способ получения 1- -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида

Формула изобретения

Способ получения 1- -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="/images/patents/471/2480009/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (рибавирина), включающий взаимодействие 1,2,4-триазол-3-карбоксамида и гуанозина при их мольном соотношении - 1:1,5 соответственно, в калий-фосфатном буфере с добавлением в реакционную смесь каталитических количеств арсената натрия до 0,5 мМ при нейтральном значении рН, температуре 58-62°С в присутствии пуриннуклеозидфосфорилазы в количестве 31,25 ед.акт. на 1 ммоль 1,2,4-триазол-3-карбоксамида.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству противовирусных соединений на основе модифицированных нуклеозидов, и может быть использовано при получении противовирусного препарата - 1- -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (рибавирина).

Рибавирин представляет собой широко используемый в медицине противовирусный и противоопухолевый препарат, подавляющий репродукцию ряда ДНК- и РНК-содержащих вирусов, в том числе вирусов гепатита С, гриппа и др. (Евр. патент ЕР 0956861, МПК⁷ A61K 38/21, опубл. 17.11.1999).

По химической структуре рибавирин представляет собой 1- -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид (рисунок 1).

Наиболее эффективным в настоящее время признан биотехнологический способ получения модифицированных нуклеозидов с использованием генно-инженерных ферментов нуклеозидфосфорилаз (НФ) - реакция ферментативного трансгликозилирования - в процессе которой происходит перенос сахарного остатка от природного пуринового или пиримидинового нуклеозида на модифицированное гетероциклическое основание (Purine nucleoside phosphorylases: properties. functions. and clinical aspects. Bzowska A., Kulikowska E., Shugar D. Pharmacology & Therapeutics. - 2000. - V.88. P.-349-425). Принципиальная схема процесса представлена на рисунке 2.

Известен способ получения рибавирина по реакции трансгликозилирования в процессе ферментации клеток Brevibacterium acetylicum, в котором исходное основание 1,2,4-триазол-3-карбоксамид и донор рибозы (инозин, аденозин, гуанозин, цитидин и др.) добавляют в культуральную среду, содержащую пролиферирующие микроорганизмы при 20-40°C. (Патент США 4,614,719 МПК⁷ кл. C12P 019/28, опубл. 30.09.1986). К недостаткам этого метода можно отнести следующее:

1) рибавирин продуцируется в культуральной среде в процессе роста микроорганизмов,

2) необходимо избегать заражения реакционного объема сторонними микроорганизмами,

3) ферменты клетки продуцируют не только рибавирин, но и весь спектр природных нуклеозидов, фосфатов рибавирина, его метаболитов, что усложняет процесс выделения целевого продукта,

Известен способ получения рибавирина, в котором 1,2,4-триазол-3-карбоксамид вводят в реакцию трансгликозилирования с гуанозином при 60°C в присутствии иммобилизованных ферментов (ИФП-ПНФ) пуриннуклеозидфосфорилаз с последующим выделением целевого продукта (Патент РФ № 2230118 C2, МПК⁷ кл. C12P 17/16, опубл. 10.06.2004). Выход составляет 67%. К недостаткам этого метода можно отнести следующее: при масштабировании технологии нецелесообразно использовать ИФП-ПНФ, т.к. в процессе синтеза рибавирина постепенно выпадает в осадок побочный продукт реакции - гуанин, который сорбируется на макропористом стекле, что снижает активность ИФП-ПНФ.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения рибавирина, в котором сырую биомассу клеток штамма Е. coli БМТ-ЗД/1А инкубируют с 1,2,4-триазол-3-карбоксамидом и гуанозином при 60°C в течение 30 часов с последующим выделением целевого продукта (Авт. свид. СССР № 1661209 A1, МПК⁷ кл. C12N 1/20, опубл. 07.07.91). Выход составляет 67% от теоретически возможного. Описанный способ получения рибавирина не свободен от всех недостатков, присущих указанным ранее способам.

К основному недостатку всех приведенных способов получения рибавирина относится необходимость хроматографического разделения компонентов реакционной смеси по окончании реакции трансгликозилирования (ионнобменная хроматография). Обычно, кроме целевого продукта в реакциях присутствует нуклеозид - донор рибозы, гетероциклическое основание и рибавирин.

Изобретение решает задачу упрощения технологии получения рибавирина.

Поставленная задача решается за счет того, что рибавирин получают путем взаимодействия 1,2,4-триазол-3-карбоксамида и гуанозина при их мольном соотношении - 1:1.5 соответственно, в калий-фосфатном буфере с добавлением в реакционную смесь каталитических количеств арсената натрия Na₃AsO₄ (до 0.5 мМ) при нейтральном значении pH, температуре 58-62°C в присутствии пуриннуклеозидфосфорилазы в количестве 31.25 ед.акт. на 1 ммоль 1,2,4-триазол-3-карбоксамида. В результате чего к моменту окончания реакции происходит 100% гидролиз избыточного количества природного нуклеозида (гуанозина) и выведение гетероциклического основания (гуанина) из смеси при последующем охлаждении.

Использование солей ортомышьяковой кислоты в синтезе нуклеозидов в литературе не известно. Известен способ проведения реакции фосфоролиза природных нуклеозидов с использованием солей ортомышьяковой кислоты (H₃AsO₄, арсенолиз). Образующийся в процессе реакции -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-рибозо-1-арсенат нестабилен в растворе и выводится из ферментативной реакции. (Purine nucleoside phosphorylase. Catalytic mechanism and transition-state analysis of the arsenolysis reaction. Kline, P.C., & Schramm, V.L. Biochemistry 1993. V.32. P.13212-13219). Однако соли мышьяковистой кислоты в мировой практике применяются только при гидролизе нуклеозидов до гетероциклических оснований.

Добавление в реакционную смесь каталитических количеств арсената натрия позволяет проводить процесс получения рибавирина в условиях 100% конверсии гуанозина до гуанина, упрощает состав реакционной смеси, облегчает процесс выделения рибавирина из реакционной смеси.

Изобретение осуществляют следующим образом.

В качестве генно-инженерных ферментов используют пуриннуклеозидфосфорилазу (ПНФ, КФ 2.4.2.1).

Синтез рибавирина (I, рисунок 1) из 1,2,4-триазол-3-карбоксамида проводят по реакции трансгликозилирования при мольном соотношении 1,2,4-триазол-3-карбоксамида к гуанозину - 1:1.5 при 58-62°C в калий-фосфатном буфере с добавлением в реакционную смесь каталитических количеств арсената натрия (до 0.5 мМ) при нейтральном значении рН. Реакцию проводят до полного исчезновения исходного гуанозина. Контроль процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. По окончании реакции, смесь упаривают в вакууме до половины исходного объема, выдерживают в течение 24 ч при температуре +4°C. Осадок отфильтровывают, фильтрат концентрируют в вакууме до небольшого объема и пропускают через небольшое количество ионнообменной смолы DOWEX (Н⁺ -форма). Полученный фильтрат упаривают в вакууме. Рибавирин кристаллизуют из смеси этанол-вода, 9:1.

Проведение процесса получения рибавирина описанным способом позволяет упростить процесс выделения продукта из реакционной смеси и получить рибавирин с выходом 82% и чистотой не менее 99%. Данные, подтверждающие достижение технического результата, представлены в таблице.

Таблица
-d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle">	Предлагаемый способ	Авт.свид. СССР № 1661209 A1
Температура (°C)	60±2	60
Соотношение компонентов	1:1.5	1:1.5
Время реакции, ч	24	20
Источник фермента	Очищенные генно-инженерные ферменты из Е.coli	Сырая биомасса клеток штамма Е.coli БМТ-3Д/1А
Использование каталитических количеств Na3AsO 4	да	нет
Необходимость использования смолы DOWEX (OH--форма)	нет	да
Необходимость в дополнительной кристаллизации продукта	да	да
Выход рибавирина, %	82	67

Изобретение иллюстрируют рисунки:

Рисунок 1. Структурная формула рибавирина (1- -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида).

Рисунок 2. Принципиальная схема реакции трансгликозилирования.

Рисунок 3. Схема ферментативного синтеза рибавирина (1- -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида).

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Получение рибавирина (соединение I, рис.3).

Смесь 4.48 г (0.04 моль) 1,2,4-триазол-3-карбоксамида (соединение II, рис.3) и 17.0 г (0.06 моль) гуанозина (соединение III, рис.3) и 0.1 г (0.0005 моль) Na₃AsO₄ растворяют в 1 л 15 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7.0) и термостатируют в течение 24 часов при 60±2°C в присутствии 5 мл ферментного препарата ПНФ (10 мг/мл, 25 ед.акт./мг белка или 31.25 ед.акт. на 1 ммоль 1,2,4-триазол-3-карбоксамида). Контроль полноты процесса осуществляют с помощью ВЭЖХ. Процесс считается законченным, если содержание исходного 1,2,4-триазол-3-карбоксамида (соединение II, рис.3) в реакционной смеси составляет менее 1%, а содержание гуанозина <0.1%.

Реакционный раствор упаривают в вакууме до половины исходного объема, охлаждают до температуры +4°C. Выпавший в осадок гуанин отфильтровывают, маточник упаривают в вакууме (5-7 мм рт.ст.) до объема ~200 мл и пропускают через стеклянный фильтр с 20 г ионнообменной смолы DOWEX (H ⁺-форма). Смолу промывают дважды 50 мл дистиллированной воды. Объединенный фильтрат упаривают в вакууме (5-7 мм рт.ст.) до объема ~20 мл, добавляют 180 мл этилового спирта, выдерживают при 20°C в течение 24 ч, выпавший в осадок рибавирин отфильтровывают, промывают водой (2×20 мл) и этиловым спиртом (1×20 мл), затем высушивают в эксикаторе до постоянного веса. Выход: 8.02 г (82%).

Чистота продукта по данным ВЭЖХ 99-99.8%. Т.пл. 175-178°C. -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> _max, нм ( -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> , M^-1 см^-1): 205.6 (11400). Масс-спектр, m/z: 245.5 [М+Н]⁺, 267.1 [M+Na]⁺, 282.9 [M+K]⁺, 487.9 [2М]⁺, 510.0 [2M+Na] ⁺, 526.0 [2M+K]⁺(Finnigan 900 S (ESI)). Спектр ¹Н-ЯМР (D₂O), ( -d-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида, патент № 2480218" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> . м. д.): 8.80 (1Н, уш. с, Н-5), 6.20 (1Н, д, Н-1', J_1',2'=3.44 Гц), 4.71 (1Н, дд, Н-2', J _2',1'=3.44 Гц, J_2',3'=5.27 Гц), 4.55 (1Н, дд, Н-3', J_3',2'=5.27 Гц, J _3',4'=5.27 Гц), 4.28 (1Н, тд, Н-4', J' _4',3'=5.27 Гц, J_4',5a'=3.21 Гц, J_4',5b'=5.27 Гц), 3.93 (1Н, дд, Н-5а', J_5а',5b'=12.6 Гц, J_5a',4' =3.21 Гц), 3.82 (1Н, дд, Н-5b', J_5b',5a' =12.6 Гц, J_5b',4'=5.27 Гц) (Bruker DRX 500).