ассоциированная вакцина для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных

Формула изобретения

Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза, содержащая инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobactcrium nccrophorum "0-1" ВИЭВ, представляющий собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа и адсорбированный на гидроокиси алюминия, а также суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в физиологическом растворе, и адъювант, отличающаяся тем, что инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин, адсорбированный 12-15%-ной гидроокисью алюминия, взятой в конечной концентрации 1,8-2,0%, предварительно суспендированной в гликоколевом буфере с рН 8,4-8,6, суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ используют с исходной концентрацией (5-5,2)·10 ⁷ в 1 см³ физиологического раствора, а в качестве адъюванта содержит сапонин при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Суспензия живых спор сибиреязвенного вакцинного
штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией
(5-5,2)·10 7 в 1 см3 физиологического раствора	1,0-1,2
Сапонин	1,5-2,1
Инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин с м.м.
18-20 кДа из штамма Fusobacterium
necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием
белка 5,5-6 мг %, адсорбированный 12-15%
гидроокисью алюминия, взятой в конечной
концентрации 1,8-2,0%, предварительно
суснендированной в гликоколевом буфере с pH 8,4-8,6	Остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарии и биотехнологии и касается получения ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных.

Известна вакцина для профилактики некробактериоза рогатого скота, содержащая в равных объемных соотношениях инактивированные формалином эндотоксин и экзотоксин, полученные из местных эпизоотических культур возбудителя некробактериоза, и адъювант на основе минерального масла и ланолина (Патент RU 1816348, МПК A61K 39/00, 1995).

Однако известная вакцина недостаточно иммуногенна, так как требует двукратного введения и обеспечивает иммунитет только против некробактериоза в течение 3,5-4 мес. Кроме того, при получении вакцины осуществляют предварительный подбор местных штаммов для каждого конкретного хозяйства, что невозможно при промышленном производстве.

Известна вакцина против сибирской язвы животных, содержащая суспензию живых спор бескапсульного, авирулентного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы (ТУ 9388-004-00008064-99). Известна также инактивированная вакцина против некробактериоза животных, содержащая инактивированные формалином эндотоксин и экзотоксин, полученные из производственного штамма "0-1" ВИЭВ возбудителя некробактериоза, и адъювант на основе минерального масла и ланолина (Патент RU 2109519, МПК A61K 39/02, A61K 39/114, 1998).

Существующие моновакцины применяют независимо друг от друга и не создают иммунитет у животных одновременно против сибирской язвы и некробактериоза. Использование этих вакцин в отдельности требует удвоенного количества трудозатрат и оказывает более сильное стрессовое состояние животных.

Известна ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза, содержащая инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, представляющий собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа и адсорбированный на гидроокиси алюминия, а также суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в физиологическом растворе, и адъювант (Патент RU № 2191599, 2002).

Однако известная ассоциированная вакцина не обеспечивает создание достаточного иммунитета против сибирской язвы и некробактериоза.

Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет получения высокоиммуногенной вакцины, обеспечивающей формирование более длительного и напряженного иммунитета против сибирской язвы и некробактериоза.

Технический результат изобретения достигается в ассоциированной вакцине против сибирской язвы и некробактериоза, содержащей инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, представляющий собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа и адсорбированный на гидроокиси алюминия, а также суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ в физиологическом растворе, и адъювант тем, что инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин адсорбирован 12-15% гидроокисью алюминия в гликоколевом буфере с pH 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-2,0%, суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ используют с исходной концентрацией (5-5,2)×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора, а в качестве адъюванта содержит сапонин при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Суспензия живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (5-5,2)×107 в 1 см3
физиологического раствора	1,0-1,2
Сапонин	1,5-2,1
Инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 5,5-6 мг %, адсорбированный 12-15% гидроокисью алюминия в гликоколевом буфере с
pH 8,4-8,6, взятой в конечной концентрации 1,8-2,0%	остальное

Ассоциированную вакцину вводят однократно крупному рогатому скоту, овцам, козам, свиньям и северным оленям внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в объеме 0,2 см³.

Сапонин-глюкозид, обусловливающий специфические свойства так наз. мыльного корня. Химический состав его, по Рохледеру, C ₃₂H₅₄O₁₈; /Л.Физер, М.Физер. Органическая химия. Том II. М. Химия, 1970. - с.558/.

Предложена ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза, создающая длительный иммунитет у привитых животных одновременно против двух заболеваний, при этом по иммуногенности она превосходит известную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза за счет использования не только в качестве адъюванта сапонина, а также найденного оптимального соотношения адсорбента лейкоцидин-экзотоксина - гидроокиси алюминия, взятой в определенных технологических условиях. Также уменьшение концентрации живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма в сотни раз по сравнению с известным техническим решением снижает реактогенность целевого продукта.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Ассоциированную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза готовят следующим образом.

Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидин-экзотоксина берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 кДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее полученный антиген - лейкоцидин-экзотоксин сорбируют на 12% гидроокиси алюминия, взятой в конечной концентрации 1,8%, предварительно суспендированной в гликоколевом буфере с pH 8,4. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина.

К 97,5 г инактивированному формалином лейкоцидин-экзотоксину с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 5,5 мг%, адсорбированному 12% гидроокисью алюминия, взятой в конечной концентрации 1,8%, предварительно суспендированной в гликоколевом буфере с pH 8,4, добавляют 1,0 г суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией 5,0×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора и 1,5 г сапонина, получая состав 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Суспензия живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией 5,0×107 в 1 см3
физиологического раствора	1,0
Сапонин	1,5
Инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 5,5 мг %, адсорбированный 12% гидроокисью алюминия, взятой в конечной концентрации 1,8%, предварительно
суспендированной в гликоколевом буфере pH 8,4	остальное

Вакцину тщательно перемешивают до получения однородной взвеси.

Пример 2. Ассоциированную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза готовят следующим образом.

Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидин-экзотоксина берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,5%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 кДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 6,0 мг% с молекулярной массой 18-20 кДа. Далее полученный антиген - лейкоцидин-экзотоксин сорбируют на 15% гидроокисью алюминия, взятой в конечной концентрации 2,0%, предварительно суспендированной в гликоколевом буфере с pH 8,6. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина.

К 96,7 г инактивированному формалином лейкоцидин-экзотоксину с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 6 мг%, адсорбированному 15% гидроокисью алюминия, взятой в конечной концентрации 2,0%, предварительно суспендированной в гликоколевом буфере с pH 8,6, добавляют 1,2 г суспензии живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией 5,2×10⁷ в 1 см³ физиологического раствора и 2,1 г сапонина, получая состав 2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Суспензия живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (5-5,2)×107 в 1 см3
физиологического раствора	1,2
Сапонин	2,1
Инактивированный формалином лейкоцидин-экзотоксин с м.м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 6 мг %, адсорбированный
15% гидроокисью алюминия, взятой в конечной концентрации 2,0%, предварительно суспендированной в
гликоколевом буфере с pH 8,6	остальное

Вакцину тщательно перемешивают до получения однородной взвеси.

Пример 3. Полученную по примерам 1 и 2, а также по прототипу, ассоциированную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза применяют для профилактических и вынужденных прививок клинически здоровых животных. Молодняк, не достигший 3-месячного возраста, прививать ассоциированной вакциной не разрешается. Вакцину вводят внутрикожно с помощью безыгольного инъектора в бесшерстный участок тела животным по 0,2 см³ (2 раза по 0,1 см³ ): морским свинкам, овцам и северным оленям.

Результаты испытания известной и предлагаемой ассоциированных вакцин против сибирской язвы и некробактериоза представлены в таблицах 1 и 2.

Таким образом, ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза обладает более высокой иммуногенной активностью, способной защитить животных одновременно от сибирской язвы и некробактериоза /продлевает срок иммунитета с одного года до 1,5 лет для профилактики сибирской язвы и с полгода до 1,5 лет - для профилактики некробактериоза/.

Таблица 1
Сравнительная характеристика показателей иммуногенности ассоциированных вакцин против сибирской язвы и некробактериоза через 1,5 года после вакцинации
Вакцина	Вид животного	Кол-во животных (голов)	Результаты контрольного заражения сибирской язвой
голов	% защиты
выжило	пало
Состав 1*	морские свинки	35	31	4	90
овцы	10	10	0	100
Состав 2**	морские свинки	35	32	3	91
овцы	10	9	1	90
Прототип	морские свинки	35	0	35	0
овцы	10	0	10	0
Примечание:
* - состав ассоциированной вакцины, полученный согласно примеру 1
** - состав ассоциированной вакцины, полученный согласно примеру 2

Таблица 2
Сравнительная характеристика показателей иммуногенности ассоциированных вакцин против сибирской язвы и некробактериоза через 1,5 года после вакцинации
Вакцина	Вид животного	Кол-во животных (голов)	Результаты контрольного заражения некробактериозом
голов	% защиты
Появление признаков болезни	Отсутствие заболевания
Состав 1*	олени	10	0	10	100
овцы	10	0	10	100
Состав 2**	олени	10	0	10	100
овцы	10	0	10	100
Прототип	олени	10	10	0	0
овцы	10	10	0	0
Примечание:
* - состав ассоциированной вакцины, полученный согласно примеру 1
** - состав ассоциированной вакцины, полученный согласно примеру 2