислоты этерифицированы бензильным радикалом. До 25% карбоксильных групп могут быть этерифицированы алкильным радикалом С₁₀-С₂₀-алифатического спирта при условии, что, по меньшей мере, 80% карбоксильных групп этерифицированы. Биоматериал выполнен в форме мембраны, сетки, тканого или нетканого полотна или геля. Другой вариант биоматериала содержит, по меньшей мере, одно производное гиалуроновой кислоты, представляющее собой аутоперекрестно связанное производное гиалуроновой кислоты, в котором от 0,5 до 20% карбоксильных групп гиалуроновой кислоты перекрестно связаны с гидроксильной группой той же или другой молекулы гиалуроновой кислоты.

Следует отметить, что использование смешанных фракций гиалуроновой кислоты для получения известным способом внутренних эфиров может приводить к образованию неоднородной сетки связей, которая может оказаться неустойчивой за счет эффекта синерезиса.

В качестве исходного соединения для проведения синтеза используют гиалуронат в виде водорастворимых солей четвертичного аммония. Необходимость выделения этих солей в сухом виде путем высушивания или вымораживания приводит к деградации цепи полимера с получением смешанных по ММ фракций, ограничивает объемы и усложняет технологию производства.

Задача, решаемая первым изобретением группы, и достигаемый технический результат заключаются в создании очередного способа получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроната натрия - биосовместимого с тканями организмов млекопитающих, который имеет заранее заданные физико-химические свойства: вязкость, пластичность, повышенную устойчивость к деполимеризации и прогнозируемое время биодеградации.

Для решения поставленной задачи и достижения заявленного технического результата в способе получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, характеризующеемся тем, что гиалуронат натрия получают из петушиных гребней, выделяют его фракцию с молекулярной массой 1000-2000 кДа, далее замещают катионы натрия катионами цетилпиридиния, полученную аммонийную соль гиалуроната растворяют в апротонном растворителе, получают внутренние эфиры, выделяют модифицированный гиалуронат натрия путем добавления водного раствора хлорида натрия, осаждают гиалуронат натрия в ацетоне, сушат и стерилизуют, после чего модифицированный материал обрабатывают физиологически совместимым водным раствором до полного набухания и механически измельчают до размера частиц 50-100 мкм.

Известны впрыскиваемые имплантаты на керамической основе для заполнения морщин, кожных впадин и шрамов, содержащие микрочастицы биосовместимого керамического соединения в суспензии в жидком носителе, где указанные микрочастицы являются биоразлагаемыми и имеют размер от 10 до 80 мкм, керамическое соединение содержит, по меньшей мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из трикальцийфосфата (вТСР) и двухфазных продуктов (ВРС), которые включают гидроксиапатит (НАР) и вТСР в варьируемом соотношении, причем указанный компонент является вТСР, и упомянутый жидкий носитель содержит, по меньшей мере, одно соединение на основе гиалуроновой кислоты и, по меньшей мере, одно биоразлагаемое тиксотропное соединение с псевдопластическими свойствами [Описание изобретения к патенту РФ № 2315627 от 27.01.2004, МПК A61L 27/12, A61L 27/50, A61L 27/58, A61L 27/46, A61F 2/00, опубл. 27.01.2008].

Имплантат в соответствии с настоящим изобретением имеет форму микрочастиц, в случае необходимости, форму микрошариков в суспензии в жидком носителе, переносящем упомянутые микрочастицы. Эти микрочастицы должны иметь диаметр, превышающий 10 мкм, чтобы избежать быстрого или мгновенного фагоцитоза макрофагами. Они должны иметь диаметр менее 45 мкм, чтобы их можно было впрыскивать при помощи очень тонкой иглы (обычно размером от 25 до 30 G). Предпочтительно, согласно изобретению, жидкий носитель выбирают таким образом, чтобы он имел собственную вязкость, достаточную для впрыскивания через иголку размером от 25 до 30 G и для поддержания однородности минеральной фазы, которой является керамическое соединение в суспензии в жидкой фазе, которой является жидкий носитель.

Пока еще нет сведений, позволяющих произвести комплексную оценку вTCP в процессе заполнения морщин (внутрикожные впрыскивания). Известно, что после 3 месяцев отмечено существенное снижение клеточной плотности соединительной капсулы, а также ее толщины, что отражает снижение интенсивности воспалительной реакции по мере разложения имплантата (примерно на 50% за три месяца, что доказывает полное исчезновение продукта за период от 8 до 16 месяцев в зависимости от известных моделей разложения). В спецификации на использование частиц «Biosorb®» не указана возможность имплантации частиц в мягкие ткани. Последствия постоянного присутствия избытка кальция в мягких тканях не исследованы и могут выражаться в появлении кальциноза и дистрофической кальцификации. Данный тип кальцификации может возникать как ответ на любые повреждения мягких тканей, включая те, что связаны с имплантацией медицинских устройств.

Известен биосовместимый полимерный материал, состоящий из гиалуроновой кислоты, неподвижного полимерного носителя и воды, при этом в качестве неподвижного полимерного носителя используют сетчатый полиаминный гель, равновесно набухший в водной среде, или сополимеры ненасыщенных полиаминов и незаряженных водорастворимых этиленоненасыщенных мономеров, полученные сополимеризацией в водной среде в присутствии сшивающих агентов. [Описание изобретения к патенту РФ № 2162343 от 01.09.1999, МПК⁷ A61L 15/00, A61L 27/00, A61K 31/728, опубл. 27.01.2001]. Указанный материал может быть использован для изготовления различных имплантатов для офтальмологии (например, интраокулярных и интракорнеальных линз, контактных линз, устройств для антиглаукоматозных операций, окулопластических имплантатов) и хирургии (например, для имплантатов, биополимерных повязок в пластической и реконструктивной хирургии).

Известный материал устойчив к действию протеолитических ферментов, является небиорезорбируемым, что обеспечивает перманентный характер имплантатов. Технология получения данного биосовместимого полимерного материала не предполагает его измельчения и введения методом инъекций. Стойкость биоматериала в тканях не позволяет проводить дальнейшую коррекцию области (например, в случае врачебных ошибок при введении), а также в некоторых случаях со временем может вызвать появления гранулем, кистозных узелков и хронические воспалительные реакции при повторных впрыскиваниях.

Известен фотоотвержденный гель сшитой гиалуроновой кислоты, который может быть использован в качестве заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, с модулем накопления (G') от 50 до 1500 Па, модулем потерь (G") от 10 до 300 Па и тангенсом дельта (G"/G') от 0,1 до 0,8 в динамической вязкоупругости, имеющий плотность полимерной сетки (частоту поперечных связей или узлов сетки) от 0,01 до 0,5% на 1 моль составляющего дисахаридного звена гиалуроновой кислоты и который является гидрогелем, полученным путем облучения ультрафиолетовыми лучами фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты, в котором фотореакционноспособная сшивающая группа химически связана с функциональной группой гиалуроновой кислоты и является производным коричной кислоты, содержащим спейсер, выбранный из ряда, включающего группы, полученные из аминоспирта, аминокислоты или пептида, указанные смежные фотореакционноспособные сшивающие группы указанного фотореакционноспособного производного гиалуроновой кислоты димеризованы путем облучения ультрафиолетовыми лучами с образованием циклобутанового кольца, с образованием сетчатой структуры, и указанный гель представляет собой гидрогель в таком состоянии, что он может быть извлечен для инъекции из контейнера при выдавливании [Описание изобретения к патенту РФ № 2197501 от 14.11.1996, МПК⁷ С08В 37/08, A61L 15/50, A61L 27/20, A61K 47/36, A61K 47/48, опубл. 27.01.2003].

Облучение гиалуроновой кислоты ультрафиолетом, с одной стороны, приводит к образованию поперечных сшивок, с другой, - к разрывам ее полимерной цепи, что может приводить к образованию неоднородной сетки связей, которая может оказаться неустойчивой (проявлять эффект синерезиса). Также ультрафилоетовое облучение геля перекрестно-сшитой гиалуроновой кислоты приводит к образованию свободных радикалов, способствующих ее дальнейшему разрушению, а после введения препарата внутрикожно и окружающих тканей. Ультрафиолет нарушает структуру гидрогеля, который начинает обладать повышенными адгезионными свойствами, что способствует более успешной колонизации на нем микроорганизмов.

Задача, решаемая вторым изобретением группы, и достигаемый технический результат заключаются в создании очередного заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроновой кислоты - биосовместимого с тканями организмов млекопитающих, который имеет заранее заданные физико-химические свойства: вязкость, пластичность, повышенную устойчивость к деполимеризации и прогнозируемое время биодеградации.

Для решения поставленной задачи и достижения заявленного технического результата заполняющий материал для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроновой кислоты получают способом согласно первому изобретению группы.

Известен способ введения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе сшитой гиалуроновой кислоты (гиалуроната натрия) в проблемную зону, заключающийся в его инъекционном введении путем выдавливания из тюбика или шприца и т.д. [См. описание изобретения к патенту РФ № 2197501].

Учитывая большой разброс размера молекул гиалуроновой кислоты, бывает недостаточно иметь заполняющий материал и типовое средство его доставки в проблемную зону. Необходимы гарантированная стерильность материала и определенные - под размер молекул, - параметры иглы для его введения в проблемную зону.

Задача, решаемая третьим изобретением группы, и достигаемый технический результат заключаются в создании способа введения в проблемную зону заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроновой кислоты - биосовместимого с тканями организмов млекопитающих, который имеет заранее заданные физико-химические свойства: вязкость, пластичность, повышенную устойчивость к деполимеризации и прогнозируемое время биодеградации.

Для решения поставленной задачи и достижения заявленного технического результата в способе введения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии в проблемную зону заполняющий материал получают способом согласно первому изобретению группы, стерилизуют и вводят инъекционно, при этом диаметр иглы в пределах 25-27 G.

Третье изобретение группы иллюстрируется чертежом, где:

- на фиг.1 показан общий вид устройства для реализации способа введения в проблемную зону заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроната натрия, укомплектованного специальным штоком, в разобранном виде (в состоянии поставки потребителю, причем игла условно не показана);

- на фиг.2 - вид устройства, подготовленного для проведения инъекции в проблемную зону.

Способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, характеризующийся тем, что гиалуронат натрия получают из первичного сырья, в качестве которого используют, как правило, петушиные гребни, выделяют его фракцию с молекулярной массой 1000-2000 кДа, далее замещают катионы натрия катионами цетилпиридиния, полученную аммонийную соль гиалуроната растворяют в апротонном растворителе, в частности диметилсульфоксиде (ДМСО), диметилформамиде (ДМФА), диэтилацетамиде (ДЭАМ), сульфолане или др., получают внутренние эфиры и выделяют модифицированный гиалуронат натрия путем добавления физиологически совместимого водного раствора хлорида натрия, осаждают гиалуронат натрия в ацетоне, сушат и стерилизуют, после чего модифицированный материал обрабатывают физиологически совместимым водным раствором до полного набухания и механически измельчают до размера частиц 50-100 мкм.

Настоящим способом получают оригинальный заполняющий материал для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроновой кислоты, который фасуют по 1,0-1,5 мл, например, в устройство, включающее герметичный корпус 1 с крышкой в виде поршня 2 и наконечник-конус 3 типа «Луер» с винтовой насадкой Луер Лок (Luer Lock) для соединения с головкой 4 иглы, диаметр которой лежит в пределах от 25-27 G (или от 0,41 мм до 0,51 мм). Далее устройство и его содержимое стерилизуют. В исходном состоянии устройства наконечник 3 закрыт съемной пробкой 5, а шток 6 для снижения габаритов прикладывают к заправленному нормированной дозой заполняющего материалом 7 корпусу 1 для последующей сборки с поршнем 2 и герметично упаковывают. Таким образом, появляется возможность осуществить способ инъекционного введения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроновой кислоты в проблемную зону. Проанализируем существенность признаков изобретений. Способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроната натрия включает получение гиалуроната натрия из первичного сырья, в качестве которого используют, как правило, петушиные гребни. Интегральные фракции гиалуроновой кислоты, полученные непосредственно путем экстракции из природных материалов, имеют молекулярную массу, варьирующуюся в широком диапазоне в зависимости от способа выделения и очистки, - примерно от 30 до 3000 кДа. В ходе одних и тех же процедур экстракции могут быть получены довольно широкие по молекулярной массе смешанные фракции. Использование таких фракций гиалуроновой кислоты для получения перекрестно-сшитых продуктов приводит к образованию неоднородной сетки связей, которая может оказаться неустойчивой при изменении внешних условий (проявлять эффект синерезиса). Чтобы избежать синерезиса получаемых продуктов модификации проводят разделение и очистку смеси молекулярных фракций при помощи известных методик, например путем ультрафильтрации (см., например, US № 5925626 - Hyaluronic acid fractions having pharmaceutical activity, and pharmaceutical compositions containing the same, - фракции гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 50-100 и 500-730 кДа получают методом ультрафильтрации интегральной фракции через мембраны с размером пор 30 кДа: более крупные молекулы остаются на фильтре, более мелкие проходят и отбираются; или, см., например, US № 5559104 - фракции гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 750-1250 кДа, полученные тем же методом) или тангенциальной фильтрации. Фильтрация в системах тангенциальной фильтрации осуществляется тангенциальным потоком через керамические или полипропиленовые мембраны с определенным диаметром пор.

В частности, можно использовать плоскорамные полисульфоновые мембраны с диаметром пор 1000 и 2000 кДа, позволяющие очистить гиалуроновую кислоту от содержащихся примесей и получить фракцию гиалуроновой кислоты с молекулярной массой от 1000 до 2000 кДа.

Использованная в изобретении фракция гиалуроновой кислоты с молекулярной массой от 1000 до 2000 кДа относится к высокомолекулярным фракциям и при введении в мягкие ткани проявляет противовоспалительные свойства, а также способствует ингибированию агрегации и адгезии тромбоцитов. Тогда как низко- и среднемолекулярные фракции с молекулярной массой от 30 до 500 кДа могут проявлять провоспалительное действие (индукцировать факторы воспаления). Выбор указанных границ фракции гиалуроновой кислоты, взятой для проведения модификации, обусловлен необходимостью компенсации технологических потерь молекулярной массы из-за деградации полимера в процессе получения заполняющего материала с целью обеспечения отсутствия в конечном продукте примесей гиалуроновой кислоты с молекулярной массой менее 500 кДа, что исключает возможность любых отрицательных реакций организма. Высокомолекулярные фракции гиалуроновой кислоты с массой от 2000 кДа и выше имеют большую вязкость, а следовательно, меньшую реакционную способность за счет больших диффузионных ограничений.

Способ получения заполняющего материала на основе гиалуроната натрия включает получение перекрестно-связанных производных гиалуроновой кислоты, характеризующихся высокой биосовместимостью. Материалы также являются полностью биодеградируемыми с вариабельным временем деградации и не требуют удаления с места аппликации. Будучи приготовлены в форме гелей, перекрестно связанные производные обеспечивают пластичные материалы со значительно большей вязкостью, чем немодифицированный полимер, что делает их пригодными для различных способов использования в пластической хирургии и инструментальной косметологии.

Как отмечено выше, данное изобретение характеризуется материалами, включающими производные гиалуроновой кислоты, особенно производными с внутренними перекрестными связями («внутренние эфиры»). Термин «перекрестно-связанный» обозначает перекрестные соединения между карбоксильными и гидроксильными группами молекул гиалуроната, а термин «внутренний эфир» обозначает, в частности, неполные внутренние сложные эфиры гиалуроновой кислоты, образованные перекрестными связями между карбоксильными и гидроксильными группами молекул гиалуроната.

В процессе получения внутренних сложных эфиров гиалуроновой кислоты необходима активация карбоксильных групп молекулы гиалуроновой кислоты. Нестабильные промежуточные продукты, полученные в реакции активации, спонтанно отделяются или после добавления катализаторов, и/или вследствие возрастания температуры, образуя внутренние сложно-эфирные связи с гидроксилами той же самой или другой молекулы гиалуроновой кислоты. В соответствии с желаемым уровнем внутренней этерификации активируются либо все, либо аликвотная часть карбоксильных функциональных групп.

В частности, получение сложных внутренних эфиров гиалуроновой кислоты проводят в диметилсульфоксиде с использованием иодида 1-метил-2-хлорпиридиния (реактива Мукаямы). Реактив Мукаямы выступает в качестве активатора карбоксильных групп гиалуроната, образуя с последним интермедиат, который в присутствии третичного амина образует с гидроксильной группой другого дисахаридного звена сложноэфирную связь:

Образование внутренних сложноэфирных связей может происходить в достаточно широком диапазоне температур, например между 0°С и 150°С, предпочтительно при комнатной температуре или несколько более высокой, например между 20°С и 75°С. Повышение температуры благоприятствует образованию внутренних сложноэфирных связей, как и воздействие излучения подходящей длины волны, например такого, как ультрафиолетовое излучение. В то же время повышение температуры способствует деградации полимерной цепи. Понижение температуры ниже 30°С приводит к застудневанию реакционной смеси. Для уменьшения деградации гиалуроновой кислоты и сохранения реакционной смеси в жидком состоянии предпочтительно проводить реакцию в диапазоне температур от 30 до 50°С.

Обычно для получения внутримолекулярных сложных эфиров гиалуроновой кислоты в качестве исходного соединения используют соли четвертичного аммония, имеющие в алифатической части число атомов углерода от 1 до 6, в частности гиалуронат тетрабутиламмония.

Гиалуронат тетрабутиламмония хорошо растворим как в диметилсульфоксиде, так и в воде. Его получают методами ионно-обменной хроматографии с последующим высушиванием или вымораживанием, что ограничивает объемы и усложняет технологию производства.

Вместо гиалуроната тетрабутиламмония в качестве исходного соединения можно использовать не растворимый в воде гиалуронат N-цетилпиридиния. Гиалуронат N-цетилпиридиния широко используют в процессах очистки и фракционирования гиалуроновой кислоты, например [Описание изобретения к патенту US № 5925626 от 20.07.1999, Н.Кл. 514/54, опубл. 06.06.1995], а также для образования катионных комплексов в реакциях ацетилирования гиалуроновой кислоты, например [Описание изобретения к патенту US № 6673919 от 06.01.2004, Н.Кл. 536/124, опубл. 28.05.2002]. Обычно гиалуронат N-цетилпиридиния получают смешиванием эквимолярных растворов гиалуроната натрия и хлорида N-цетилпиридиния при температуре 50еС.Концентрация раствора гиалуроната натрия обычно составляет 0,01-1%, предпочтительно 0,5%. Осадок гиалуроната N-цетилпиридиния отделяют центрифугированием или фильтрацией, промывают дистиллированной водой и сушат на воздухе, под вакуумом или замораживанием.

Альтернативная технология сушки гиалуроната N-цетилпиридиния, заключается в распределении осадка на гладкой поверхности в виде тонкой пленки, последующей сушке при 50°С и последующем измельчении. Данный способ позволяет получать сухой продукт в форме пленки, которая в дальнейшем быстрее растворяется в апротонных растворителях, что позволяет уменьшить температурную деградацию цепи гиалуроновой кислоты.

Сшитую гиалуроновую кислоту можно осаждать, выливая в смешивающийся с водой органический растворитель, например ацетон, метилэтилкетон, диметилформамид, диметилсульфоксид, метанол, этанол, 2-пропанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, N-метилпирролидон и т.п., предпочтительно спирт, например этанол. Осадок можно собрать и высушить, например, при пониженном давлении.

Сухую сшитую гиалуроновую кислоту можно измельчить любым способом, хорошо известным в этой области, например истиранием, перемалыванием, разрыванием и т.п., однако предпочтительнее измельчать размалыванием на криогенной мельнице. С другой стороны, невысушенную сшитую гиалуроновую кислоту можно высадить при охлаждении (криопреципитировать) с образованием малых частиц, которые потом можно высушить, или невысушенную сшитую гиалуроновую кислоту можно размельчить на криогенной мельнице и получающиеся частицы затем высушить.

Высушенный модифицированный продукт обрабатывают доведением до полного набухания гидратированием с помощью физиологически совместимого водного раствора и механически измельчают до размера частиц от 50-100 мкм с использованием сеток. Измельченный модифицированный продукт помещают в устройство доставки в проблемную зону, после чего подвергают стерилизации.

В результате получают оригинальный заполняющий материал для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроновой кислоты, который фасуют по 1,0-1,5 мл в специальное устройство для его доставки в проблемную зону. Этого количества достаточно для проведения одного полноценного сеанса эстетической коррекции и/или эндопротезирования небольших дефектов лица, т.е. для реализации способа введения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии в проблемную зону. Устройство доставки включает герметичный корпус 1 с крышкой в виде поршня 2 и наконечник-конус 3 для соединения с головкой 4 иглы, диаметр которой в пределах от 25-27 G (0,41-0,51 мм). При использовании иглы с меньшим диаметром потребуются значительные усилия на выдавливание содержимого корпуса 1 с соответствующими последствиями, такими как снижение точности координации рук врача и др., а использование иглы с большим диаметром приведет к увеличению травматичности и болезненности процедуры.

Реализацию изобретений рассмотрим на следующих характерных примерах.

Пример 1. Получение рабочей фракции гиалуроновой кислоты для дальнейшей модификации.

Гиалуроновую кислоту получают экстракцией из петушиных гребней. Очищенную интегральную фракцию разделяют ступенчато методом тангенциальной фильтрации с последующей концентрацией и осаждением субстрата этанолом для перевода в сухое вещество. Для фракционирования используют плоскорамные полисульфоновые мембранные модули с диаметром пор 0,1 и 0,2 мкм производства «Владисарт». В результате получают гиалуроновую кислоту для последующей модификации (см. ниже - Примеры 2-5) в границах молекулярной массы 1000 кДа - 2000 кДа.

Пример 2. Получение гиалуроната цетилпиридиния.

5,00 г (12,4 ммоль мономера) гиалуроната натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 4 часов. 5,00 г (14 ммоль) одноводной соли цетилпиридиний хлорида растворяют в 1 л дистиллированной воды при нагревании до 30°С. Полученные растворы нагревают до 60°С и раствор гиалуроната натрия добавляют к раствору хлорида цетилпиридиния при перемешивании. Полученную суспензию охлаждают до комнатной температуры, осадок отфильтровывают, промывают несколько раз дистиллированной водой, распределяют тонким слоем на поверхности стекла и высушивают при 40°С в течение 4 часов. Получают 7,56 г сухого гиалуроната цетилпиридиния (выход 94,5%).

Следующие примеры описывают получение перекрестно-сшитых продуктов гиалуроновой кислоты с разным процентным соотношением перекрестных связей, использованных в дальнейшем для производства конкретного заполняющего материала. Процентное соотношение перекрестных связей в продукте влияет, по меньшей мере, на его вязкость и устойчивость к деполимеризации. Например, для проблемных зон шеи, тонких, поверхностных морщин и участков с тонкой кожей можно использовать заполняющий материал на основе гиалуроновой кислоты с 5% перекрестных связей; для коррекции мелких морщин и формы губ - с 15% перекрестных связей; для коррекции глубоких морщин и складок, а также эндопротезирования - с 25% перекрестных связей.

Пример 3. Получение модифицированной гиалуроновой кислоты с 5% перекрестных связей для заполняющего материала.

Описание (свойства) продукта: 5% карбоксильных групп использовано для внутренней этерификации; 95% карбоксильных групп образуют соли с натрием.

6,445 г (10,0 ммоль мономера) гиалуроната N-цетилпиридиния растворяют в 250 мл ДМСО при 50°С, добавляют 0,07 мл (0,5 ммоль) триэтиламина и результирующую смесь перемешивают в течение 30 минут.

Раствор 0,13 г (0,5 ммоль) иодида 2-хлор-1-метилпиридиния в 50 мл ДМСО медленно добавляют по каплям в течение периода времени, равного 20 мин, и смесь выдерживают в течение 15 часов при 30°С.

Затем добавляют раствор, образованный из 100 мл воды и 2,5 г хлорида натрия, и результирующую смесь затем медленно приливают к 1250 мл ацетона, сохраняя постоянное перемешивание. Образуется преципитат, который затем фильтруют и промывают три раза 500 миллилитрами водного раствора ацетона в пропорции 5:1, затем 500 мл ацетона и, наконец, высушивают в течение 24 часов при 30°С. Высушенный продукт суспензируют в 350 мл 0,9% раствора хлорида натрия и затем осаждают в 1750 мл ацетона. Преципитат отделяют, промывают 500 миллилитрами водного раствора ацетона в пропорции 5:1, затем 500 мл ацетона и, наконец, высушивают в течение 24 часов при 30°С. В итоге получают 3,45 г продукта (выход 86%).

Количественное определение сложноэфирных групп выполняют методом омыления, описанным, например, в «Quantitative organic analysis via functional groups», 4th edition (John Wiley and Sons), стр.169-172.

Точную навеску 0,5 г полимера помещают в емкость на 200 мл, добавляют 30 мл 0,25 М (моль/л) спиртового раствора гидроксида натрия (NaOH). Емкость герметично закрывают и нагревают при температуре 100°С в течение суток. Параллельно нагревают 30 мл 0,25 М спиртового раствора гидроксида натрия (NaOH). После прекращения нагревания раствор количественно переносят в химический стакан добавлением 400 мл свежекипяченой дистиллированной воды. Раствор титруют потенциометрическим методом 0,25М раствором соляной кислоты. По кривым титрования определяют точку эквивалентности и объем соляной кислоты, пошедшей на титрование. По разнице объемов соляной кислоты, пошедших на титрование контрольного опыта, раствора гиалуроновой кислоты и раствора модифицированной гиалуроновой кислоты определяют количество кислоты, пошедшей на омыление эфирных связей. Обработку полученных данных и расчет содержания эфирных связей щ_эф в пересчете на карбоксильные группы проводят по следующим формулам:

щ_эф=н_эф /н_ГК=(V_ГК-V_эф)ЧС_HCl /н_ГК,

где V_ГК и V_эф - объем соляной кислоты, пошедшей на титрование гиалуроновой кислоты и образца эфира соответственно, мл;

C _HCl - концентрация соляной кислоты, C_HCl=0,25 моль/л (ммоль/мл);

н_ГК=1,25 - количество миллимоль гиалуроновой кислоты, взятой на титрование.

Пример 4. Получение модифицированной гиалуроновой кислоты с 15% перекрестных связей для заполняющего материала.

Описание (свойства) продукта: 15% карбоксильных групп использовано для внутренней этерификации; 85% карбоксильных групп образуют соли с натрием.

Получение модифицированной гиалуроновой кислоты с 15% перекрестных связей и определение сложноэфирных групп проводят аналогично Примеру 3, взяв 6,445 г (10,0 ммоль мономера) гиалуроната N-цетил-пиридиния, 0,21 мл (0,15 ммоль) триэтиламина и 0,39 г (0,15 ммоль) иодида 2-хлор-1-метилпиридиния.

Пример 5. Получение модифицированной гиалуроновой кислоты с 25% перекрестных связей для заполняющего материала.

Описание (свойства) продукта: 25% карбоксильных групп использовано для внутренней этерификации; 75% карбоксильных групп образуют соли с натрием.

Получение модифицированной гиалуроновой кислоты с 25% перекрестных связей и определение сложноэфирных групп проводят аналогично Примеру 3, взяв 6,445 г (10,0 ммоль мономера) гиалуроната N-цетилпиридиния, 0,35 мл (0,25 ммоль) триэтиламина и 0,65 г (0,25 ммоль) иодида 2-хлор-1-метилпиридиния.

Пример 6. Получение заполняющего материала из дегидратированной (обезвоженной) сшитой гиалуроновой кислоты.

Сухой порошок сшитой гиалуроновой кислоты суспендируют в фосфатном буфере для получения суспензии с концентрацией 10 мг/мл в форме густой массы или пасты. Фосфатный буфер имеет рН 7,4 и по своей осмотической концентрации соответствует 0,9% раствору хлорида натрия, состав раствора: двузамещенный фосфат натрия (Na ₂HPO₄) - 0,610 г (или Na₂HPO ₄·2H₂O - 0,765 г), однозамещенный фосфат натрия (NaH₂PO₄·2H₂O) - 0,088 г, хлорид натрия - 17 г, дистиллированная вода - до 2 л. Осмолярность суспензии доводят до 300-340 мОсм (миллиосмолей) добавлением хлорида натрия. Суспензию механически измельчают последовательным пропусканием через сетки с размером ячеек (пор) 0,5×0,5 мм и 0,1×0,1 мм. Полученный продукт с размером частиц 50-100 мкм помещают в устройство доставки в проблемную зону. Для чего его отмеряют заданным объемом в дозаторе и перемещают вовнутрь корпуса 1 со стороны его открытой части 8. Далее, с одновременным отведением воздушного пузырька в корпус 1 вставляется поршень 2. Корпус 1 комплектуется штоком 6, который прикладывается с возможностью последующей сборки или непосредственно вставляется (вворачивается) в соответствующее резьбовое гнездо 9 поршня 2 своим резьбовым участком 10. Далее заполненный продуктом корпус 1, укомплектованный штоком 6, подвергают стерилизации, в частности автоклавируют при 120°С и давлении около 138 кПа в течение 25 мин, и герметично упаковывают, например, в блистер.

Полученный препарат, расфасованный, как показал опыт, в оптимальной дозе 1,0 и/или 1,5 г в устройствах его доставки в проблемную зону, готов для использования по прямому назначению.

Пример 7. Описание динамической вязкости гелей гидратированной гиалуроновой кислоты.

Реологическое поведение гелей, полученных по примерам 3-6, оценивали с помощью ротационного вискозиметра «Полимер РПЭ-1М» с системой воспринимающих элементов «конус-плоскость» К3-03. Условия измерения включают температуру, равную 37°С, геометрию поверхности, представляющую собой плоскую пластину, и конус с углом при вершине 0,3°, зазор между поверхностями 200 мкм, градиент скорости сдвига 501 c^-1.

Замеренные в таких условиях значения динамической вязкости гелей составили 470±30 мПа·с для образца с 5% перекрестных связей, 650±50 мПа·с для образца с 15% перекрестных связей и 740±50 мПа·с для образца с 25% перекрестных связей.

Пример 8. Характеристика силы выдавливания (экструзии) гидратированных гелей гиалуроновой кислоты.

Силу, необходимую для выдавливания геля, можно охарактеризовать посредством загрузки геля объемом 2,25 мл в корпус заявленного устройства с внутренним диаметром 8,65 мм, снабженным иглой 27-го размера (27 G, внутренний диаметр 0,21 мм, площадь сечения 0,0346 мм²). Силу, необходимую для выдавливания геля через указанную иглу со скоростью 0,15 мл/мин, измеряли, помещая шприц в шприцевый насос, соединенный с системой измерения силы.

При температуре приблизительно 25°С и скорости выдавливания 0,15 мл/мин сила выдавливания составила 3,6 Н (ньютонов) для 1,0% раствора немодифицированной гиалуроновой кислоты; 2,9 Н для образца с 5% перекрестных связей (полученного по Примерам 3 и 6); 6,6 Н для образца с 15% перекрестных связей (полученного по Примерам 4 и 6) и 9,7 Н для образца с 25% перекрестных связей (полученного по Примерам 5 и 6). Настоящие показатели являются приемлемыми для проведения специалистом манипуляций с устройством для доставки заполняющего материала в проблемную зону.

Пример 9. Характеристика устойчивости заполняющего материала к ферментативному гидролизу.

Долговечность продукта при введении в организм определяется его чувствительностью к ферментативному гидролизу, хотя существуют и другие факторы, влияющие на время его нахождения в организме (или время резорбции). Стабильность сшитой гиалуроновой кислоты при ферментативном гидролизе измеряют с помощью теста in vitro, соединяя гель с известным количеством фермента гиалуронидазы и регистрируя изменение вязкости геля как функцию времени или определяя концентрацию выделившейся низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (дисахаридных звеньев).

К гелю, помещенному в емкость, добавляют раствор тестикулярной гиалуронидазы (фермента из семенников быка). Раствор гиалуронидазы готовят растворением содержимого 1 ампулы препарата «Лидаза» (64 у.е.) в 5 мл 0,15 М раствора NaCl. К пяти порциям геля объемом по 5 мл добавляют по 0,25 мл раствора гиалуронидазы (0,64 у.е./мл в конечном растворе) и перемешивают. Смеси помещают в стерильный бокс и выдерживают при температуре 30°С в течение 1-14 суток. Для прекращения гидролиза полученные смеси кипятят на водяной бане в течение 10 мин через 1, 2, 3, 7 и 14 суток. После охлаждения и термостатирования измеряют динамическую вязкость образцов с помощью ротационного вискозиметра «Полимер РПЭ-1М» методом, описанным в Примере 7. Настоящие сведения для материалов, полученных по Примерам 3-6, представлены в Таблице 1.

Для определения концентрации выделившейся низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (дисахаридных звеньев) в растворе в течение деградации проводят фотоколориметрическое определение глюкозамина по методу Элсона-Моргана в каждый промежуток времени (через 1, 2, 3, 7 и 14 суток). Сведения для материалов, полученных по Примерам 3-6, представлены в Таблице 2.

Таким образом, композицию настоящего примера можно считать стабильной в условиях теста. Опытный в данной области специалист поймет, что от композиции, устойчивой в таких условиях, можно ожидать хорошей стабильности также in vivo.

Пример 10. Исследование заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии на токсичность и биосовместимость.

Известно, что любые воздействия на организм находят свое отражение в изменениях системы крови. Морфофункциональные характеристики, обеспечивающие целостность эритроцитов, могут изменяться при воздействии ряда внешних и внутренних факторов. Нормальный эритроцит способен до определенного предела противостоять действию осмотических, механических, химических, температурных влияний. Это характеризуется понятием резистентности. Независимо от природы первым патогенным звеном воздействия внешних факторов является мембраноповреждающий эффект. Мембрана эритроцитов отражает особенности биохимического строения мембран различных тканей. Поэтому исследование осмотической резистентности эритроцитов - количественное определение степени гемолиза эритроцитов в забуферных гипотонических растворах хлорида натрия - в присутствии исследуемого препарата может дать сведения о наличии или отсутствии в нем мембраноповреждающих компонентов.

Реактивы

Основной раствор (по своей осмотической концентрации соответствует 10% раствору хлорида натрия) имеет рН 7,4, состав раствора: двузамещенный фосфат натрия (Na₂HPO₄) - 27,31 г (или Na₂ HPO₄·2H₂O - 34,23, г), однозамещенный фосфат натрия (NaH₂PO₄·2H₂ O) - 4,86 г, хлорид натрия - 180 г, дистиллированная вода - до 2 л. Основной раствор разводят в 10 раз и получают раствор, соответствующий по своей осмотической концентрации 1% раствору хлорида натрия. Из этого раствора готовят рабочие растворы хлорида натрия следующих концентраций, %: 0,85; 0,75; 0,70; 0,65; 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20 и 0,10.

Ход определения

В две стерильные пробирки с предварительно внесенными 2 каплями гепарина берут по 1,5 мл крови, перемешивают и одну используют для исследования, вторую - оставляют на сутки в термостате. В ряд центрифужных пробирок (14 штук) разливают по 5 мл рабочих растворов хлорида натрия концентрации от 1 до 0,10%. В каждую центрифужную пробирку добавляют по 0,02 мл перемешанной гепаринизированной крови и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Центрифугируют смесь крови с растворами хлорида натрия при 2000 об/мин в течение 5 мин. Из каждой пробирки сливают надосадочную жидкость и измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы.

Холостая проба - надосадочная жидкость в пробирке, содержащей 1% раствор хлорида натрия.

Расчет

За 100% гемолиз принимают гемолиз в пробирке, содержащей 0,1% раствор хлорида натрия. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, принятой за 100%, по формуле:

Процент гемолиза=Е_х×100/Е₁,

где E₁ - экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия;

E_x - экстинкция исследуемой пробы;

100 - процент гемолиза в пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия.

На следующий день повторяют исследование с кровью, инкубированной 24 ч при 37°С.

Экспериментальные результаты для заполняющего материала, полученного по Примерам 5 и 6, сведены в Таблицу 3, из которой следует, что значения осмотической резистентности эритроцитов в среднем превышают значения контрольного образца крови. Это говорит об отсутствии в заполняющем материале мембраноповреждающих компонентов, а следовательно, о его биосовместимости и отсутствии явно выраженной токсичности.

Пример 11. Клиническая эффективность.

Клиническая эффективность заполняющего материала оценивалась на базе Института пластической хирургии и косметологии (г.Москва). Показаниями к применению препарата были фотостарение, сухая, увядающая обезвоженная кожа, коррекция мимических морщин, атрофических рубцов, контурных деформаций. Инъекции препарата были проведены 12 пациентам в возрасте от 33 до 67 лет. Препарат вводили линейной техникой на глубину 3-4 мм внутридермально под углом 20-25 градусов к поверхности кожи, срез иглы (27 G) направлен вниз, в зонах выраженной депрессии перпендикулярно морщинам. После введения выполнялось интенсивное надавливание в месте инъекции для равномерного распределения препарата и легкий массаж с сосудоукрепляющим и противовоспалительным кремом. После проведения процедуры при необходимости использовался лед для уменьшения отека и болезненности.

После введения препарата через 15 дней отмечали улучшение тургора, цвета, выравнивание рельефа поверхности кожи лица. Хороший результат и выраженный клинический эффект получен у девяти (75%) пациентов, удовлетворительный - у трех (25%) пациентов. У одного (8%) из пациентов с удовлетворительным результатом была отмечена аллергическая реакция, что не является критичным при проведении такого рода процедур.

В результате исследования подтверждена эффективность, безопасность, хорошая переносимость заполняющего материала и возможность его использования для контурной пластики методом биоревитализации с целью эстетической коррекции рельефа поверхности кожи лица (морщин, складок, атрофических рубцов, контурных деформаций).

Пример 12 - обобщающий.

Для получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии берут гребни петухов, из которых экстрагируют гиалуроновую кислоту в виде ее натриевой соли. После очистки выделяют фракцию с молекулярной массой 1000-2000 кДа и растворяю в воде. Добавляют водный раствор хлорид цетилпиридиния для замещения катионов натрия катионами цетилпиридиния. Полученную нерастворимую в воде аммонийную соль гиалуроната выделяют и высушивают.

Выделенную соль растворяют в диметилсульфоксиде. После добавления соответствующих реагентов (см. пример 3) получают внутренние эфиры. Добавлением водного раствора хлорида натрия катионы цетилпиридиния замещают катионами натрия. Модифицированный гиалуронат натрия осаждают в ацетоне и высушивают. Высушенный модифицированный гиалуронат обрабатывают физиологически совместимым водным раствором фосфатного буфера до полного набухания и механически измельчают до размера частиц 50-100 мкм путем последовательного пропускания через сетки с соответствующим размером ячеек.

Полученный продукт на основе гиалуроновой кислоты является заполняющим материалом для пластической хирургии и инструментальной косметологии. Для его инъекционного введения в проблемную зону используют специальное устройство с иглой, диаметр которой в пределах 25-27 G. Настоящий материал подвергается стерилизации после его помещения в устройство для доставки.

Доставка заполняющего материала в проблемную зону осуществляется врачом-косметологом, прошедшим обучение по работе с полимерными гелями и процедурами биоревитализации.

В результате использования изобретений были созданы очередной способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии на основе гиалуроната натрия, заполняющий материал, биосовместимый с тканями организмов млекопитающих, который имеет заранее заданные физико-химические свойства: вязкость, пластичность, повышенную устойчивость к деполимеризации и прогнозируемое время биодеградации, и, соответственно, способ его введения в проблемную зону.

Таблица 1
Значения динамической вязкости образцов в ходе ферментативного гидролиза
Время ферментативного гидролиза, сутки	Динамическая вязкость, мПа·с
степень сшивки 5%	степень сшивки 15%	степень сшивки 25%
0	470±30	650±50	750±50
1	140±10	670±50	760±60
2	110±10	690±40	780±70
3	120±10	700±60	800±70
7	120±10	400±30	800±70
14	20±1	320±25	790±70

Таблица 2
Содержание низкомолекулярной гиалуроновой кислоты после ферментативного гидролиза для образцов с различной степенью сшивки, определенное по методу Элсона-Моргана
Время ферментативного гидролиза, сутки	Содержание низкомолекулярной гиалуроновой кислоты в пересчете на массу образца, %
степень сшивки 5%	степень сшивки 15%	степень сшивки 25%
0	0,00	0,00	0,00
1	0,72±0,06	0,83±0,07	0,12±0,01
2	1,16±0,09	0,80±0,06	0,2±0,01
3	1,24±0,08	0,88±0,07	0,27±0,02
7	2,5±0,2	1,63±0,11	0,34±0,02
14	2,7±0,2	1,65±0,13	0,41±0,03

Таблица 3
Осмотическая резистентность эритроцитов
Концентрация раствора NaCl, %	Гемолиз эритроцитов, %
Проба 1	Проба 2	Проба 3	Контрольные значения
опыт	контроль	опыт	контроль	опыт	контроль
0,85	0	0	0	0	0	0	0
0,75	0	0	0	0	0	0	0
0,65	0	0	0	0	0	0	0
0,55	0	0	0	0	0	0	0
0,50	4	5	3	5	0	6	0-6
0,45	24	27	23	27	44	43	5-45
0,40	85	87	75	84	88	87	50-100
0,35	94	92	93	93	95	95	90-100
0,25	96	98	93	98	95	100	98-100
0,10	100	100	100	100	100	100	100