устойчивость к физиологическим нарушениям в салате

Формула изобретения

1. Способ скрининга популяции растений листовых овощей, принадлежащих к роду Lactuca, в частности к видам Lactuca sativa, на присутствие в ней особей, обнаруживающих пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, таким как бурая пятнистость и пожелтение, по сравнению с контрольным растением, который включает:

a) получение популяции семян;

d) проращивание семян в темноте и в присутствии этилена для получения сеянцев;

c) отбор сеянцев, которые обнаруживают более длинные гипокотили, чем гипокотили чувствительного к этилену контроля;

а) самоопыление отобранных сеянцев для получения семян;

e) проращивание одной части семян, полученных от каждого отобранного сеянца, в темноте и в присутствии этилена и другой части семян от каждого отобранного сеянца в темноте в среде воздуха; и

f) измерение относительного роста гипокотилей сеянцев, пророщенных в среде с этиленом в сравнении с ростом гипокотилей сеянцев, пророщенных в среде воздуха для того, чтобы отличить растения, имеющие более длинный гипокотиль по сравнению с исходным чувствительным к этилену контролем и в среде с этиленом и в среде воздуха, от растений, которые имеют более длинный гипокотиль по сравнению с исходным чувствительным к этилену контролем только в среде с этиленом; и

g) тестирование растений, идентифицированных как обнаруживающие пониженную чувствительность к этилену на их устойчивость к бурой пятнистости и/или пожелтению,

где растения, которые имеют более длинный гипокотиль по сравнению с исходным чувствительным к этилену контролем только в среде с этиленом, идентифицируют как растения, обнаруживающие пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, к таким как бурая пятнистость или пожелтение.

2. Способ по п.1, в котором популяция растений выбрана из популяции мутантных растений, коллекции зародышевой плазмы или популяции трансгенных растений.

3. Способ по п.2, в котором популяция мутантных растений получена посредством мутагенной обработки с использованием химических веществ и/или облучения.

4. Способ по п.1, в котором концентрация этилена на стадии b) составляет по меньшей мере 10 мкг/л, предпочтительно от 11 до 25 мкг/л.

5. Способ по п.1, в котором концентрация этилена на стадии d) составляет приблизительно 4-5 мкг/л.

6. Растение рода Lactuca, в частности видов Lactuca sativa, обнаруживающее пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, таким как бурая пятнистость и пожелтение, по сравнению с контрольным растением, причем это растение имеет в своем геноме генетическую информацию, ответственную за пониженную чувствительность к физиологическим нарушениям бурая пятнистость и пожелтение, и которая является такой, как обнаруживаемая в геноме растения, перечисленного в Таблице 1, семя которого имеет номер доступа в NCIMB NCIMB 41449, NCIMB 41450, NCIMB 41448, NCIMB 41451, NCIMB 41452 или NCIMB 41453, полученное в результате мутагенеза, которому растение было искусственно подвергнуто.

7. Растение по п.6, которое может быть получено посредством скрещивания растения, семя которого депонировано в NCIMB 3 января 2007 и которому присвоен номер доступа в NCIMB NCIMB 41449, NCIMB 41450, NCIMB 41448, NCIMB 41451, NCIMB 41452 или NCIMB 41453, с другим растением того же вида.

8. Часть растения по п.6 или 7, причем часть растения обнаруживает пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, таким как бурая пятнистость и пожелтение.

9. Часть по п.8, выбранная из головок, листьев, молодых листьев, обработанных головок, нарезанных листьев.

10. Семя растения по любому из пп.6 и 7, причем растение обнаруживает пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, таким как бурая пятнистость и пожелтение.

11. Листовой салат, который обнаруживает пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, таким как бурая пятнистость и пожелтение, причем это растение имеет в своем геноме генетическую информацию, ответственную за пониженную чувствительность к физиологическим нарушениям бурая пятнистость и/или пожелтение, и которая является такой, как обнаруживаемая в геноме растения, перечисленного в Таблице 1, семя которого имеет номер доступа в NCIMB NCIMB 41449, NCIMB 41450, NCIMB 41448, NCIMB 41451, NCIMB 41452 или NCIMB 41453, полученный в результате мутагенеза, которому растение было искусственно подвергнуто.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Изобретение относится к способу скрининга популяции растений на присутствие в ней особей, измененных по отношению к их виду реакции на этилен. Изобретение дополнительно относится к растениям и частям растения, в частности к листовым овощам, идентифицированным таким образом. Более конкретно это изобретение относится к салату (Lactuca sativa L.), обнаруживающему измененную реакцию на этилен, которая приводит к пониженной чувствительности этого вида урожая к физиологическим нарушениям, таким как Бурая Пятнистость и Пожелтение. Изобретение также относится к семенам и потомству этих растений и частей растений.

Уровень техники

Размножение листовых овощей, таких как салат, нацелено на получение коммерческих сортов, оптимально приспособленных для получения рыночных продуктов. Во время отбора необходимо принимать во внимание многие характеристики, которые относятся к обоим входным и выходным признакам. Один из самых важных признаков в этом отношении относится к послеуборочному качеству, в частности к сроку хранения. Избегание физиологических нарушений и, более конкретно, Бурой Пятнистости и Пожелтения является важными элементами, которые могут продлить срок хранения урожая салата или его частей.

Этилен является растительным гормоном, в целом, известным для стимуляции физиологических процессов, связанных со старением. В салате эта стимуляция становится очевидной через образование признаков, таких как Бурая Пятнистость и Пожелтение.

Нарушение Бурой Пятнистости характеризуется появлением темных пятен вдоль центральных жилок листьев, тогда как Пожелтение является общим обесцвечиванием листьев, которое появляется во время старения, как следствие разрушения хлорофилла.

Хотя известно, что зрелые головки салата образуют только небольшое количество этилена, растения очень чувствительны к этому растительному гормону. Поэтому физиологические нарушения, связанные с чувствительностью к этилену, которые снижают послеуборочное качество салата, главным образом вызваны внешними источниками этилена. Воздействие таких внешних источников может иметь место во время сбора урожая, обработки и хранения продукта.

Например, когда салат транспортируют или хранят вблизи от фруктов, образующих этилен, таких как яблоки, груши или персики, может произойти серьезное ухудшение. Более того, когда салат обработан и находится в виде упакованных свежесобранных смесей, могут быть ограничения относительно ингредиентов, которые могут быть применены из-за выделения этилена одним или более ингредиентов.

Бурая Пятнистость является физиологическим нарушением, которое проявляется посредством появления многочисленных темных пятен вдоль центральной жилки листа. Признаки потемнения могут распространиться по всему листу во время прогрессивных стадий нарушения. Известно, что Бурая Пятнистость появляется особенно, когда зрелые головки салата хранят при более низких температурах (5°C) в присутствии низких концентраций (уровень промилле) этилена.

Образованию признаков можно противодействовать путем применения растительного гормона ауксина или кальция. Более того, модифицированные атмосферы, содержащие низкие уровни кислорода, снижают скорость развития признаков.

На биохимическом уровне Бурая Пятнистость, по-видимому, развивается как следствие локальной стимуляции биосинтеза лигнина, который вызывает лигнификацию и утолщение клеточных стенок вокруг площади листа, где появляются визуальные признаки.

Нарушение окраски в виде потемнения вызвано стимуляцией фенольного метаболизма. Фермент фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL), который, как показано, индуцируется этиленом, катализирует первую протекающую стадию фенилпропаноидного пути. Фенольные соединения, которые образуются в основном, включают производные кофейной кислоты, так же как многие флавоноиды, такие как (+) катехин и (-) эпикатехин. Последующее окисление этих соединений полифенол-оксидазой (PPO) приводит к нарушению окраски в виде потемнения, типично наблюдаемому при Бурой Пятнистости. Наконец, признаки могут стать более серьезными вследствие разрушения ткани и отмирания клеток.

Старение является естественно протекающим процессом развития в конце жизненного цикла растения или растительного органа, в течение которого метаболизм перепрограммируется для ремобилизации ресурсов в репродуктивные структуры, такие как семена. Хотя старение является процессом развития, вызванным эндогенными факторами, такими как физиологический возраст, существует много внешних факторов, которые могут модулировать старение.

Пожелтение листьев, являющееся наиболее видимым признаком старения, является следствием разрушения хлорофилла в течение относительно поздней стадии старения, которое может быть усилено этиленом, если лист восприимчив. Другими известными стимулирующими факторами старения являются повреждение, темнота и дефицит питания. Хотя этилен является самым важным растительным гормоном, известным для стимуляции старения, другие гормоны, такие как жасмонат, могут также способствовать этому процессу.

С момента сбора урожая салата до момента потребления продукт может быть подвергнут воздействию различных внешних факторов, способствующих старению. Это могут быть повреждение во время сбора урожая и обработки, темнота и дефицит питания во время хранения и этилен во время обработки и хранения. Эти факторы сильно стимулируют послеуборочные нарушения, которые могут стать очевидными в виде Бурой Пятнистости и Пожелтения. Хотя эти эффекты в значительной степени являются косметическими, продукт становится намного менее привлекательным и, таким образом, нерыночным.

Чтобы противостоять ухудшающим эффектам, может быть принято множество послеуборочных мер, которые снижают эти эффекты. Например, можно хранить собранный салат при низких температурах, чтобы задержать старение. Хотя это может снизить скорость Пожелтения, Бурая Пятнистость может быть увеличена. Кроме того, могут быть осуществлены логистические меры, снижающие требуемое время транспортировки от поля до потребителя или предотвращающие хранение салата поблизости от этиленового источника. Более того, могут быть использованы химические обработки, которые предотвращают послеуборочное ухудшение, хотя очевидно становятся проблемой безопасность пищевых продуктов и принятие потребителем.

Многие из этих послеуборочных мер успешны до некоторой степени, но, конечно, остается потребность в усовершенствованиях. Более того, вовлеченные затраты могут быть существенными, что является еще одной причиной для изучения альтернатив, снижающих потребность в применении послеурожайных обработок. Предпочтительно, найдено генетическое решение, которое снижает или избавляет от необходимости применять дорогие, профилактические меры, применяемые в настоящее время для поддержания послеуборочного качества на высоком уровне.

Целью настоящего изобретения является разработка способа скрининга, позволяющего идентифицировать нечувствительные к этилену растения. Дополнительной целью изобретения является получение растений, получаемых этим способом.

Эту цель достигают согласно изобретению способом скрининга популяции растений на присутствие в ней особей, обнаруживающих пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, в частности к Бурой Пятнистости и Пожелтению, по сравнению с контрольным растением, который включает:

a) получение популяции семян;

b) проращивание семян в темноте и в присутствии этилена для получения сеянцев;

c) отбор сеянцев, обнаруживающих более длинные гипокотили, чем гипокотили чувствительного к этилену контроля;

d) самоопыление отобранных сеянцев для получения семян;

e) проращивание одной части семян, полученных от каждого отобранного сеянца в темноте и в присутствии этилена, и другой части семян от каждого отобранного сеянца в темноте в среде воздуха; и

f) измерение относительного роста гипокотилей сеянцев, проросших в среде с этиленом в сравнении с ростом гипокотилей сеянцев, проросших в среде воздуха для того, чтобы отличить растения, имеющие более длинный гипокотиль по сравнению с исходным чувствительным к этилену контролем и в среде этила, и в среде воздуха, от растений, имеющих более длинный гипокотиль по сравнению с исходным чувствительным к этилену контролем только в среде с этиленом, где растения, имеющие более длинный гипокотиль по сравнению с исходным чувствительным к этилену контролем только в среде с этиленом, идентифицируют как растения, обладающие пониженной чувствительностью к этилену и физиологическим нарушениям, в частности к Бурой Пятнистости или Пожелтению.

Изобретение основано на гипотезе, что нечувствительные к этилену растения, в частности салат, будут устойчивыми к послеуборочным физиологическим нарушениям, таким как Бурая Пятнистость и Пожелтение.

В предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает дополнительную стадию тестирования растений, идентифицированных в предыдущих стадиях как обладающих пониженной чувствительностью к этилену, на их устойчивость к Бурой Пятнистости и/или Пожелтению.

Длину гипокотиля и длину корня можно рассматривать в сравнении со стандартом и оценивать от 1, что означает равную чувствительному к этилену стандартному сорту в среде с этиленом, до 3, что означает равную чувствительному к этилену стандартному сорту в среде воздуха. По желанию, измерения могут быть выполнены в миллиметрах. С использованием одного из этих измерений могут быть выполнены простые статистические исследования, такие как t-критерий, известные специалисту в области техники для установления, является ли растение или группа растений значительно менее чувствительными к этилену, чем чувствительный к этилену стандарт, такой как Troubadour (Rijk Zwaan, De Lier, NL). Применяемый уровень значимости одностороннего критерия составляет 0,001.

Для мутантов статистическое сравнение, предпочтительно, проводят между длинами гипокотилей и необязательно длинами корней исходного сорта, использованного для мутагенной обработки, который является самым лучшим доступным стандартом, и длинами гипокотилей и корней мутантных особей и/или их потомства.

Для обнаружения нечувствительных к этилену растений в существующем растительном материале выбирают один или более представительных образцов сортов, генеалогических линий и/или зарегистрированных образцов банка генов. Тогда статистическое сравнение соответственно проводят между длинами гипокотилей и корней особи исследуемого зарегистрированного образца и остальной части популяции. Для статистического анализа особей на значимо более длинные гипокотили и/или корни могут понадобиться критерии множественного сравнения для поддержания надлежащих общих уровней значимости, например критерий множественного сравнения Даннета с одним стандартом (Dunnett, CW, J. Amer. Statist. Assoc. 50:1096-1121 (1955)).

Скринируемые растения являются обычно листовыми овощными растениями, в частности, принадлежащими к роду Lactuca и в особенности видам Lactuca sativa.

Популяция растений предпочтительно является популяцией мутантных растений, поскольку вероятность обнаружить растение по изобретению в такой изменчивой популяции выше. Однако любая другая популяция растений, отличающихся по своей генетической структуре, может быть скринирована согласно изобретению.

Популяцию мутантных растений предпочтительно получают мутагенной обработкой с использованием химических веществ и/или облучения. Мутагенные обработки известны и будут дополнительно описаны ниже в настоящем описании.

Концентрация этилена в стадии b) составляет по меньшей мере 10 мг/л, предпочтительно от 11 до 25 мг/л. Концентрация этилена в стадии d) составляет приблизительно 4-5 мг/л.

Стадия отбора в способе скрининга по изобретению основана на удлинении гипокотилей. Воздействие этилена на выращиваемых в темноте прорастающих сеянцев вызывает радиальное набухание гипокотиля и подавление роста гипокотиля и корня. Это явление, главным образом, относят к тройной реакции (см., например, Guzman, P&Ecker, J, Plant Cell 2:513-523 (1990)). Воспроизводимость этой реакции позволяет скринировать мутантов, которые обнаруживают измененную тройную реакцию в присутствии или отсутствии этилена. В дополнение к или вместо измерения удлинения гипокотилей отбор по изобретению может быть основан на одном или более других элементах теста на тройную реакцию.

Согласно своему дополнительному аспекту, изобретение относится к растениям, обнаруживающим пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, в частности к Бурой Пятнистости и Пожелтению, по сравнению с контрольным растением, которые могут быть получены путем проведения скрининга популяции семян растения способом по изобретению и отбора растений из популяции, обнаруживающих более длинные гипокотили по сравнению с чувствительным к этилену контролем, таких как растения, обнаруживающие пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, в частности к Бурой Пятнистости или Пожелтению.

Растение по изобретению, предпочтительно, является листовым овощным растением, в частности растением, принадлежащим к роду Lactuca и, в частности, к виду Lactuca sativa.

Нечувствительные к этилену мутанты были идентифицированы и отобраны способом скрининга по изобретению. Семена этих мутантов были депонированы в NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA UK 3 января 2007 и им были присвоены номера доступа, как перечислено в Таблице 1. Детали о происхождении семян депозитов даны в Примере 3 и в Примере 4. Эти депозиты были сделаны, поскольку они имеют один специфический признак значительно пониженной чувствительности к этилену. Они не были тестированы на DUS-критерии для регистрации сорта, т.е. различимости, однородности, устойчивости по всем регистрационным признакам, и в любом случае не ожидается, что они удовлетворят этим критериям.

Таблица 1
Растение №	Внутренняя ссылка (=NCIMB ссылка)	Номер доступа NCIMB
00D.7856	07D.826509	41449
00D.6876	07D.826514	41450
00D.7871	07D.826502	41448
00D.6883	07D.826522	41451
00D.6896	07D.826540	41452
00D.7845	07D.826542	41453

Изобретение дополнительно относится к растениям, обнаруживающим пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, в частности Бурой Пятнистости или Пожелтению, и которые могут быть получены путем скрещивания растения по изобретению с другим растением того же вида. Признак "пониженная чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, в частности Бурой Пятнистости или Пожелтению" может быть принесен, таким образом, в другие растения, исходно не имевшие этого признака. Являются ли растения, получаемые из такого скрещивания, в действительности растениями по изобретению, может быть определено путем проведения скрининга этих растений способом по изобретению.

Изобретение дополнительно относится к потомству родительского растения по изобретению, обнаруживающего пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, в частности Бурой Пятнистости или Пожелтению. Такое потомство может быть отдалено от родителя на много поколений. Растение потомства является растением по изобретению при условии присутствия признака "пониженной чувствительности к этилену и физиологическим нарушениям, в частности Бурой Пятнистости или Пожелтению".

Изобретение дополнительно относится к частям растений по изобретению. Частями растений являются, например, головки салата или листья, такие как молодые листья, обработанные головки или нарезанные листья.

Части растений по изобретению могут быть использованы в тканевой культуре для регенерации растений, обладающих пониженной чувствительностью к этилену и физиологическим нарушениям, в частности Бурой Пятнистости или Пожелтению, как обнаружено в растении, из которого получена ткань для тканевой культуры. Такие регенерированные растения также являются частью этого изобретения.

Изобретение дополнительно относится к семени растения по изобретению. От семени могут быть выращены растения, которые также имеют признак "пониженной чувствительности к этилену и физиологическим нарушениям, в частности к Бурой Пятнистости или Пожелтению". Сохранили ли семена и выращенные из них таким образом растения признак, может быть определено способом скрининга по изобретению. Изобретение также относится к дополнительному поколению семян, сохранившему пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, в частности Бурой Пятнистости или Пожелтению, как обнаружено в исходным семенах.

Согласно своему дополнительному аспекту изобретение относится к овощному продукту, включающему растение или его часть по изобретению. Предпочтительно, овощ является листовым овощем, более конкретно овощ является салатом.

В результате скрининга способом по изобретению овощной продукт обнаруживает пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, в частности Бурой Пятнистости или Пожелтению.

Следует указать, что способ скрининга по изобретению является относительно простым способом. Растения по изобретению, обнаруживающие пониженную чувствительность к этилену и физиологическим нарушениям, в частности Бурой Пятнистости или Пожелтению, могут быть идентифицированы в любой изменчивой популяции, которая является достаточно большой. Для воспроизведения изобретения и растений по изобретению не требуется проведения неправомерных экспериментов, поэтому растения изобретения не должны быть интерпретированы как ограниченные депонированными растениями.

Вследствие своей нечувствительности к этилену растительный материал салата и семена, получаемые из него, по изобретению, обнаруживают сильное повышение в отношении их послеуборочного качества особенно в связи с явлениями, связанными со старением, такими как Бурая Пятнистость и Пожелтение.

Подробное описание изобретения

Поскольку этилен является наиболее важным растительным гормоном для стимуляции старения, и поскольку Бурая Пятнистость и Пожелтение связаны со старением, был предпринят генетический подход, в котором генетические варианты были получены и отобраны по чувствительности к этилену. Было обнаружено, что это косвенно приводит к идентификации мутантов, с измененной реакцией послеуборочного старения.

Подробные исследования с использованием модельных видов растений, таких как Arabidopsis thaliana, так же как сельскохозяйственных видов, предоставили информацию о биохимических путях, вовлеченных в биосинтез и воспринимаемость этилена. Была описана роль многоаллельных форм генов в этом отношении, предоставив запутанную картину этиленовой функции в растениях. Этилен, как другие растительные гормоны, играет важную роль во многих физиологических процессах, включенных в сложные взаимодействующие регуляторные сети.

Пространственную и временную активность гормона среди прочего определяют на уровне экспрессии генов, лежащих в основе биосинтеза этилена, восприятия гормона, сигнальной трансдукции и активации эффекторных белков, участвующих в передаче сигнала ниже.

Аллельные варианты генов, вовлеченных на различных уровнях, могут определять силу реакции, так же как и уровень перекрестной связи с другими сигнальными путями. Поскольку биосинтез этилена и чувствительность слабо описаны для салата и для того, чтобы позволить идентификацию различных сил реакций и лежащих в их основе аллельных вариантов, было обосновано, что непредубежденный подход может быть более успешным в этом отношении по сравнению с подходом направленной модификации генов.

Такой непредубежденный подход охватывает, предпочтительно, химическую или физическую процедуру случайного мутагенеза, объединенную с эффективными процедурами фенотипического скрининга и отбора, основанными на реакции этиолированных сеянцев на этилен. Такая система отбора, основанная на сеянцах, является намного более эффективной по показателю числа растений, которые могут быть оценены человек в час по сравнению с применением зрелых головок салата. Более того, время, для получения растительного материала для скрининга, очевидно, намного более сокращено в случае сеянцев по сравнению со зрелыми головками.

Дополнительным преимуществом этого подхода является использование условий отбора в стадии сеянцев в качестве прогнозируемого фенотипического маркера для послеуборочного признака в последовательных поколениях, как только был идентифицирован успешный случай. Очевидный риск существует в том факте, что отбор на стадии сеянцев может не привести к генетическим вариантам, которые бы проявляли отбираемый признак в зрелой, послеуборочной стадии. Более того, признано, что растительные гормоны, такие как этилен, вовлечены во многие физиологические процессы, которые могут привести к плейотропным эффектам. Они могут быть как положительными, так и отрицательными в зависимости от сельскохозяйственной культуры и условий ее культивирования. Предпринимаемый подход, поэтому, предпочтительно, включает следующие стадии:

1. Создание мутантной популяции посредством обработки семян или тканей растения мутагенными агентами, такими как этан метилсульфонат (ems) или гамма-излучение.

2. Проведение эффективного фенотипического скрининга, в котором отбор основан на реакции этиолированных сеянцев растений, в частности салата, на этилен, которая характеризуется сильным снижением удлинения гипокотилей, укороченным, утолщенным корнем и увеличенной кривизной апикальной почки. Эту реакцию называют тройной реакцией, которая типична для этиолированных сеянцев, и ее возникновение в различной степени обнаружено для многих видов растений при подвергании воздействию атмосферы, содержащей этилен (см., например, Ecker J, Science 268 (5211): 667-675 (1995)).

3. Описание мутантов, модифицированных по меньшей мере в одном тесте их тройной реакции по отношению к послеуборочному ухудшению, которое включает Бурую Пятнистость и Пожелтение. Необязательно определение плейотропных эффектов модификации для исключения негативных плейотропных эффектов, которые могли бы повлиять на стоимость растений.

В способе скрининга по изобретению тестируемая популяция семян растения является, таким образом, предпочтительно, популяцией мутантных семян, получаемых способом, включающим:

a) обработку М0-семян модифицируемых видов растений мутагенным агентом для получения М1-семян;

b) выращивание растений из полученных таким образом М1-семян для получения М1-растений;

c) получение M2-семян путем самоопыления М1-растений; и

d) необязательно повторение стадий b) и c) n раз для получения Ml+n семян.

Ml+n семена, полученные таким образом, затем проращивают в темноте и в присутствии высокой концентрации этилена для получения сеянцев. Впоследствии, отбирают сеянцы, не обнаруживающие реакцию на этилен. Измеряемой реакцией является развитие гипокотилей, которые удлиняются по сравнению с гипокотилями чувствительного к этилену сеянца.

Затем потомство каждого отобранного растения разделяют и выращивают в темноте: половину потомства в среде с этиленом, половину потомства в среде воздуха. Относительный рост гипокотилей в среде с этиленом в сравнении с воздухом измеряют для каждого потомства в обоих условиях. Эти наблюдения применяют, чтобы отличить потомства с более длинными гипокотилями, чем исходный чувствительный к этилену контроль в среде с этиленом, но также и в среде воздуха, и которые поэтому могут быть рассмотрены как чувствительные к этилену и не желательные, от потомств в действительности обладающих пониженной чувствительностью к этилену.

Примером известного мутагена является ems. Ems алкилирует прежде всего; G остатки нити ДНК, которые во время репликации ДНК приводят к спариванию с T вместо C. Поэтому пары оснований GC переходят в пары оснований AT с частотой, которая определяется эффективной дозой ems и активностью системы репарации ошибочно спаренных оснований растения. Эффективная доза ems зависит от используемой концентрации, размера семени и других физических свойств и времени инкубации семян в растворе ems. Семена, обработанные мутагенным агентом, типично называют М1-семенами. Вследствие обработки ткани М1-семян содержат случайные точечные мутации в геномах своих клеток, и тех, которые находятся в подпопуляции клеток, которые образуют зародышевую ткань (зародышевые клетки), которые будут переданы следующему поколению, которое называют M2. Мутации или их комбинации, которые являются гаплонедостаточными, приводя к бесплодию, или те, которые вызывают смертность эмбрионов, не будут переданы поколению M2.

Подобную процедуру, как описано выше для применения ems, используют также для других мутагенных агентов. М2-популяция может быть использована в способах скрининга, нацеленных на пониженную тройную реакцию этиолированных сеянцев.

Другими мутагенными агентами, в частности алкилирующими мутагенными агентами, являются диэтиловый сульфат (des), этиленимин (ei), пропансультон, N-метил-N-нитрозоуретан (mnu), N-нитрозо-N-метилмочевина (NMU), N-этил-N-нитрозомочевина (enu), азид натрия.

В качестве альтернативы, мутации вызывают посредством облучения, которое, например, отбирают из рентгеновского излучения, быстрых нейтронов, УФ-излучения.

В другом варианте осуществления изобретения мутации вызывают посредством генной инженерии, так как, например, посредством использования химерных олигонуклеотидов, гомологичных рекомбинаций, направленного воздействия на гены, введения модифицированных генов-мишеней, которые конкурируют с эндогенным продуктом, инактивации посредством РНК-интерференции и т.д.

Специалисту в области техники известна технология, позволяющая особым образом модифицировать гены-мишени, находящиеся в геноме растения. Например, было продемонстрировано, химерные олигонуклеотиды являются эффективными мутагенами со специфическим способом действия. Другой подход состоит в модификации генов-мишеней посредством гомологичной рекомбинации или направленного воздействия на гены. С применением такого подхода фрагмент гена заменяется фрагментом введенной ДНК, содержащим желательную модификацию. Также возможны трансгенные подходы, в которых вводят модифицированные гены-мишени, конкурирующие с эндогенным продуктом. Это может привести к доминирующим отрицательным эффектам. Более того, специфическая инактивация экспрессии генов возможна посредством РНК-интерференции.

В случае применения мутагенных олигонуклеотидов, направленного воздействия на гены или трансгенных подходов для модификации генетического фактора, вовлеченного в реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением, очевидно, должна быть известна первичная структура соответствующих генов. Однако в настоящее время знания относительно таких генов для салата ограничены.

Предпочтительно, изобретение дополнительно включает pyramiding аллели пониженной устойчивости к этилену.

Получение М1 и M1+n семян подходящим образом проводят посредством самоопыления.

Изобретение дополнительно относится к растениям или частям растений, которые содержат в своем геноме генетическую информацию, ответственную за пониженную чувствительность к физиологическим нарушениям, таким как Бурая Пятнистость и Пожелтение, и обнаруживаются в геноме растения салата, как перечислено в Таблице 1.

Потомство заявленных растений также является частью этого изобретения. "Потомство" в рамках настоящего описания охватывает все растения, обладающие такой же или подобной пониженной чувствительностью к этилену или физиологическим нарушениям, в частности к Бурой Пятнистости и Пожелтению, как исходные растения, описанные в настоящем описании и получаемые из них любым способом, таким как половое размножение, как самоопыление или перекрестное опыление с другим растением того же рода, или вегетативное размножение, такое как черенкование, тканевая культура, гаплоидная культура, культура протопластов, слияние протопластов или другими методами. Такое потомство является не только первым поколением растений, полученных одним или более из этих методов, но также и каждым последующим поколением растений, полученных одним или более из этих методов, при условии, что получаемые растения обладают пониженной чувствительностью.

Чтобы определить реакцию этиолированных сеянцев салата на этилен, были использованы специально разработанные пластмассовые контейнеры, в которых сеянцы салата выращивали на фильтровальных бумагах в атмосфере, с возможностью изменения уровня этилена. В действительности было обнаружено, что сеянцы салата реагировали на присутствие этилена пониженным удлинением гипокотилей, что в принципе может позволить отбирать нечувствительных к этилену мутантов, в случае если такие мутанты присутствуют в доступной популяции, и в случае если нечувствительность проявляется фенотипически на уровне сеянцев в примененных экспериментальных условиях.

Выращиванием большого количества этиолированных сеянцев салата из популяции, содержащей случайно вызванные мутации в атмосфере, содержащей этилен, обнаружено, что могут быть получены и отобраны сеянцы, обнаруживающие пониженную чувствительность к этилену по сравнению с чувствительностью исходной популяции. Отбирали сеянцы, обнаруживающие удлинение гипоктилей до степени, сопоставимой с ситуацией, когда атмосфера состояла из воздуха без этилена. Сеянцы, идентифицированные таким образом, оценивали как являющиеся нечувствительными к этилену.

Чтобы подтвердить, что нечувствительные к этилену мутанты являются устойчивыми к Бурой Пятнистости и Пожелтению, идентифицированных в отборе мутантов тестировали на их устойчивость к Бурой Пятнистости и/или Пожелтению. Тест Бурой Пятнистости соответственно включает хранение собранных зрелых головок в закрытом контейнере при температуре 8ºC в темноте, и размещение их в этиленовом газе при концентрации от 6 до 7 vpm (объемных частей на миллион) и оценку присутствия признаков Бурой Пятнистости через 7 дней, предпочтительно через 9 дней. Соответственно чувствительную к этилену контрольную головку инкубируют вместе с тестируемыми растениями и сравнивают с ней Бурую Пятнистость тестируемых растений.

Тест Пожелтения включает хранение зрелых головок тестируемых растений салата в камере хранения без присутствия этилена при 8°C и оценку пожелтения основных листьев через 10 дней, предпочтительно через 14 дней. Растения, устойчивые к пожелтению, являются растениями, не обнаруживающими пожелтение основных листьев через 14 дней. Соответственно чувствительную к этилену головку контроля инкубируют вместе с тестируемыми растениями, и сравнивают с ним реакцию Пожелтения тестируемых растений.

Как показано в Примерах, было продемонстрировано впервые, что нечувствительность к этилену приводит к устойчивости к Бурой Пятнистости и к устойчивости к Пожелтению, не вызываемому этиленом.

Неожиданно также были найдены сеянцы, обнаруживавшие реакцию удлинения, пониженную по сравнению с контрольными условиями, но которые были более длинными по сравнению с чувствительными контролями, которые были также рассмотрены как нечувствительные к этилену хотя бы частично.

Различные уровни нечувствительности к этилену, которые наблюдали, могут отражать присутствие как различных мутантных локусов, так и различных аллельных вариантов идентичных локусов, действующих на признак в исходной популяции.

В случае рецессивных мутаций две эти возможности можно легко различить путем проведения тестов на аллелизм, которые включают скрещивание двух мутантных растений и определение фенотипа гибрида. В случае аллелизма мутаций чувствительность к этилену будет очевидна в Fl, в то время как в случае, если фенотип в мутантах определен различными рецессивными локусами, это не так.

Поскольку случайный мутагенез был использован в качестве предпочтительного средства для получения начальной популяции, мутации в генетическом фоне могут также способствовать изменению фенотипа при экспериментальных условиях. Для различения между одиночными мутациями различной силы и комбинированным эффектом мутаций в генетическом фоне должны быть выполнены обратные скрещивания, чтобы создать однородные генетические фоны для различных случаев нечувствительности к этилену. Такая процедура дополнительно имеет значение для определения, являются ли мутации в специфических локусах вовлеченными в проявление плейотропных эффектов чувствительности к этилену.

M2-растения, отобранные таким образом на основе пониженной реакции на этилен, были использованы для выращивания M3-семян. В некоторых случаях M3-растения, выращенные из M3-семян, отбирали на пониженную чувствительность к этилену в тесте на тройную реакцию и самоопыляли для получения M4-семян. В нескольких случаях это даже повторяли до M5.

В одном случае M3-растение, выращенное из M3-семени, было отобрано на пониженную чувствительность к этилену в тесте на тройную реакцию и скрещено с чувствительным к этилену и чувствительным к Бурой Пятнистости родителем для получения Fl-семени. Fl-растение, выращенное от Fl-семени, самоопылили для получения F2-семян. F2-растение, выращенное из этих F2-семян, было отобрано на пониженную чувствительность к этилену в тесте на тройную реакцию, и самоопылено для получения F3-семян. Эту F3-линию добавили к набору M3 и M4 инбредных линий. Впоследствии инбредные линии, происходящие от нечувствительных к этилену особей, заново оценивали на их реакцию на этилен. Уровень нечувствительности каждой инбредной линии был оценен на основе относительного роста сеянца в атмосфере, содержащей этилен по сравнению с воздухом. На основе этого критерия 12/54 линий, которые ранее были оценены как нечувствительные к этилену, теперь были классифицированы как чувствительные. Эти ложно положительные реакции во время исходного отбора на уровне M2 могут с легкостью быть устранены во время повторной оценки особей в следующем поколении.

Инбредные линии, которые показали подтвержденную и существенную нечувствительность к этилену в этиленовом тесте, были повторно посеяны и выращены в оранжерее в обычных условиях получения салата для получения зрелых головок, которые были оценены на Бурую Пятнистость и Пожелтение (см. также Примеры).

В качестве отрицательных контролей были выращены чувствительные к этилену растения, которые происходят из популяции, примененной для отбора нечувствительных к этилену случаев. Неожиданно семена всех нечувствительных к этилену мутантов прорастали нормально, т.е. сопоставимо с семенами почти изогенного чувствительного к этилену контрольного растения, при высевании в почву для горшечных культур.

Это резко контрастирует с ситуацией в других видах растений, таких как Arabidopsis thaliana, которые показывают сильное снижение способности прорастания при высевании в почву для горшечных культур (Harpham, N. J. V. et al. (1991) Annals of Botany 68, 55-61). Очевидно, для салата возможно выращивание нечувствительных к этилену мутантов согласно нормальной практике культивирования, которая во многих случаях включает высевание в блоки почвы для горшечных культур или набивки почвы для горшечных культур.

После культивирования зрелые головки были собраны и подвергнуты воздействию этилена. Одна неделя послеуборочной инкубации головок при 8ºC в атмосфере, содержащей этилен, привела к сильной индукции Бурой Пятнистости головок, чувствительных к этилену контрольных растений. Однако 29 из 37 оцененных нечувствительных к этилену случаев не обнаружили признак Бурой Пятнистости вообще, что к удивлению демонстрирует, что устойчивость к этилену, в отношении которой проводили отбор, на уровне сеянцев, может снизить физиологические нарушения на уровне зрелых растений, даже на послеуборочной стадии.

Устойчивость к пожелтению может быть продемонстрирована для многих нечувствительных к этилену случаев в условиях хранения без присутствия этилена при недостаточно оптимальной температуре. Это удивительно, поскольку до сих пор устойчивость к Пожелтению обнаруживали только в присутствии этилена (Saltveit et al., Postharvest Biology and Technology 27: 277-283 (2003)).

Настоящее изобретение будет иллюстрировано в последующих Примерах, и они не предназначены для ограничения изобретения не коим образом. Более конкретно, эксперименты в Примерах выполнены с салатом, но изобретение более широко применимо к другим видам растений, для которых характерны подобные послеуборочные трудности при контакте с этиленом.

В примерах сделана ссылка на следующий рисунок.

Иллюстрация: Фенотип зрелых головок салата после воздействия этилена при 8ºC в темноте в течение 9 дней. Левая группа показывает представительный образец устойчивых к этилену (Этилен У) и чувствительных к этилену контрольных

(-контроль) головок сорта Troubadour. Правая группа показывает похожую картину мутантов, происходящих из сорта Apache.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Генетическая модификация салата посредством этилметансульфоната (ems)

Семена салата сортов Troubadour, Apache и Yorvik (все три из Rijk Zwaan, De Lier, Нидерланды) обрабатывали ems путем погружения приблизительно 2000 семян каждого сорта в аэрированный раствор либо 0,05% (масс./об.), либо 0,07% (масс./об.) ems в течение 24 часов при комнатной температуре.

Приблизительно 1500 семян каждого сорта обработанных дозой ems проращивали и получаемые растения выращивали в оранжерее в Нидерландах с мая по сентябрь для получения семян.

После созревания M2-семена собирали и ссыпали в один пул для каждого сорта для каждой обработки. Полученные 6 пулов M2-семян были применены в качестве стартового материала для идентифицикации особей M2-растений, содержащих аллели пониженной чувствительности.

Эффективность процедуры генетической модификации была оценена путем определения появления обесцвеченных растений, которые указывают на потерю хлорофилла из-за модификаций в генах, прямо или косвенно вовлеченных в образование или накопление хлорофилла. Во всех 6 пулах наблюдали обесцвеченные особи растений M2-семян, что демонстрирует, что примененные обработки приводят к генетическим модификациям.

ПРИМЕР 2

Идентификация растений салата, которые получили аллели пониженной чувствительности к этилену

M2-семена салата проращивали на бумаге в небольшом пластмассовом контейнере с концентрацией этилена 10-20 vpm (частей объема на миллион) при 16°C в темноте. 1 vpm содержит 0,41 мкмоль/л или 1,14 мг/л. Нечувствительные к этилену мутанты сравнивали с чувствительными к этилену контролями, и отбирали на основе удлиненного гипокотиля и/или корня (т.е. тест на тройную реакцию). Эти нечувствительные к этилену мутанты выращивали для получения M3-линий самоопылением. Эти M3-линии повторно тестировали тестом на тройную реакцию для подтверждения нечувствительности к этилену.

Когда линию разделяли по нечувствительности к этилену, растения отбирали с последующим одним или двумя дополнительными циклами инбридинга, и итоговым тестом на тройную реакцию для отбора, по возможности, гомозиготных линий, нечувствительных к этилену.

В одном случае M3-растение, выращенное из M3-семени, отбирали на пониженную чувствительность к этилену в тесте на тройную реакцию, и скрещивали с чувствительным к этилену и чувствительным к Бурой Пятнистости родителем Troubadour для получения Fl-семени. Fl-растение, выращенное из Fl-семени, самоопыляли для получения F2-семян. F2-растение, выращенное из этих F2-семян, отбирали на пониженную чувствительность к этилену в тесте на тройную реакцию и самоопыляли для получения F3-семян. Полученную F3-линию добавляли к набору 53 M3, M4 и M5 инбредных линий. В этом случае F3-линия была единственным представителем исходного M2-мутантного растения, поскольку в ней не оставалось никаких семян, полученных самоопылением, от этого растения.

Этот набор 54 M3- и M4-линий из Примера 1 проращивали в торфяных блоках в закрытом контейнере при концентрации этилена от 4 до 4,5 vpm в темноте. Нечувствительные к этилену мутанты идентифицировали по более длинным гипокотилям по сравнению с чувствительными сортами контроля (Tpoubadour, Apache, Yorvik, Sensai). Результаты представлены в Таблице 1. 42 из 54 линий, идентифицированных тестом на тройную реакцию, оказались по меньшей мере частично нечувствительными к этилену в этиленовом тесте. Эти линии представляют 40 M2-растений, поскольку 2 M2-растения представлены дважды.

Таблица 2 показывает результаты.

ПРИМЕР 3

Идентификация растений салата, получивших аллели пониженной чувствительности к Бурой Пятнистости

Тридцать семь нечувствительных к этилену линий из сорока двух линий, обнаруженных в Примере 2, высевали в оранжерее, для получения зрелых головок в обычных условиях получения салата (место: Maasdijk, Нидерланды; посев: 10 января; пересадка: 17 февраля; сбор урожая: 18 апреля). Собранные зрелые головки хранили в закрытом контейнере при температуре 8°C в темноте. Они были подвергнуты воздействию этиленового газа при концентрации от 6 до 7 vpm (частей объема на миллион). 1 vpm содержит 0.41 мкмоль/л или 1.14 мг/л. Через 9 дней идентифицировали растения, обнаруживающие Бурую Пятнистость. Все контрольные растения, кроме Yorvik, обнаружили Бурую Пятнистость. 29 из 37 тестированных линий показали отсутствие Бурой Пятнистости или меньшую Бурую Пятнистость по сравнению с исходным сортом (Таблица 3).

Шесть линий были отобраны для размножения и депонирования в NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, UK. Первой линии был присвоен номер 02D.91445. Линией, происходящей от нечувствительного к этилену Troubadour-M2-растения 00D.7856, является M4-линия. Нечувствительное к этилену M4-растение было отобрано из 02D.91445 в тесте с закрытым контейнером в Примере 2 и самоопылено для получения M5-семян. Шестнадцать M5-растений были выращены из этих семян для получения М6-партии семян путем самоопыления. Этой партии семян был присвоен номер 07D.826509, и она была депонирована под NCIMB-номером 41449 (первая линия).

Второй линии был присвоен номер 02D.90047. Линией, происходящей из нечувствительного к этилену Troubadour-М2-растения 00D.68764, является М4-линия. Нечувствительное к этилену M4-растение было отобрано из 02D.90047 в тесте с закрытым контейнером в Примере 2 и самоопылено для получения M5-семян. Шестнадцать M5-растений были выращены из этих семян для получения партии M6 семян путем самоопыления. Этой партии семян был присвоен номер 07D.826514, и она была депонирована под NCIMB-номером 41450 (вторая линия). Отсутствие Бурой Пятнистости для исходного было установлено путем тестирования M5-линии 03D.90323, происходящей из M4-растения 02D.90047.

Третьей линии был присвоен номер 00D.88578. Линией, происходящей от нечувствительного к этилену Troubadour-M2-растения 00D.7871, является М-3 линия. Шестнадцать M3-растений было выращено из 00D.88578 для получения партии М4 семян путем самоопыления. Этой партии семян был присвоен номер 07D.826502, и она была депонирована под NCIMB-номером 41448 (третья линия).

Четвертой линии был присвоен номер 03D.90452. Линией, происходящей от нечувствительного к этилену Apache-M2-растения 00D.6883, является М5-линия. Нечувствительное к этилену M5-растение было отобрано из 03D.90542 в тесте с закрытым контейнером в Примере 2 и самоопылено для получения M6-семян. Шестнадцать M6-растений были выращены из этих семян для получения партии М7-семян путем самоопыления. Этой партии семян был присвоен номер 07D.826522, и она была депонирована под NCIMB-номером 41451 (четвертая линия).

Пятой линии был присвоен номер 01D.85780. Линией, происходящей от нечувствительного к этилену Apache-M2-растения, является М3-линия 00D.6896. Нечувствительное к этилену M3-растение было отобрано из 01D.85780 в тесте с закрытым контейнером в Примере 2 и самоопылено для получения M4-сеямн. 16 M4-растений были выращены из этих семян для получения партии М5-семян путем самоопыления. Этой партии семян был присвоен номер 07D.826540, и она была депонирована под NCIMB-номером 41452 (пятая линия).

Шестой линии был присвоен номер 04D.801660. Линией, происходящей из скрещивания между нечувствительным к этилену Yorvik-M3-растением 02D.8484 и растением чувствительного к этилену сорта Troubadour, является F3-линия. M3-растение 02D.8484 произошло от нечувствительного к этилену Yorvik-M2-растения 00D.7845. Нечувствительное к этилену F3-растение было отобрано из 04D.801660 в тесте с закрытым контейнером в Примере 2 и самоопылено для получения F4-семян. 16 F4-растений были выращены из этих семян для получения партии F5-семян путем самоопыления. Этой партии семян был присвоен номер 07D.826542, и она была депонирована под NCIMB-номером 41453 (шестая линия).

Фиг. 1 показывает устойчивые и контрольные растения.

ПРИМЕР 4

Идентификации растений салата, обнаруживающих меньшее послеуборочное пожелтение

Нечувствительные к этилену линии, выращенные в условиях оранжереи, как описано для Примера 3, были собраны и зрелые срезанные головки сохраняли в камере хранения в отсутствие этилена при 8°C. Через две недели основные листья зеленых контрольных сортов Yorvik и Troubadour начали становиться желтыми. В тот момент и даже 1 неделю спустя три линии обнаруживали меньше желтых основных листьев, чем сорта, из которых они происходят, которые служили контролями, примененными в этом испытании. Этим линиям были присвоены номера 04D.800900, 03D.90323, 04D.801660.

Хотя сообщают о взаимосвязи между пожелтением листа и присутствием этилена (Saltveit et al (2003) Postharvest Biology and Technology 27:277 283), удивительно, что даже в условиях без этилена, некоторые из нечувствительных к этилену линий проявляют фенотип меньшего пожелтения.

Таблица 3 Наблюдения Бурой Пятнистости на зрелых головках через 9 дней хранения в условиях присутствия этилена. 0=отсутсиве признаков; 1=слабые признаки; 2=сильные признаки; NA=нет данных
Семя №	Этилен	trt	Бурая Пятнистость	Семя №	Этилен	Trt	Бурая Пятнистость
01D.85762	Частично R	R hypo; S root	2	00D.88565	R	R	0
03D.90452	R	R	0	02D.91445	R	R	0,5
01D.85764	R/S Частично R	R hypo; S root	1	00D.88577	R/S	R hypo; S root	0
02D.90070	R	R	0	02D.91446	R	R	0
03D.90457	R	R	0	02D.91447	R	R	0
01D.85768	R	R	0	01D.85754	S?	R/S	0
02D.90128	R	R	2	01D.85756	R	R	0
02D.90129	R	R	2	02D.90047	R	R	NA
02D.90130	R	R	2	01D.85758	R	R	0
03D.90462	R	R	2	02D.91442	R	R	0
Apache	S	S	2	Troubadour	S	S	1
03D.90464	R	R	0	00D.88569	R	R	0
02D.90133	R	R	2	00D.88573	R	R	0
02D.90134	R	R	2	00D.88578	R	R	0
00D.88600	R/S	R	NA	00D.88582	R	R	0
02D.91479	R	R	0	01D.85748	R/S	R/S	0,1
01D.85772	R	S hypo; R root	0
04D.800957	R	S hypo; R root	0	02D.90036	Частично R	S hypo; R root	NA
02D.90091	R	R	0	01D.85755	R/S	R/S	NA
04D.800960	R	S hypo; R root	0	04D.800900	R	S hypo; R root	0,5
04D.800963	R	R	2	03D.90323	R	R	0
01D.85780	R	R	0	4D.801660	Частично R	R/S hypo; S root	0,2
Apache	S	S	2	Yorvik	S	S	0