замещенные 1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дионы-антагонисты аденозинового a2a рецептора и их применение

Формула изобретения

1. Замещенные 1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дионы общей формулы 1, а также их фармацевтически приемлемые соли,



где Ar представляет собой 2,5-диметоксифенил, 4-изобутокси-3-метоксифенил, 3-феноксифенил, замещенный пирролидинилом, морфолинилом, пиперидинилом, пиперазинилом, С₁-С ₅алкоксигруппой, аминогруппой, возможно замещенной моно- или ди- С₁-С₅алкилом; 3-метилтиофен-2-ил, пиразол-4-ил, замещенный С₁-С₅алкилом; 2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-6-ил, возможно замещенный С ₁-С₅алкоксикарбонилом, карбамоилом, который возможно замещен моно- или ди -С₁-С₅алкилом, или карбонил-пиперазином, необязательно замещенным С₁ -С₅алкилом.

2. Соединение по п.1, выбранное из группы, содержащей 8-[(Е)-2-(2,5-диметоксифенил)-винил]-1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-[(Е)-2-(4-изобутокси-3-метоксифенил)-винил]-1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-[(Е)-2-(3-метилтиофен-2-ил)-винил]-1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-[(Е)-2-(1,3-диметилпиразол-4-ил)-винил]-1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 6-[(Е)-2-(1,3-диэтил-7-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1Н-пурин-8-ил)-винил]-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-2-карбоновой кислоты метиловый эфир; 6-[(Е)-2-(1,3-диэтил-7-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1Н-пурин-8-ил)-винил]-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-2-карбоновой кислоты метиламид; 6-[(Е)-2-(1,3-диэтил-7-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1Н-пурин-8-ил)-винил]-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-2-карбоновой кислоты диметиламид; 6-[(Е)-2-(1,3-диэтил-7-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1Н-пурин-8-ил)-винил]-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-2-карбоновой кислоты диэтиламид; 1,3-диэтил-7-метил-8-{(Е)-2-[2-(пиперазин-1-карбонил)-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-6-ил-винил}-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 1,3-диэтил-7-метил-8-{(Е)-2-[2-(4-метилпиперазин-1-карбонил)-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-6-ил-винил}-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[3-(4-диметиламинофенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[3-(4-диметиламинофенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[3-(4-пирролидин-1-илфенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[3-(4-пиперидин-1-илфенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[3-(4-морфолин-4-илфенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[3-(4-пиперазин-1-илфенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион, 8-{(Е)-2-[3-(4-метоксифенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[4-метокси-3-феноксифенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[6-метокси-3-феноксифенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[6-метокси-3-(4-метоксифенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[4-метокси-3-(4-метоксифенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион; 8-{(Е)-2-[6-метокси-3-(4-диметиламинофенокси)фенил]-винил}-1,3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион.

3. Антагонисты аденозинового A_2A рецептора, представляющие собой замещенные 1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дионы общей формулы 1 и их фармацевтически приемлемые соли по п.п.1 или 2.

4. Антагонисты аденозинового A_2A рецептора, представляющие собой замещенные 1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дионы общей формулы 1 и их фармацевтически приемлемые соли по пп.1 или 2 в качестве лекарственного начала, для приготовления фармацевтической композиции и лекарственного средства, для профилактики и лечения заболеваний центральной нервной системы, онкологических и воспалительных заболеваний.

5. Антагонисты аденозинового A_2A рецептора, представляющие собой замещенные 1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дионы общей формулы 1 и их фармацевтически приемлемые соли по п.1 или 2 в качестве адъюванта для усиления иммунного ответа или действия лекарственных средств при комбинаторном лечении онкологических, вирусных и бактериальных заболеваний.

6. Фармацевтическая композиция, обладающая антагонистической активностью к аденозиновому A_2A рецептору, включающая лекарственное начало по п.4 или адъювант по п.5 в терапевтически эффективном количестве.

7. Способ селективного ингибирования активности рецептора, заключающийся в контактировании образца, содержащего аденозиновый A_2A рецептор, с антагонистом аденозинового A_2A рецептора по п.3.

8. Лекарственное средство, обладающее антагонистической активностью по отношению к аденозиновому A _2A рецептору, в форме таблеток, капсул иди инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, предназначенное для профилактики и лечения заболеваний центральной нервной системы, лечения онкологических заболеваний и воспалительных процессов, включающее в свой состав лекарственное начало по п.4 или адъювант по п.5, или фармацевтическую композицию по п.6, в терапевтически эффективном количестве.

9. Лекарственное средство по п.8 для профилактики и лечения болезни Паркинсона.

10. Лекарственное средство по п.8 для профилактики и лечения когнитивных расстройств.

11. Лекарственное средство по п.8 для профилактики и лечения депрессий.

12. Лекарственное средство по п.8 для лечения воспалительных процессов.

13. Способ профилактики и лечения заболеваний, опосредованных действием антагониста A_2A рецептора, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции по п.6 или лекарственного средства по любому из пп.8-12, в терапевтически эффективном количестве.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к новым соединениям - замещенным 1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дионам, проявляющим антагонистическую активность по отношению к аденозиновым A_2A рецепторам, к их применению в качестве лекарственного начала и средства (адъюванта) для фармацевтических композиций, лекарственных средств и к способам лечения заболеваний центральной нервной системы, онкологических, вирусных и бактериальных заболеваний и воспалительных процессов.

A_2A рецепторы являются одним из 4-х подтипов (A₁, A_2A , A_2B и А₃) аденозиновых рецепторов. A ₁ рецептор ингибирует аденилатциклазу, а также активирует или ингибирует (в зависимости от типа клеток) фосфоинозитидный обмен. Кроме того, при участии G-белков этот рецептор активирует К-каналы и ингибирует Са-каналы. А₂ рецептор стимулирует аденилатциклазу. Оба типа рецептора имеют семь трансмембранных доменов и гомологичны другим мембранным рецепторам, сопряженным с G-белками. Аденозин связывается также с внутриклеточным участком на каталитической субъединице аденилатциклазы, вызывая ее ингибирование. Аденозиновые рецепторы локализованы в разных типах тканей и участвуют в регуляции целого ряда биологических процессов. Активация A ₁ и А₃ рецепторов вызывает снижение уровня цАМФ [Jockers R., Linder M.E., Hoehnegger M. J. Biol. Chem. 1994, 269, 32077. Palmer T.M., Gettys T.W., Stiles G.L. J. Biol. Chem. 1995, 270, 16895.], а активация A_2A и A_2B рецепторов приводит к его увеличению уровня цАМФ [Kull В., Svenningsson Р., Fredholm B.B. Mol. Pharmacol. 20006 58, 771. Bruns R.F., Lu G.H., Pugsley T.A. Mol. Pharmacol. 1986, 29, 331.]. Кроме того, стимулирование A₁ рецепторов вызывает активацию калиевых и дезактивацию кальциевых каналов [Iredale P.A., Alexander S.P.H., Hill S.J. Br. J. Pharmacol. 1994, 111, 1252. Bunemann M., Pott L. J. Physiol. 1995, 482, 81.], а стимулирование A _2A рецепторов приводит к ингибированию функциональной активности D₂ дофаминовых рецепторов, что имеет важное значение в развитии неврологических и психических заболеваний [Fuxe К., Ferre S., Zoli M., Agnati L.F. Brain Res. Rev. 1998, 26, 258. Franco R., Ferre S., Agnati L., Torvinen M., Gines S., Hillion J. Neuropsychoparmacol, 2000, 23, S50.].

Лиганды аденозиновых рецепторов находят широкое применение в фармакологии и медицине. Большое количество научных работ и патентов посвящено исследованиям по использованию антагонистов A_2A рецепторов в качестве лекарственных кандидатов для лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), в частности болезни Паркинсона [Pinna A. Novel investigational adenosine A_2A receptor antagonists for Parkinson's disease. Expert Opinion on Investigational Drugs, 2009, 18(11), 1619-1631).];

различного рода депрессий [El Yacoubi M, Costentin J, Vaugeois JM (December 2003). "Adenosine A2A receptors and depression". Neurology 61 (11 Suppi 6): S82-7. PMID 14663017. http://www.neurology.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=14663017; Kaster MP, Rosa АО, Rosso MM, Goulart EC, Santos AR, Rodrigues AL (January 2004). "Adenosine administration produces an antidepressant-like effect in mice: evidence for the involvement of Al and A2A receptors". Neuroscience Letters 355 (1-2): 21-4. doi:10.1016/j.neulet.2003.10.040. PMID 14729225. http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0304394003012345; Lobato KR, Binfare RW, Budni J, Rosa АО, Santos AR, Rodrigues AL (May 2008). "Involvement of the adenosine Al and A2A receptors in the antidepressant-like effect of zinc in the forced swimming test". Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry 32 (4): 994-9. doi:10.1016/j.pnpbp.2008.01.012. PMID 18289757.],

когнитивных расстройств [Takahashi RN, Pamplona FA, Prediger RD (2008). "Adenosine receptor antagonists for cognitive dysfunction: a review of animal studies". Frontiers in Bioscience: a Journal and Virtual Library 13 (13): 2614-32. doi:10.2741/2870. PMID 17981738. http://www.bioscience.org/2008/v13/af/2870/fulltext.htm.]

и воспалительных процессов [Sullivan GW (November 2003). "Adenosine A2A receptor agonists as anti-inflammatory agents". Current Opinion in Investigational Drugs (London, England: 2000) 4 (II): 1313-9. PMID 14758770; Lappas CM, Sullivan GW, Linden J (July 2005). "Adenosine A2A agonists in development for the treatment of inflammation". Expert Opinion on Investigational Drugs 14 (7): 797-806. doi:10.1517/13543784.14.7.797. PMID 16022569.].

Сравнительно недавно было показано, что аденозин, который накапливается вблизи опухолевой ткани [BIay J., White Т. D., Oskin D. W. The Extracellular Fluid of Solid Carcinomas Contains immunosuppressive Concentrations of Adenosine. Cancer Research, (1997) 57, 2602-2605.], существенно подавляет способность активированных Т-лимфоцитов и натуральных клеток-киллеров связываться с опухолевыми клетками и убивать их [Hoskin D. W, Reynolds Т., Blay J. 2-Chloroadenosine inhibits the MHC unrestricted cytolytic activity of anti-CD₃-activated killer cells: evidence for the involvement of a non-A₁/A₂ cell-surface adenosine receptor. Cell Immunol. (1994) 159: 85-93. Hoskin D. W., Reynolds Т., Blay, J. Adenosine as a possible inhibitor of killer T-cell activation in the microenvironment of solid tumours. Int. J. Cancer, (1994) 59: 854-855.]. Было показано, что гипоксия, развивающаяся в условиях твердых опухолей, инициирует образование повышенных концентраций аденозина вблизи опухолевой ткани. Аденозин, связываясь с аденозиновыми рецепторами типа A_2A, находящимися на клеточной мембране лимфоцитов, передает аденозиновый сигнал внутрь клеток путем активации внутриклеточной аккумуляции циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), который, в свою очередь, и снижает способность лимфоцитов атаковать опухолевую ткань [Sitkovsky М. V, Kjaergaard J, Lukashev D, Ohta A. Hypoxia-Adenosinergic Immunosuppression:Tumor Protection by Т Regulatory Cells and CancerousTissue Hypoxia. din Cancer Res (2008) 14(19), 5947-5952.]. На основании этих наблюдений [Ohta A., Gorelik E., Simon J., Prasad S. J, Ronchese F., Lukashev D., Wong М. K. K., Huang X., Caldwell S., Liu K., Patrick Smith P., Chen J.-F., Jackson E. K, Apasov S., Abrams S., Sitkovsky М. A_2A adenosine receptor protects tumors from antitumor Т cells. Proc Nati Acad Sci, USA (2006), 103, 13132-13137. Lukashev D., Sitkovsky М., Ohta A.. From "Hellstrom Paradox" to anti-adenosinergic cancer immunotherapy. Purinergic Signalling (2007) 3, 129-134], предложен инновационный подход к усилению эффективности противоканцерных вакцин с помощью адъюванта, являющегося ингибитором A_2A аденозинового рецептора [Ohta A., Sitkovsky М. METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVING IMMUNE RESPONSES, WO 2008/147482, 04.12.2008].

Описано и запатентовано большое количество антагонистов A_2A рецепторов, в том числе клинические кандидаты:

- SCH58261: 2-(2-furanyl)-7-(2-phenylethyl)-7H-pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo[1,5-c]pyrimidin-5-amine;

- Biogen-34: 5-[4-[[5-chlorol-l-methyl-3-(trifluoromethyl)-lH-pyrazol-4-yl]methyl]-1-piperazinyl]-2-(2-furanyl)-[1,2,4]triazolo[1,5- ][1,3,5]triazin-7-amine;

- Ver-6623: 2-isopropyl-4-(thiazol-2-yl)thieno[3,2-d]pyrimidine;

- MSX-2: 3-(3-hydroxypropyl)-7-methyl-8-(m-methoxystyryl)-1-propargylxanthine;

- KW-6002: (E)1,3-diethyl-8-(3,4-dimethoxystyryl)-7-methylxanthine;

- DMPX: 3,7-dimethyl-l-propargylxanthine,

для которых подробно изучены фармакологические профайлы на крысах и проведены сравнения A_2A рецепторной активности и селективности к другим аденозиновым рецепторам.

SCH58261	Biogen-34	Ver-6623
DMPX	KW-6002	DMPX

Поиск высокоэффективных и селективных антагонистов A_2A рецепторов является одним из основных направлений создания новых фармакологических средств для лечения заболеваний ЦНС, в частности, болезни Паркинсона, онкологических заболеваний и воспалительных процессов. В этой связи актуальным является разработка новых действующих веществ - антагонистов A_2A рецепторов, фармацевтических композиций и лекарственных препаратов, а также способов их получения и применения.

Ниже приведены термины, которые использованы в описании этого изобретения. «Адъювант» (adjuvant) - вещество или комплекс веществ, используемое для усиления иммунного ответа или усиливающее действие лекарственных средств. «Азагетероцикл» означает ароматическую или неароматическую моноциклическую или полициклическую систему, содержащую в цикле, по крайней мере, один атом азота. Азагетероцикл может иметь один или более «заместителей циклической» системы. «Алкенил» означает алифатическую линейную или разветвленную углеводородную группу, содержащую от 2 до 7 атомов углерода и включающую, по крайней мере, одну углерод-углеродную двойную связь. Разветвленная означает, что к линейной алкенильной цепи присоединены один или несколько низших алкильных групп, таких как метил, этил или пропил. Алкильная группа может иметь один или несколько заместителей, например, таких как галоген, алкенилокси, циклоалкил, циано, гидрокси, алкокси, карбокси, алкинилокси, аралкокси, арилокси, арилоксикарбонил, алкилтио, гетероаралкилокси, гетероциклил, гетероциклилалкилокси, алкоксикарбонил, аралкоксикарбонил, гетероаралкилоксикарбонил или , , , где и независимо друг от друга представляют собой «заместители амино группы», значение которых определено в данном разделе, например, атом водорода, алкил, арил, аралкил, гетероаралкил, гетероциклил или гетероарил, или и вместе с атомом N, с которым они связаны, образуют через и 4-7-членный гетероциклил или гетероцикленил. Предпочтительными алкильными группами являются метил, трифторметил, циклопропилметил, циклопентилметил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил, 3-пентил, метоксиэтил, карбоксиметил, метоксикарбонилметил, бензилоксикарбонилметил и пиридилметилоксикарбонилметил. Предпочтительными алкенильными группами являются этенил, пропенил, н-бутенил, изо-бутенил, 3-метилбут-2-енил, н-пентенил и циклогексилбутенил.

«Алкенилокси» означает алкенил-O- группу, в которой алкенил определен в данном разделе. Предпочтительным алкенилокси группами являются аллилокси и 3-бутенилокси.

«Алкенилоксиалкил» означает алкенил-O-алкил группу, в которой алкил и алкенил определены в данном разделе.

«Алкил» означает алифатическую углеводородную линейную или разветвленную группу с 1-12 атомами углерода в цепи. Разветвленная означает, что алкильная цепь имеет один или несколько «низших алкильных» заместителей. Алкил может иметь один или несколько одинаковых или различных заместителей («алкильных заместителей»), включая галоген, алкенилокси, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, ароил, циано, гидрокси, алкокси, карбокси, алкинилокси, аралкокси, арилокси, арилоксикарбонил, алкилтио, гетероарилтио, аралкилтио, арилсульфонил, алкилсульфонилгетероаралкилокси, аннелированный гетероарилциклоалкенил, аннелированный гетероарилциклоалкил, аннелированный гетероарилгетероцикленил, аннелированный гетероарилгетероциклил, аннелированный арилциклоалкенил, аннелированный арилциклоалкил, аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбонил, гетероаралкилоксикарбонил или где и независимо друг от друга представляют собой «заместители амино группы», значение которых определено в данном разделе, например, атом водорода, алкил, арил, аралкил, гетероаралкил, гетероциклил или гетероарил, или и вместе с атомом N, с которым они связаны, образуют через и 4-7-членный гетероциклил или гетероцикленил. Предпочтительными алкильными группами являются метил, трифторметил, циклопропилметил, циклопентилметил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил, 3-пентил, метоксиэтил, карбоксиметил, метоксикарбонилметил, этоксикарбонилметил, бензилоксикарбонилметил метоксикарбонилметил и пиридилметилоксикарбонилметил. Предпочтительными «алкильными заместителями» являются циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, гидрокси, алкокси, алкоксикарбонил, аралкокси, арилокси, алкилтио, гетероарилтио, аралкилтио, алкилсульфонил, арилсульфонил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбонил, гетероаралкилоксикарбонил или , , аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил.

«Алкинил» означает алифатическую линейную или разветвленную углеводородную группу, содержащую от 2 до 12 атомов углерода и включающую, по крайней мере, одну углерод-углеродную тройную связь.

Разветвленная означает, что к линейной алкинильной цепи присоединены один или несколько низших алкильных групп, таких как метил, этил или пропил. Алкильная группа может иметь один или несколько заместителей, например, таких как галоген, алкенилокси, циклоалкил, циано, гидрокси, алкокси, алкинилокси, аралкокси, арилокси, арилоксикарбонил, алкилтио, гетероаралкилокси, гетероциклил, гетероциклилалкилокси, алкоксикарбонил, аралкоксикарбонил, гетроаралкилоксикарбонил или где и независимо друг от друга представляют собой «заместители амино группы», значение которых определено в данном разделе, например, атом водорода, алкил, арил, аралкил, гетероаралкил, гетероциклил или гетероарил, или и вместе с атомом N, с которым они связаны, образуют через и 4-7-членный гетероциклил или гетероцикленил. Предпочтительными алкильными группами являются метил, трифторметил, циклопропилметил, циклопентилметил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил, 3-пентил, метоксиэтил, карбоксиметил, метоксикарбонилметил, бензилоксикарбонилметил и пиридилметилоксикарбонилметил. Предпочтительными алкенильными группами являются этенил, пропенил, н-бутенил, изо-бутенил, 3-метилбут-2-енил, н-пентенил, бута-1,3-диин и гекса-1,3,5-триин.

«Алкокси» означает алкил-O- группу, в которой алкил определен в данном разделе. Предпочтительным алкилокси группами являются метокси, этокси, н-пропокси, изо-пропокси и н-бутокси.

«Аминогруппа» означает замещенную или незамещенную «заместителем аминогруппы», и значение которых определено в данном разделе, например, амино (H₂N-), метиламино, диэтиламино, пирролидино, морфолино, бензиламино или фенетиламино.

«Антагонисты» означают лиганды, которые связываются с рецепторами определенного типа и не вызывают активного клеточного ответа. Антагонисты препятствуют связыванию агонистов с рецепторами и тем самым блокируют передачу специфического рецепторного сигнала.

«Антидепрессант» означает лекарственное средство, предназначенное для лечения депрессии.

«Арил» означает ароматическую моноциклическую или полициклическую систему, включающую от 6 до 14 атомов углерода, преимуществено от 6 до 10 атомов углерода. Арил может содержать один или более «заместителей циклической системы», которые могут быть одинаковыми или разными. Представителями арильных групп являются фенил или нафтил, замещенный фенил или замещенный нафтил. Арил может быть аннелирован с неароматической циклической системой или гетероциклом.

«Галоген» означает фтор, хлор, бром и йод. Предпочтительными яляются фтор, хлор и бром.

«Гетероциклил» означает ароматическую или неароматическую насыщенную моноциклическую или полициклическую систему, включающую от 3 до 10 атомов углерода, преимущественно от 5 до 6 атомов углерода, в которой один или несколько атомов углерода заменены на гетероатом, такой как азот, кислород, сера. Приставка «аза», «окса» или «тиа» перед гетероциклилом означает наличие в циклической системе атома азота, атома кислорода или атома серы соответственно. Гетероциклил может иметь один или несколько «заместителей циклической системы», которые могут быть одинаковыми или разными. Атомы азота и серы, находящиеся в гетероциклиле, могут быть окислены до N-оксида, S-оксида или S-диоксида. Представителями гетероциклилов являются пиперидин, пирролидин, пиперазин, морфолин, тиоморфолин, тиазолидин, 1,4-диоксан, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен и др.

«Гидрат» означает стехиометрическую или нестехиометрическую композицию вещества (соединения) или его соли с водой.

«Депрессия» означает большую депрессию; эпизодическую, хроническую и рецидивирующую формы большой депрессии; дистимическое расстройство (дистимию); циклотимию; аффективные расстройства; синдром сезонного аффективного расстройства; биполярные расстройства, включая биполярные расстройства I и II типа; а также другие депрессивные расстройства и состояния. Термин депрессия означает также депрессивные состояния, сопровождающие болезнь Альцгеймера, васкулярную деменцию; расстройства настроения, индуцированные алкоголем и веществами; шизоаффективные расстройства депрессивного типа; расстройства адаптации. Кроме того, депрессия включает депрессивные состояния онкологических больных; при болезни Паркинсона; депрессию после инфаркта миокарда; депрессию бесплодных женщин; педиатрическую депрессию; послеродовую депрессию; а также другие депрессивные состояния, сопровождающие соматические, невралогические и прочие заболевания.

«Заместитель» означает химический радикал, который присоединяется к скэффолду (фрагменту), например, «заместитель алкильный», «заместитель аминогруппы», «заместитель карбамоильный», «заместитель циклической системы», значения которых определены в данном разделе.

«Заместитель аминогруппы» означает заместитель, присоединенный к аминогруппе. Заместитель аминогруппы представляет собой водород, алкил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, ацил, ароил, алкилсульфонил, арилсульфонил, гетероарилсульфонил, алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил, гетероариламинокарбонил, гетероциклиламинокарбонил, алкиламинотиокарбонил, ариламинотиокарбонил, гетероариламинотиокарбонил, гетероциклиламинотиокарбонил, аннелированный гетероарилциклоалкенил, аннелированный гетероарилциклоалкил, аннелированный гетероарилгетероцикленил, аннелированный гетероарилгетероциклил, аннелированный арилциклоалкенил, аннелированный арилциклоалкил, аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил, алкоксикарбонилалкил, аралкоксикарбонилалкил, гетероаралкилоксикарбонилалкил. Значение «заместителей аминогруппы» определено в данном разделе.

«Заместитель циклической системы» означает заместитель, присоединенный к ароматической или неароматической циклической системе, включая водород, алкилалкенил, алкинил, арил, гетероарил, аралкил, гетероаралкил, гидрокси, гидроксиалкил, амино, аминоалкил, алкокси, арилокси, ацил, ароил, галоген, нитро, циано, карбокси, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, аралкоксикарбонил, алкилоксиалкил, арилоксиалкил, гетероциклилоксиалкил, арилалкилоксиалкил, гетероциклилалкилоксиалкил, алкилсульфонил, арилсульфонил, гетероциклилсульфонил, алкилсульфинил, арилсульфинил, гетероциклилсульфинил, алкилтио, арилтио, гетероциклилтио, гетероциклилтио, алкилсульфонилалкил, арилсульфонилалкил, гетероциклилсульфонилалкил, алкилсульфинилалкил, арилсульфинилалкил, гетероциклилсульфинилалкил, алкилтиоалкил, арилтиоалкил, гетероциклилтиоалкил, арилалкилсульфонилалкил, гетероциклилалкилсульфонилалкил, арилалкилтиоалкил, гетероциклилалкилтиоалкил, циклоалкил, циклоалкенил, гетероциклил, гетероцикленил, амидино, или где и представляют собой независимо друг от друга «заместители аминогруппы», значение которых определено в данном разделе, например, водород, необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный аралкил, или необязательно замещенный гетероаралкил, или заместитель в котором может быть ацил или ароил, а значение определено выше, или «заместителями циклической системы» являются или в которых и вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют через и 4-7-членный гетероциклил или гетероцикленил.

«Когнитивные расстройства или нарушения когнитивных функций (cognitive disorder)» означают нарушение (ослабление) умственных возможностей, включающих внимание, память, мышление, познание, обучение, речевые, мыслительные, исполнительные и творческие способности, ориентацию во времени и пространстве, в частности, когнитивные расстройства, связанные с болезнями Альцгеймера, Паркинсона и Гантингтона; старческое слабоумие; возрастные расстройства памяти (age-associated memory impairment, AAMI); дисметаболические энцефалопатии; психогенные нарушения памяти; амнезия; амнестические расстройства; транзиторная глобальная амнезия; диссоциативная амнезия; васкулярная деменция; легкие (или умеренные) когнитивные нарушения (mild cognitive impairment, MCI); синдром нарушения внимания с гиперактивностью (attention deficit hyperactivity disorder, AD/HD); когнитивные нарушения, сопровождающие психотические заболевания, эпилепсию, делирий, аутизм, психозы, синдром Дауна, биполярные расстройства и депрессию; СПИД-ассоциированная деменция; деменция при гипотиреоидизме; деменция, индуцированная алкоголем, веществами, вызывающими зависимость, и нейротоксинами; деменция, сопровождающая нейродегенеративные заболевания, например, мозжечковую дегенерацию и амиотрофический латеральный склероз; когнитивные расстройства, развивающиеся при инсульте, инфекционных и онкологических заболеваниях головного мозга, а также при черепно-мозговых травмах; нарушения когнитивных функций, ассоциированные с аутоиммунными и эндокринными заболеваниями; и прочие когнитивные расстройства.

«Лекарственное начало» (лекарственная субстанция, лекарственное вещество, drug-substance) означает физиологически активное вещество синтетического или иного происхождения (биотехнологического, растительного, животного, микробного и прочего), обладающее фармакологической активностью и являющееся активным началом фармацевтической композиции, используемой для производства и изготовления лекарственного препарата (средства).

«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции), в виде таблеток, капсул, инъекций, мазей и других готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.

«Лиганды» представляют собой химические вещества (малая молекула, неорганический ион, пептид, белок и прочее), способные взаимодействовать с рецепторами, которые трансформируют это взаимодействие в специфический сигнал.

«Нейродегенеративное заболевание (НЗ)» означает специфическое состояние и заболевание, характеризующиеся повреждением и первичной гибелью популяций нервных клеток в определенных областях центральной нервной системы. Нейродегенеративные заболевания включают, но не ограничивают, болезни Альцгеймера и Паркинсона; болезнь (хорею) Хантингтона; рассеянный склероз; мозжечковую дегенерацию; амиотрофический латеральный склероз; деменцию с тельцами Леви; спинальную мускульную атрофию; периферическую нейропатию; губчатый энцефалит («коровье бешенство», Creutzfeld-Jakob Disease); СПИД-ассоциированную деменцию; мультиинфарктную деменцию; лобно-височную деменцию; лейкоэнцефалопатию (болезнь исчезающего белого вещества); хронические нейродегенеративные заболевания; инсульт; ишемическое, реперфузионное и гипоксическое повреждение мозга; эпилепсия; церебральная ишемия; глаукома; черепно-мозговая травма; синдром Дауна; энцефаломиелит; менингит; энцефалит; нейробластома; шизофрения; депрессия. Кроме того, нейродегенеративные заболевания включают патологические состояния и расстройства, развивающиеся при гипоксии, злоупотреблении веществами, вызывающими зависимость, при воздействии нейротоксинов, инфекционных и онкологических заболеваниях головного мозга, а также нейрональные повреждения, ассоциированные с аутоиммунными и эндокринными заболеваниями; и прочие нейродегенеративные процессы.

«Низший алкил» означает линейный или разветвленный алкил с 1-5 атомами углерода.

«Ноотропы» или «ноотропики», они же нейрометаболические стимуляторы - вещества, принимаемые для улучшения умственных способностей.

«Психические расстройства» (психические заболевания) - это болезни или болезненные состояния, связанные с нарушением и/или расстройством психики. Психические расстройства включают аффективные расстройства (биполярные аффективные расстройства, большая депрессия, гипомания, малая депрессия, маниакальный синдром, синдром Котара, циклотимия, шизоаффективное расстройство и др.); интеллектуально-мнестические расстройства, мании (гипомания, графомания, клептомания, магазиномания, мания преследования, мономания, порнографомания, эротомания и др.); расстройство множественной личности, аменцию, белую горячку, бред, бредовый синдром, галлюцинаторный синдром, галлюцинации, галлюциноз, томицидоманию, делирий, иллюзию, кверулянтство, клиническую ликантропию, макропсию, манихейский бред, микропсию, наркоманию, нервную анорексию, онейроидный синдром, пароноид, паранойю, парафрению, псевдогаллюцинации, психоз, синдром Котара, шизоаффективное расстройство, шизотипическое расстройство, шизофрению, шизофреноподобное расстройство, шизофреноморфное расстройство, синдром Шребера, Даниэль Пауля); фобии (агарофобию, арахнофобию, аутофобию, верминофобию, гидрозофобию, гидрофобию, демофобию, зоофобию, канцерофобию, клаустрофобию, климакофобию, ксенофобию, мизофобию, радиофобию, светобоязнь, сколицефобию, скотофобию, социофобию, тетрафобию, трискаидефобию, эротофобию); алкогольные психозы, алкогольный палимпсест, аллотриофагию, афазию, графоманию, диссоциативные фуги, диссоциативные расстройства, дисфории, Интернет-зависимости, ипохондрию, истерию, копрофемию, манию преследования, меланхолию, мизантропию, обсессию, панические атаки, синдром Аспергера, синдром Капгра, синдром Мюнхгаузена, синдром Ретта, синдром Фреголи, синдром дефицита внимания и гиперактивности, синдром навязчивых состояний, синдром последствий хронической наркотизации, синдром психического автоматизма, синдром раннего детского аутизма, сумасшествие, тафофилию, тревожные состояния, синдром Хикикомори, эротографоманию и др.

«Психотические заболевания» - это все виды шизофрении; шизофреноподобные заболевания; шизотипические расстройства; шизоаффективные расстройства, включая биполярный и депрессивный типы; бредовые расстройства, включая бред отношения, преследования, величия, ревности, эротомании, а также ипохондрический, соматический, смешанный и недифференцируемый бред; кратковременные психотические расстройства; индуцированные психотические расстройства; индуцированные веществами психотические расстройства; а также другие психотические расстройства.

«Рецепторы» представляют собой биологические макромолекулы, расположенные на цитоплазматической мембране клетки или внутриклеточно, способные специфически взаимодействовать с ограниченным набором физиологически активных веществ (лигандов) и трансформировать сигнал об этом взаимодействии в определенный клеточный ответ.

«Терапевтический коктейль» представляет одновременно администрируемую комбинацию двух и более лекарственных препаратов, обладающих различным механизмом фармакологического действия и направленных на различные биомишени, участвующие в патогенезе заболевания.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя соединение формулы I и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлимых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, алгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения.

«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе синтеза, выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валериаты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропионаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные (Подробное описание свойств таких солей дано в Berge S.M., et al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66: 1-19). Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, при этом могут быть синтезированы соли металлов и аминов. К металлическим относятся соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из которых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид натрия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быть получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие достаточной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях (в частности, они должны обладать низкой токсичностью). К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, бензиламин, дибензиламин, дициклогексиламин, пиперазин, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)аминометан и подобные им. Кроме того, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как холин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитин и аргинин.

Предметом данного изобретения являются замещенные 1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дионы общей формулы 1, а также их фармацевтически приемлемые соли

где Ar представляет собой 2,5-диметоксифенил; 4-изобутокси-3-метоксифенил; 3-феноксифенил, замещенный пирролидинилом, морфолинилом, пиперидинилом, пиперазинилом, С₁-С ₅алкоксигруппой, аминогруппой, возможно замещенной моно- или ди -С₁-С₅алкилом; 3-метилтиофен-2-ил; пиразол-4-ил, замещенный С₁-С₅алкилом; 2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-6-ил, возможно замещенный С ₁-С₅алкоксикарбонилом, карбамоилом, который возможно замещен моно- или ди -С₁-С₅алкилом, или карбонил-пиперазином, необязательно замещенным С₁ -С₅алкилом.

Согласно данному изобретению более предпочтительными соединениями являются:

8-[(Е)-2-(2,5-диметоксифенил)-винил]-1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.1,

8-[(Е)-2-(4-изобутокси-3-метоксифенил)-винил]-1.3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.2,

8-[(Е)-2-(3-метилтиофен-2-ил)-винил]-1.3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.4,

8-[(Е)-2-(1,3-диметилпиразол-4-ил)-винил]-1.3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.5,

6-[(Е)-2-(1,3-диэтил-7-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1Н-пурин-8-ил)-винил)-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-2-карбоновой кислоты метиловый эфир формулы 1.6,

6-[(Е)-2-(1,3-диэтил-7-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1Н-пурин-8-ил)-винил)-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-2-карбоновой кислоты метиламид формулы 1.7,

6-[(Е)-2-(1,3-диэтил-7-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1Н-пурин-8-ил)-винил)-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-2-карбоновой кислоты диметиламид формулы 1.8,

6-[(Е)-2-(1,3-диэтил-7-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1Н-пурин-8-ил)-винил)-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-2-карбоновой кислоты диэтиламид формулы 1.9,

1,3-диэтил-7-метил-8-{(Е)-2-[2-(пиперазин-1-карбонил)-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-6-ил-винил}-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.10,

1,3-диэтил-7-метил-8-{(Е)-2-[2-(4-метилпиперазин-1-карбонил)-2,3-дигидро-бензо[1,4]диоксин-6-ил-винил}-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.11,

8-{(Е)-2-[3-(4-диметиламинофенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.12,

8-{(Е)-2-[3-(4-диметиламинофенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.13,

8-{(Е)-2-[3-(4-пирролидин-1-илфенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.14,

8-{(Е)-2-[3-(4-пиперидин-1-илфенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.15,

8-{(Е)-2-[3-(4-морфолин-4-илфенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.16,

8-{(Е)-2-[3-(4-пиперазин-1-илфенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.17,

8-{(Е)-2-[3-(4-метоксифенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.18,

8-{(Е)-2-[4-метокси-3-феноксифенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.19,

8-{(Е)-2-[6-метокси-3-феноксифенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.20,

8-{(Е)-2-[6-метокси-3-(4-метоксифенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.21,

8-{(Е)-2-[4-метокси-3-(4-метоксифенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.22,

8-{(Е)-2-[6-метокси-3-(4-диметиламинофенокси)фенил]-винил}-1.3-диэтил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дион формулы 1.23,

Предметом данного изобретения является способ получения замещенных 1,3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дионы общей формулы 1 ацилированием 5,6-диамино-1Н-пиримидин-2,4-дионов общей формулы 2 кислотами общей формулы 3 в присутствии соответствующих реагентов, например, O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N`,N`-тетрагидроурония тетрафторбората или 1-гидроксибензтриазола N-(3-(диметиламино)пропил)-N`-этилкарбодиимида, циклизацией образующихся соединений общей формулы 4 в пурины общей формулы 5 и метилированием последних в целевые продукты общей формулы 1

где Ar имеет вышеуказанное значение.

Предметом данного изобретения являются новые антагонисты аденозинового A_2A рецептора, представляющие собой получения замещенных 1.3-диэтил-8-винил-7-метил-3,7-дигидро-пурин-2,6-дионы общей формулы 1 и их фармацевтически приемлемые соли.

Антагонистическую активность новых соединений общей формулы 1 и их фармацевтически приемлемых солей по отношению к аденозиновому A_2A рецептору проводили ex vitro в функциональном тесте на клетках. В эксперименте использовали клетки линии ValiScreen cell line (PerkinElmer, США), экспрессирующей рекомбинантный человеческий аденозиновый рецептор типа аза.

В таблице 1 представлены данные по активности К_i для некоторых из соединений общей формулы 1, подтверждающие их высокую антагонистическую активность по отношению к аденозиновому А _2А рецептору. Неожиданно обнаружилось, что активность новых соединений в 1,3-10 раз выше активности известного аналога KW-6002.

Таблица 1
Антагонистическая активность (Ki) соединений общей формулы 1 по отношению к аденозиновому А2А рецептору в функциональном тесте на клетках
№ соединения	Ki, nM
1.1	0,4
1.2	1,4
1.4	1,7
1.5	3,2
1.6	0,9
1.7	2,8
1.13	2.3
1.18	1.1
1.23	0.7
KW-6002	4,0

Предметом данного изобретения являются соединения общей формулы 1, представляющие собой лекарственное начало (субстанцию) для приготовления фармацевтических композиций и готовых лекарственных форм для профилактики и лечения заболеваний центральной нервной системы, онкологических, вирусных, бактериальных заболеваний и воспалительных процессов у теплокровных животных и людей.

Согласно данному изобретению новые соединения общей формулы 1 представляют собой средство (адъювант) для усиления иммунного ответа или действия лекарственных средств при комбинаторном лечении заболеваний, опосредованных действием антагониста A_2A рецептора, в том числе онкологических заболеваний.

Предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая антагонистической активностью по отношению к аденозиновому A_2A рецептору, включающая в качестве лекарственного начала (субстанции) или средства (адъюванта) соединения общей формулы 1 или их фармацевтически приемлемые соли в терапевтически эффективном количестве.

Фармацевтические композиции могут включать фармацевтически приемлемые эксципиенты. Под фармацевтически приемлемыми эксципиентами подразумеваются применяемые в сфере фармацевтики разбавители, вспомогательные агенты и/или носители. Фармацевтическая композиция наряду с соединением общей формулы 1 или его фармацевтически приемлемой солью, по настоящему изобретению, может включать и другие активные субстанции, в том числе обладающие противогриппозной активностью, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов.

При необходимости использования фармацевтической композиции по настоящему изобретению в клинической практике она может смешиваться с традиционными фармацевтическими носителями.

Носители, используемые в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, представляют собой носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе: в пероральных формах используются связующие вещества, смазывающие агенты, дезинтеграторы, растворители, разбавители, стабилизаторы, суспендирующие агенты, бесцветные агенты, корригенты вкуса; в формах для инъекций используются антисептические агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы; в местных формах используются основы, разбавители, смазывающие агенты, антисептические агенты.

Предметом данного изобретения является способ получения фармацевтической композиции смешением с инертным наполнителем и/или растворителем, по крайней мере, одного лекарственного начала (субстанции) или средства(адъюванта) общей формулы 1 или его фармацевтически приемлемой соли в терапевтически эффективном количестве.

Для определения селективности взаимодействия к аденозиновому А_2А рецептору проводился радиолигандный анализ взаимодействия соединений общей формулы 1 с аденозиновыми A₁, A_2A, A_2B и А₃ рецепторами.

Радиолигандный анализ взаимодействия соединений общей формулы 1 с аденозиновыми A ₁, A_2A, A_2B и А₃ рецепторами показал их более высокую активность и селективность по отношению к аденозиновому A_2A рецептору, чем у известного прототипа KW-6002 (Таблица 2).

Таблица 2
Активность и селективность некоторых лигандов общей формулы 1 и прототипа KW-6002 в условиях радиолигандного анализа по отношению к аденозиновым A1, A2A, A2B и А3 рецепторам
Лиганд	Активность (Ki, nM) к аденозиновым рецепторам	Селективность к аденозиновому A2A рецептору
	A1	A2A	A2B	А3	A 1/A2A	A2B/A2A	A3/A2A
KW-6002	2,48Е-06	5.64Е-08	1.92Е-06	9.25Е-06	44	34	164
1.1	1.30Е-06	2.58Е-08	4.42Е-06	8.53Е-06	53	99	543
1.6	1.95Е-06	9.38Е-09	7.69Е-06	7.52Е-06	216	474	1323
1.7	3.39Е-06	5.02Е-08	1.52Е-05	1.66Е-05	70	174	546

Предметом данного изобретения являются способ селективного ингибирования активности аденозинового A_2A рецептора, заключающийся в контактировании образца, содержащего аденозиновый A_2A рецептор, с композицией, содержащей антагонист аденозинового A_2A рецептора, представляющий собой соединение общей формулы 1, или его фармацевтически приемлемую соль.

Предметом данного изобретения является лекарственное средство, обладающее антагонистической активностью по отношению к аденозиновому A_2A рецептору, в форме таблеток, капсул иди инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, предназначенное для профилактики и лечения заболеваний центральной нервной системы, в том числе болезни Паркинсона, когнитивных расстройств, депрессий, онкологических, вирусных, бактериальных заболеваний и воспалительных процессов у людей и теплокровных животных, включающее в свой состав новое лекарственное начало (субстанцию) общей формулы 1 или фармацевтическую композицию в терапевтически эффективном количестве.

В соответствии с данным изобретением способ профилактики и лечения заболеваний, опосредованных действием антагониста A_2A рецептора, в том числе заболеваний центральной нервной системы, онкологических заболеваний, воспалительных процессов и сепсиса у животных и людей заключается во введении пациенту нового лекарственного средства или новой фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве.

Лекарственные средства могут вводиться перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местно. Клиническая дозировка средства общей формулы 1 у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 10 ~ 500 мг, предпочтительно - 50 ~ 300 мг. Поэтому во время приготовления из фармацевтической композиции лекарственного средства по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единица дозировки препарата должна содержать 10 ~ 500 мг средства общей формулы 1, предпочтительно - 50 ~ 300 мг. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени (предпочтительно - от одного до шести раз).

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Синтез соединений общей формулы 1. К раствору 1 ммоль (198 мг) 1,3-диэтил-5,6-диаминоурацила 2 и 15 ммоль кислоты 3 в 8 мл диметилформамида добавляли 1,5 ммоль (372 мг) о-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N`,N`-тетрагидроурония тетрафторбората. Смесь перемешивали ночь при комнатной температуре, выливали в воду, экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали водой, высушивали над безводным сульфатом натрия, упаривали досуха. Остаток хроматографировали на силикагеле смесью дихлорметана с метанолом. Получали с выходом 26-92% амид 4, который (0,1 ммоль) суспендировали в 8 мл метанола, добавляли 8 мл 4N водного раствора гидроксида натрия. Смесь перемешивали 1,5 часа при 80-90°С. Охладили, нейтрализовали 18% водным раствором соляной кислоты до рН 7-8. Выпавший осадок отфильтровали и получали пурин 5 с выходом 40-90%. Полученный пурин 5 (0,44 ммоль), 4 мл диметилформамида, 132 г (1 ммоль) прокаленного карбоната калия и 2,2 ммоль йодистого метила перемешивали 2 часа при 70°С. Охлаждали, добавляли воду, отфильтровали выпавший осадок, который растворяли в подходящем растворителе, полученный раствор фильтровыли через слой силикагеля, а полученный фильтрат упаривали в вакууме. Получали с выходом 30-70% пурина общей формулы 1. Результаты анализов некоторых пуринов общей формулы 1 представлены в таблице 3.

Таблица 3
№ соед.	1Н ЯМР спектры	LC MS (M+1)
1.1	1Н ЯМР DMSO-D6, 400 МГц) 7,90 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 7,43 (д, J=2,4 Гц, 1Н), 7,31 (д, J=16 Гц, 1Н), 7,01 (д, J=8,8 Гц, 1Н), 6,93 (дд, J1 =8,8 Гц, J2=2,4 Гц, 1Н), 4,05 (к, J=7,2 Гц, 2Н), 4,02 (с, 3Н), 3,90 (к, J=6,4 Гц, 2Н), 3,83 (с, 3Н), 3,78 (с, 3Н), 1,25 (т, J=6,8 Гц, 3Н), 1,12 (с, 3Н).	385
1.2	1Н ЯМР DMSO-D6, 400 МГц) 7,60 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 7,41 (с, 1Н), 7,27 (д, J=7,2 Гц, 1Н), 7,20 (д, J=16 Гц, 1Н), 6,97 (д, J=8,4 Гц, 1Н), 4,05 (к, J=6,8 Гц, 2Н), 4,02 (с, 3Н), 3,92 (к, J=7,2 Гц, 2Н), 3.85 (с, 3Н), 3,76 (д, J=6,8 Гц, 2Н), 2,03 (сеп, J=6,4 Гц, 1Н), 1,25 (т, J=6,8 Гц, 3Н), 1,12 (т, J=6,4 Гц, 3Н), 0,98 (д, J=6,8 Гц, 6Н).	427
1.4	1Н ЯМР DMSO-D6, 400 МГц) 7,77 (д, J=16 Гц, 1Н), 7,54 (м, 1Н), 6,98 (м, 1Н), 6,81 (д, J=17,2 Гц, 1Н), 4,05 (м, 2Н), 3,99 (с, 3Н), 3,90 (м, 2Н), 2,34 (с, 3Н), 1,25 (м, 3Н), 1,12 (м, 3Н)	345
1.5	1Н ЯМР DMSO-D6, 400 МГц) 8,11 (с, 1Н), 7,46 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 6,79 (д, J=15,6 Гц, 1Н), 4,05 (к, J=6,8 Гц, 2Н), 3,94 (с, 3Н), 3,90 (к, J=7,2 Гц, 2Н), 3,78 (с, 3Н), 2,29 (с, 3Н), 1,24 (т, J=6,8 Гц, 3Н), 1,12 (т, J=6,8 Гц, 3Н).	343
1.6	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,69 (д, J=15,6 Гц, 1Н); 7,15 (дд, J1=8,3 Гц, J2=1,8 Гц, 1Н); 7,13 (д, J=1,9 Гц, 1Н); 7,05 (д, J=8,3 Гц, 1H); 6,76 (д, J=15,6 Гц, 1Н); 4,91 (м, 1Н); 4,45 (м, 2Н);	441
	4,23 (к, J=7,0 Гц, 2Н); 4,09 (к, J=7,0 Гц, 2Н); 4,04 (с, 3Н); 3.85 (с, 3Н); 1,39 (т, J=7,0 Гц, 3Н); 1,27 (т, J=7,0 Гц, 3Н)
1.7	1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) 7,68 (д, J=16,0 Гц, 1Н); 7,17 (с, 1Н); 7,13 (д, J=8,8 Гц, 1Н); 6,97 (д, J=7,8 Гц, 1Н); 6,77 (д, J=15,6 Гц, 1Н); 6,59 (д, J=2,4 Гц, 1Н); 4,74 (д, J=5,9 Гц, 1Н); 4,59 (д, J=11,5 Гц, 1Н); 4,22 (к, J=6,7 Гц, 2Н); 4,09 (к, J=6,9 Гц, 2Н); 4,04 (с, 3Н); 2,92 (д, J=4,6 Гц 3Н); 1,39 (т, J=7,0 Гц, 3Н); 1,25 (т, J=7,0 Гц, 3Н).	440
1.8	1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) 7,17 (с, 1Н); 7,13 (д, J=8,8 Гц, 1Н); 6,97 (д, J=7,8 Гц, 1Н); 6,77 (д, J=15,6 Гц, 1Н); 6,59 (д, J=2,4 Гц, 1Н); 4,74 (д, J=5,9 Гц, 1Н); 4,59 (д, J=11,5 Гц, 1Н); 4,22 (к, J=6,7 Гц, 2Н); 4,09 (к, J=6,9 Гц, 2Н); 4,04 (с, 3Н); 3,18 (с, 3Н); 2,99 (с, 3Н); 1,39 (т, J=7,0 Гц, 3Н); 1,25 (т, J=7,0 Гц, 3Н).	454
1.9	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7.32 (с, 1Н); 7,10 (д, J1 =8,3 Гц, 1Н); 6,95 (д, J=1,9 Гц, 1Н); 6,92 (д, J=8,3 Гц, 1Н); 5,13 (д, J=1,9 Гц, 1Н); 4,15 (д, J=1,9 Гц, 2Н); 4,03 (д, J=1,9 Гц, 2Н); 4,01 (д, J=1,9 Гц, 2Н); 4,0 (с, 3Н) 3,51 (д, J=5,4 Гц, 2Н); 3,53 (д, J=4,7 Гц, 2Н); 1,20 (д, J=7,4 Гц, 3Н); 1,22 (д, J=7,7 Гц, 3Н); 1,13 (д, J=7,4 Гц, 3Н); 1,16(д, J=7,7 Гц, 3Н).	482
1.10	1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7.32 (с, 1Н); 7,10 (д, J,=8,3 Гц, 1Н); 6,95 (д, J=1,9 Гц, 1Н); 6,92 (д, J=8,3 Гц, 1Н); 5,13 (д, J=1,9 Гц, 1Н); 4,15 (д, J=1,9 Гц, 2Н); 4,03 (д, J=1,9 Гц, 2Н); 4,01 (д, J=1,9 Гц, 2Н);4,0 (с, 3Н) 3,68 (м, 1Н); 3,34 (м, 2Н); 3,35 (м, 2Н); 2,88 (м, 2Н); 2,90 (м, 2Н); 1,20 (д, J=7,4 Гц, 3Н); 1,22 (д, J=7,7 Гц, 3Н)	495
1.11	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7.32 (с, 1Н); 7,10 (д, J1 =8,3 Гц, 1Н); 6,95 (д, J=1,9 Гц, 1Н); 6,92 (д, J=8,3 Гц, 1Н); 5,13 (д, J=1,9 Гц, 1Н); 4,15 (д, J=1,9 Гц, 2Н); 4,03 (д, J=1,9 Гц, 2Н); 4,01 (д, J=1,9 Гц, 2Н); 4,0 (с, 3Н); 3,34 (м, 2Н); 3,35 (м, 2Н); 2,88 (м, 2Н); 2,90 (м, 2Н); 2,25 (с, 1Н); 1,20 (д, J=7,4 Гц, 3Н); 1,22 (д, J=7,7 Гц, 3Н).	509
1.12	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 2,98 (м, 3Н); 2,96 (м, 3Н); 1,25 (д, J=7,45 Гц, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н).	460
1.13	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,36 (м, 4Н); 1,25 (д, J=7,45 Гц, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н); 1,16 (м, 6Н).	488
1.14	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1H); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,22 (м, 4Н); 2,03 (м, 4Н); 1,25 (д, J=7,45 Гц, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н).	486
1.15	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,08 (м, 4Н); 1,52 (м, 4Н); 1,46 (м, 1Н); 1,25 (д, J=7,45 Гц, ЗН); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н).	500
1.16	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,66 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 3,59 (д, J=3,87 Гц, 2Н); 3,26 (д, J=4,64 Гц, 2Н); 3,24 (д, J=4,87 Гц, 2Н); 1,25 (д, J=7,45 Гц, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н).	502
1.17	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц. 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,36 (м, 4Н); 3,13 (м, 4Н); 2,66 (м, 1Н); 1,25 (д, J=7,45 Гц, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н).	501
1.18	1Н ЯМР (CDCl 3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4.00 (с, 3Н); 3,65 (с, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н); 1,16 (м, 6Н).	447
1.19	1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,93 (с, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н); 1,16 (м, 6Н).	447
1.20	1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0.6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,70 (с, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н); 1,16 (м, 6Н).	447
1.21	1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0.3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,70 (с, 3Н); 3,60 (с, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н); 1,16 (м, 6Н).	477
1.22	1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,95 (с, 3Н); 3,70 (с, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н); 1,16 (м, 6Н).	477
1.23	1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) 7,35 (м, 1Н); 7,33 (д, J=1,6 Гц, 1Н); 7,28 (м, 1Н); 7,20 (м, 1Н); 7,14 (с, 1Н); 6,85 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,83 (д, J=0,6 Гц, 1Н); 6,81 (д, J=1,2 Гц, 1Н); 6,17 (д, J=0,3 Гц, 1Н); 6,03 (с, 1Н); 4,04 (д, J=3,64 Гц, 2Н); 4,02 (д, J=3,71 Гц, 2Н); 4,00 (с, 3Н); 3,70 (с, 3Н); 2,75 (с, 3Н); 2,82 (с, 3Н); 1,22 (д, J=7,36 Гц, 3Н); 1,16 (м, 6Н).	490

Пример 3. Изучение антагонистической активности соединений общей формулы 1 и их фармацевтически приемлемых солей по отношению к аденозиновому A_2A рецептору. Антагонистическую активность новых соединений общей формулы 1 и их фармацевтически приемлемых солей по отношению к аденозиновому A_2A рецептору проводили ex vitro в функциональном тесте на клетках. В эксперименте использовали клетки линии ValiScreen cell line (PerkinElmer, США), экспрессирующей рекомбинантный человеческий аденозиновый рецептор типа A _2A. При стимуляции рецепторов в этих клетках агонистом CGS 21680 (Tocris) активируется аденилатциклаза, что, в свою очередь, приводит к увеличению синтеза внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Количество цАМФ определялось с помощью технологии LANCE (LANCE Ultra cAMP kit, PerkinElmer). По способности испытуемых соединений снижать количество цАМФ, синтезируемого в присутствии CGS 21680, оценивали их антагонистическую активность. В качестве стандарта (соединения сравнения) использовали описанный в литературе антагонист K.W 6002 (Axon Medchem, Netherlands).

Клетки культивировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавками 10% FBS (Biological Industries), смеси пенициллин/стрептомицина (ПанЭко) и G418 (Sigma) при температуре 37°С в атмосфере 5% CO₂. Перед экспериментом клетки снимали с культурального флакона раствором Версена (ПанЭко) и суспендировали в буфере SB2 (среда Хэнкса + 5 мМ HEPES (рН 7,4) + 0,1% BSA + 200 uM Ro-20-1734 + 2U/mL ADA (adenosine deaminase)) до плотности 0,2 миллиона клеток в миллилитре. К клеточной суспензии добавляли 1:150 (по объему) ULight -anti-cAMP Antibody (PerkinElmer) и эту смесь разливали в белые 384-луночные планшеты (PerkinElmer) по 5 мкл (1000 клеток) в каждую лунку.

Тестируемые соединения растворяли в ДМСО до концентрации 6.32 мМ и готовили 3.16-кратные серийные разведения в ДМСО. Приготовленные серийные разведения разбавляли в 50 раз буферным раствором SB1 (среда Хэнкса + 5 мМ HEPES (рН 7,4) + 0,1% BSA). Полученные растворы соединений в SB1 буфере смешивали в пропорции 1:1 с раствором CGS 21680 (12.64 нМ), предварительно приготовленным в буфере SB3 (SB1 + 0.1% Pluronic F127). Полученные смеси испытуемых соединений с агонистом добавляли (по 5 мкл в дупликатах) в лунки плашки, содержащие по 5 мкл клеток (как описано выше) и плашки инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Каждая плашка содержала также по 16 лунок для каждого контроля (МАКС и МИН). МАКС - клетки с 3.16 нМ CGS 21680 (концентрация агониста, соответствующая ЕС₉₀, то есть концентрации, вызывающей 90% актвность клеток); сигнал от этих лунок использовался в расчетах как 100% активность (0% ингибирования). МИН - клетки со смесью 3.16 нМ CGS 21680 и 2 мкМ KW 6002 (концентрация антагониста, соответствующая IC₁₀₀, то есть концентрации, вызывающей 100% подавление актвности клеток); сигнал от этих лунок использовался в расчетах как 0% активность (100% ингибирования). Кроме этого, каждая плашка содержала лунки (в 4-х повторах), где клетки обрабатывались агонистом (CGS 21680) при разных его концентрациях. Конечная концентрация ДМСО во всех лунках равнялась 1%.

Образующийся в клетках цАМФ определяли количественно при помощи набора LANCE Ultra cAMP kit (PerkinElmer, США), в соответствии с методикой, рекомендованной производителем. Флуоресцентный сигнал измеряли на приборе Victor3V (PerkinElmer), снабженном встроенной программой для измерения LANCE High Count. Кажущееся сродство тестируемых соединений определяли по формуле:

,

где IC₅₀ - концентрация антагониста, при которой активность аденилатциклазы составляет 50% от максимальной, L - концентрация CGS 21680, при которой проводятся измерения (3.16 nM) и K_D - кажущаяся константа сродства CGS 21680, количественно соответствующая величине EC₅₀ (концентрация полумаксимальной стимуляции клеток) для CGS 21680 и определенная по кривым стимуляции накопления цАМФ в клетках при разных концентрациях агониста. В таблице 1 представлены данные по активности К_i некоторых представителей соединений общей формулы 1.

Пример 4. Радиолигандный анализ взаимодействия соединений общей формулы 1 с аденозиновыми A ₁, A_2A, A_2B и А₃ рецепторами. Радиолигандный анализ взаимодействия соединений общей формулы 1 с аденозиновыми A₁, A_2A, A_2B и А₃ рецепторами проводили для определения селективности взаимодействия соединений общей формулы 1 с аденозиновым A _2A рецептором. При определении взаимодействия исследуемых соединений с аденозиновым A_2A рецептором использовали мембранные препараты, полученные из эмбриональных клеток почек человека, экспрессирующих рекомбинантный человеческий A_2A рецептор. Экспрессия рецептора составляла 7 пмоль/мг белка. В качестве радиолиганда использовали [³H]CGS 21680 при концентрации 0.05 мкМ. Растворы испытуемых соединений готовили так же, как описано в процедуре для функционального теста, с тем различием, что вместо среды SB1 использовали буфер следующего состава: 50 mM Tris-HCl, рН 7.4, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 2 U/mL Adenosine Deaminase. Мембранные препараты инкубировали в присутствии смеси тестируемых соединений и [³H]CGS 21680 в течение 90 мин при 25°С и смеси фильтровали на стекломикроволоконных фильтрах GF (Millipor, USA). Радиоактивность на фильтрах определяли с помощью жидкостинцилляционного счетчика MicroBeta (PerkinElmer, USA). Неспецифическое связывание измеряли в присутствии 50 мкМ NECA, которое составляло не более 15% от общего связывания. Сродство тестируемых соединений определяли по формуле

где IC₅₀ - концентрация антагониста, при которой связывание [³H]CGS 21680 снижается до 50% от максимального, L - концентрация [³H]CGS 21680, при которой проводятся измерения (50 пМ) и K_D - константа сродства [³H]CGS 21680, количественно соответствующая величине ЕС₅₀ (концентрация полумаксимального связывания) для [³H]CGS 21680, и определенная по кривым радиоактивного связывания при разных концентрациях [³H]CGS 21680 (K_D=64 нМ).

Аналогично исследовали взаимодействия новых соединений общей формулы 1 с аденозиновыми A₁, A_2B и А₃ рецепторами в условиях, представленных ниже.

Таблица 4
Рецептор	200510 Adenosine A1	200610 Adenosine A2A
Клетки	Human recombinant CHO cells	Human recombinant HEK-293 cells
Радиолиганд	1 nM [ 3H] DPCPX	0.05 µМ [.H] CGS-21680
Среда	1% DMSO	1% DMSO
Инкубационное время/температура	90 minutes @ 25.С	90 minutes @ 25.C
Инкубационный буфер	20 mM HEPES, рН 7.4, 10 mM MgCl., 100 mM NaCl	50 mM Tris-HCl, рН 7.4, 10 mM MgCl, 1 mM EDTA, 2 U/mL Adenosine Deaminase
Неспецифический лиганд:	100 µM R(-)-PIA	50 µM NECA
	1.4 nM*	0.064 ÙM*
ВМАХ	2.7 pmole/mg Protein*	7 pmole/mg Protein*
Специфическое связывание	85%*	85%*
Количественный метод	Radioligand Binding	Radioligand Binding
Значимость критерия	>50% of max stimulation or inhibition	>50% of max stimulation or inhibition

Таблица 5
Рецептор	200510 Adenosine A2B	200610 Adenosine А3
Клетки	Human recombinant HEK-293 cells	Human recombinant CHO-K1 cells
Лиганд	1.6 nM [.H] MRS1754	0.5 nM [ I] AB-MECA
Среда	1% DMSO	1% DMSO
Инкубационное время/температура	90 minutes @ 25.С	60 minutes @ 25.С
Инкубационный буфер	50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 5 тМ MgCl., 1 mM EDTA, 0.01% Bacitracin	25 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgCl., 1 mM CaCl., 0.1% BSA
Неспецифический лиганд:	100 ÙM NECA	1 ÙM IB-MECA
	0.77 nM*	5.9 nM*
ВМАХ	6.2 pmole/mg Protein*	1.8 pmole/mg Protein*
Специфическое связывание	77%*	83%*
Количественный метод	Radioligand Binding	Radioligand Binding
Значимость критерия	>50% of max stimulation or inhibition	>50% of max stimulation or inhibition

Радиолигандный анализ взаимодействия соединений общей формулы 1 с аденозиновыми A₁, A_2A , A_2B и А₃ рецепторами показал их высокую селективность по отношению к аденозиновому A_2A рецептору (Таблица 2).