стабилизированные составы, содержащие фактор ix и трегалозу

Формула изобретения

1. Лиофилизированная фармацевтическая композиция, содержащая фактор IX, более чем 90% способности которого связывать кальций сохранена при хранении в течение 6 месяцев при 25°С; и

трегалозу в количестве 0,5-3% по объему.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что трегалоза присутствует в количестве от 1 до 2% по объему.

3. Композиция по любому из пп.1 и 2, дополнительно содержащая гистидин в качестве буферного агента.

4. Композиция по любому из пп.1 и 2, дополнительно содержащая маннитол.

5. Композиция по любому из пп.1 и 2, дополнительно содержащая хлорид натрия.

6. Композиция по любому из пп.1 и 2, дополнительно содержащая полисорбат 80.

7. Композиция по любому из пп.1 и 2, дополнительно содержащая гистидин с концентрацией 5-20 мМ, маннитол с концентрацией 2-5% по объему, хлорид натрия с концентрацией 50-80 мМ и полисорбат 80 с концентрацией 0,001-0,005% по объему.

8. Способ приготовления стабильной сухой композиции, содержащей фактор IX, включающий: смешивание раствора, содержащего фактор IX, с трегалозой с получением криозащитного раствора; и лиофильную сушку указанного криозащитного раствора с получением стабильной сухой композиции, содержащей фактор IX, более 90% активности связывания кальция которого сохранена при хранении в течение 6 месяцев при 25°С, и трегалозу в количестве 0,5-3% по объему.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что трегалоза присутствует в количестве от 1 до 2% по объему.

10. Способ по любому из пп.8 и 9 отличающийся тем, что раствор дополнительно содержит гистидин.

11. Способ по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что раствор дополнительно содержит маннитол.

12. Способ по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что раствор дополнительно содержит хлорид натрия.

13. Способ по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что раствор дополнительно содержит полисорбат 80.

14. Способ по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что раствор дополнительно содержит гистидин с концентрацией 5-20 мМ, маннитол с концентрацией 2-5% по объему, хлорид натрия с концентрацией 50-80 мМ и полисорбат 80 с концентрацией 0,001-0,005% по объему.

15. Способ по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что лиофильная сушка включает одну стадию отжига.

16. Способ лиофилизации фармацевтического состава, содержащего фактор IX и трегалозу в количестве 0,5-3% по объему, включающий стадии:

(а) замораживания фармацевтического состава, содержащего фактор IX и трегалозу, при температуре -40°С или менее;

(b) отжига фармацевтического состава при температуре примерно от -20°С до -35°С;

(c) понижения температуры фармацевтического состава до -40°С или менее;

(d) высушивания фармацевтического состава на первой стадии сушки при температуре от 5°С до 20°С при пониженном давлении; и

(e) высушивания фармацевтического состава на второй стадии сушки при температуре от 45°С до 55°С при пониженном давлении.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что фармацевтический состав дополнительно содержит гистидин с концентрацией 5-20 мМ, маннитол с концентрацией 2-5% по объему, хлорид натрия с концентрацией 50-80 мМ и полисорбат 80 с концентрацией 0,001-0,005% по объему.

Описание изобретения к патенту

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке США № 61/016,230, поданной 21 декабря 2007 года, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки.

СТОРОНЫ СОГЛАШЕНИЯ О ПРОВЕДЕНИИ СОВМЕСТНЫХ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ

[0002] Настоящее изобретение явилось результатом проведения научно-исследовательских работ в рамках соглашения между Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. и /COS Соф.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Варианты реализации настоящего изобретения относятся к стабилизации структуры и активности белка во время лиофилизации и хранения, в частности, стабилизации факторов свертывания крови, таких как фактор IX.

ОПИСАНИЕ УРОВНЯ ТЕХНИКИ В ЭТОЙ ОБЛАСТИ ТЕХНИКИ

[0004] Фактор IX является одноцепочечным гликопротеином, который участвует в каскаде коагуляции. Фактор IX структурно представляет собой сложную молекулу, содержащую амино-концевой сигнальный пептид и лидерную пре-про-последовательность (оба расщепляются до выделения в циркуляцию), а также домен G/a, ответственный за связывание Са²⁺. Связывание кальция играет важную роль в функционировании фактора IX посредством связывания с фактором IX и индуцирования конформационного изменения в белке, необходимого для поддержания коагулирующей активности. Связывание кальция приводит к тому, что ранее скрытые гидрофобные сайты связывания становятся доступны, что облегчает связывание с фосфолипидами, необходимое для эффективной коагуляции. Сохранение способности фактора IX связывать кальций необходимо для продуцирования активного белка. После расщепления активационного пептида, одноцепочечный фактор IX превращается в активированный фермент фактор IXa, двухцепочечный гликопротеин, связанный посредством межцепьевой дисульфидной связи. Кроме того, молекула содержит многочисленные N- и О-связанные сайты гликозилирования. Дефицит фактора IX приводит к гемофилии В, для лечения которой в настоящее время существует несколько препаратов, в том числе BeneFIX®, рекомбинантная версия фактора IX, и Mononine®, получаемый из плазмы крови человека.

[0005] Состав Mononine® включает гистидин, маннитол, хлорид натрия и полисорбат 80. Известно множество наполнителей, демонстрирующих эвтектические переходы (явления кристаллизации) во время замораживания. Однако состав Mononine® не содержит криопротектор или стабилизатор, а только буферный агент, наполнитель, агент, поддерживающий тоничность, и поверхностно-активное вещество. Поэтому во время замораживания, лиофилизации и последующего хранения, белок является относительно незащищенным физически от денатурирующего воздействия льда, воды и воздуха. Техническая задача, рассматриваемая в настоящей заявке, касается создания улучшенного состава, содержащего фактор IX, характеризующегося улучшенной стабильностью при замораживании, лиофилизации и хранении. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что включение трегалозы в композицию, содержащую фактор IX, во время замораживания, лиофилизации и хранения оказывает стабилизирующее действие на способность фактора IX связывать кальций и обеспечивает сохранение биологической активности очищенного белка.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Варианты реализации изобретения относятся к лиофилизированным композициям, которые содержат фактор IX и трегалозу. Предпочтительно, если трегалоза присутствует в количестве, достаточном для сохранения более чем 90% способности фактора IX связывать кальций при лиофилизации и хранении в течение 6 месяцев при 25°С.

[0007] Предпочтительно, если трегалоза присутствует в количестве от 0.5 до 3% по объему. Еще более предпочтительно, если трегалоза присутствует в количестве от 1 до 2% по объему.

[0008] Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации изобретения, композиция содержит гистидин в качестве буферного вещества. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации изобретения, композиция содержит маннитол. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации изобретения, композиция содержит хлорид натрия. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации изобретения, композиция содержит полисорбат 80.

[0009] Согласно наиболее предпочтительным вариантам реализации изобретения, композиции содержат фактор IX и трегалозу и дополнительно содержат гистидин с концентрацией 5-20 мМ, маннитол с концентрацией 2-5% по объему, хлорид натрия с концентрацией 50 - 80 мМ, и полисорбат 80 с концентрацией 0.001-0.005% по объему.

[0010] Варианты реализации изобретения относятся к способам получения стабильной сухой композиции, содержащей фактор IX, путем смешивания раствора, содержащего фактор IX, и трегалозы с получением криозащитного раствора и лиофильной сушки криозащитного раствора с получением стабильной сухой композиции, содержащей фактор IX. Предпочтительно, если сухая композиция, содержащая фактор IX, сохраняет более чем 90% активность связывания кальция при хранении в течение 6 месяцев при 25°С.

[0011] Предпочтительно, если трегалоза присутствует в количестве от 0.5 до 3% по объему. Еще более предпочтительно, если трегалоза присутствует в количестве от 1 до 2% по объему.

[0012] Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации изобретения, раствор содержит гистидин в качестве буферного вещества. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации изобретения, раствор содержит маннитол. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации изобретения, раствор содержит хлорид натрия. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации изобретения, раствор содержит полисорбат 80.

[0013] Согласно наиболее предпочтительным вариантам реализации изобретения, раствор содержит фактор IX и трегалозу и дополнительно содержит гистидин с концентрацией 5-20 мМ, маннитол с концентрацией 2-5% по объему, хлорид натрия с концентрацией 50-80 мМ, и полисорбат 80 с концентрацией 0.001-0.005% по объему.

[0014] Предпочтительно, если лиофильная сушка включает одну стадию отжига.

[0015] Варианты реализации изобретения относятся к способам лиофилизации фармацевтического состава, который содержит фактор IX и трегалозу, которые включают одну или более из следующих стадий:

(a) замораживание фармацевтического состава, содержащего фактор IX и трегалозу, при температуре -40°С или ниже;

(b) отжиг фармацевтического состава при температуре от примерно -20°С и до -35°С;

(c) понижение температуры фармацевтического состава до -40°С или ниже;

(d) высушивание фармацевтического состава на первой стадии сушки при температуре от 5°С до 20°С при пониженном давлении; и

(e) высушивание фармацевтического состава на второй стадии сушки при температуре от 45°С до 55°С при пониженном давлении.

[0016] Предпочтительно, если фармацевтический состав также содержит гистидин с концентрацией 5-20 мМ, маннитол с концентрацией 2-5% по объему, хлорид натрия с концентрацией 50-80 мМ, и полисорбат 80 с концентрацией 0.001-0.005% по объему.

[0017] Дополнительные аспекты, особенности и преимущества этого изобретения станут очевидными из подробного описания предпочтительных вариантов реализации изобретения, приведенного ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0018] Эти и другие особенности изобретения будут описаны в настоящем документе со ссылками на фигуры, изображающие предпочтительные варианты изобретения, предназначенные для иллюстрации, и не ограничивающие изобретение.

[0019] На фиг.1 показана стабильность фактора IX при условиях 40°С/75%ОВ. " " обозначает белок фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl, 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 (R1). " " обозначает белок фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl₃, 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 с 1% трегалозой (R2).

[0020] На фиг.2 показан полученный способом эксклюзионной ВЭЖХ профиль элюирования композиций, содержащих фактор IX, после хранения в течение 12 недель. На фиг.2А показан профиль элюирования белка фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl и 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 (R1). На фиг.2 В показан профиль элюирования белка фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl, 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 с 1% трегалозой (R2).

[0021] На фиг.3 показан полученный способом эксклюзионной ВЭЖХ (кальций) профиль элюирования фактора IX после хранения в течение 12 недель. На фиг.3А показан профиль элюирования белка фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl и 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 (R1). На фиг.3В показан профиль элюирования белка фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl, 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 с 1% трегалозой (R2),

[0022] На фиг.4 показана стабильность связывания кальция фактором IX при условиях 40°С/75%ОВ. обозначает стабильность белка фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl, 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 (R1). " " обозначает стабильность белка фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl, 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 с 1% трегалозой (R2).

[0023] На фиг.5 показаны результаты SDS-PAGE анализа (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) составов, содержащих фактор IX, после хранения в течение 12 недель в не восстановительных (А) и восстановительных (В) условиях. Панель А: Линия 1, незаполненная; линия 2, маркеры; линия 3, стандартный образец, содержащий фактор IX (Mononine®); линия 4, 0.4 мг/мл, R1, лиоф. -20°С; линия 5, 0.4 мг/мл, R2, лиоф. -20°С; линия 6, 0.4 мг/мл, R1, лиоф. 2-8°С; линия 7, 0.4 мг/мл, R2, лиоф. 2-8°С; линия 8, 0.4 мг/мл, R1, лиоф. 25°С; линия 9, 0.4 мг/мл, R2, лиоф. 25°С; линия 10, 0.4 мг/мл, R1, лиоф. 40°С; линия 11, 0.4 мг/мл, R2, лиоф. 40°С; линия 12, маркеры. Панель В: Линии 1 & 2, маркеры; линия 3, стандартный образец, содержащий фактор IX (Mononine®); линия 4, 0.4 мг/мл, R1 лиоф. -20°С; линия 5, 0.4 мг/мл, R2, лиоф. -20°С; линия 6, 0.4 мг/мл, R1, лиоф. 2-8°С; линия 7, 0.4 мг/мл, R2, лиоф. 2-8°С; линия 8, 0.4 мг/мл, R1, лиоф. 25°С; линия 9, 0.4 мг/мл, R2, лиоф. 25°С; линия 10, 0.4 мг/мл, R1, лиоф. 40°С; линия 11, 0.4 мг/мл, R2, лиоф. 40°С; линия 12, маркеры.

[0024] На фиг.6 показан полученный способом анионообменной ВЭЖХ профиль элюирования композиций, содержащих фактор IX, после хранения в течение 12 недель. На фиг.6А показан профиль элюирования белка фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl и 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 (R1). На фиг.6 В показан профиль элюирования белка фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл в 10 мМ гистидине, 3% маннитоле, 66 мМ NaCl, 0.0075% полисорбате 80, рН 6.8 с 1% трегалозой (R2).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0025] Хотя описанный вариант реализации представляет собой предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения, следует иметь в виду, что для специалистов в данной области техники очевидна возможность внесения изменений без отступления от сущности изобретения. Поэтому объем изобретения определяется исключительно согласно прилагаемой формуле изобретения.

[0026] Варианты реализации настоящего изобретения относятся к способам лиофилизации фактора IX в присутствии трегалозы и составов, содержащих фактор IX и трегалозу. Составы, содержащие фактор IX, исследовали с добавлением и без добавления трегалозы, которая представляет собой криопротектор, не кристаллизующийся в процессе лиофилизации. Трегалоза остается в виде концентрата, который подвергается стеклованию при замораживании до более низких температур. Таким образом, белок консервируется в присутствии трегалозы, сохраняясь в смешанном аморфном состоянии и стабилизируясь при замораживании и лиофильной сушке. Трегалоза улучшала стабильность и предотвращала агрегацию белка фактор IX при хранении. Также неожиданно было обнаружено, что включение трегалозы в состав существенно улучшало сохранность индуцированного кальцием конформационного изменения, необходимого для проявления активности фактора IX. Видимая потеря способности связывать кальций была связана с потерей эффективности. В составах, содержащих трегалозу, потеря указанной способности связывать кальций и эффективности были в значительной степени замедлены.

[0027] В предпочтительных вариантах изобретения, по меньшей мере 50%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90% способности фактора IX связывать кальций сохраняется во время замораживания, лиофилизации и хранения за счет включения трегалозы в композицию, содержащую фактор IX. Предпочтительно, если трегалоза присутствует в количестве, достаточном для сохранения более чем 90% способности фактора IX связывать кальций во время замораживания, лиофилизации и хранения в течение по меньшей мере трех месяцев при 25°С, более предпочтительно, по меньшей мере 6 месяцев при 25°С, и еще более предпочтительно, по меньшей мере 1 года при 25°С.

Компоненты состава

[0028] Согласно предпочтительным вариантам изобретения, композиции согласно настоящему изобретению, содержащие фактор IX, включают буферный агент, наполнитель, агент, поддерживающий тоничность, поверхностно-активное вещество и криопротектор/стабилизатор. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, в композицию могут быть также включены другие наполнители. Эти композиции максимизируют стабильность фактора IX в лиофилизированных препаратах, а также в жидком состоянии.

[0029] Согласно предпочтительным вариантам изобретения, в состав композиции включают буферный агент. рН следует предпочтительно поддерживать в диапазоне между 6 и 8 во время лиофилизации и хранения, и, более предпочтительно, поддерживать рН примерно 6.8. Буферный агент может представлять собой любое физиологически приемлемое химическое соединение или комбинацию химических соединений, которые обладают способностью действовать как буферы, в том числе гистидин, трис-(гидроксиметил)-аминометан (TRIS), 1,3-бис-[трис-(гидроксиметил)метиламино]-пропан (бис-трис-пропан), пиперазин-N,N'-бис-(2-этансульфоновая кислота) (PIPES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS), N-2-гидроксиэтил-пиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота (HEPES), 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES) и N-2-ацетамид-2-аминоэтансульфоновая кислота (ACES). Как правило, буферный агент содержится в концентрации 5-20 мМ. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации изобретения, буферный агент представляет собой гистидин с концентрацией примерно 10 мМ.

[0030] Наполнители представляют собой такие химические вещества, которые обеспечивают структурирование "осадка" или остаточной твердой массы фармацевтического препарата после его лиофилизации и которые защищают его от разрушения. Наполнители, применяемые в составах согласно настоящему изобретению, выбирают из группы, включающей, но не ограничивающейся указанными, маннитол, глицин и аланин. Маннитол, глицин или аланин присутствуют в количестве 1-10%, предпочтительно 2-5%, и, более предпочтительно, примерно 3%.

[0031] Хлорид натрия вводят в составы согласно настоящему изобретению в количестве 30-100 мМ, предпочтительно, 50-80 мМ, и, наиболее предпочтительно, примерно 66 мМ.

[0032] Согласно предпочтительным вариантам изобретения, композиции, содержащие фактор IX, включают поверхностно-активное вещество, предпочтительно, в количестве 0.1% или менее, и, более предпочтительно, в количестве 0.001-0.005%. Поверхностно-активное вещество может быть, например, выбрано из группы, включающей, но не ограничивающейся указанными, полисорбат 20, полисорбат 80, высокомолекулярные спирты полиоксиэтилена и полиоксипропилена, и BRIJ 35 (полиоксиэтилен 23 лауриловый эфир). Являются доступными несколько марок высокомолекулярных спиртов полиоксиэтилена и полиоксипропилена (коммерчески доступны под торговой маркой PLURONIC, производитель компания BASF Wyandotte Corporation). Эти высокомолекулярные спирты, имеющие различную молекулярную массу (от 1,000 до выше 16,000) и физико-химические свойства, применяли в качестве поверхностно-активных веществ. PLURONIC F-38, имеющий молекулярную массу 5,000, и PLURONIC F-68, имеющий молекулярную массу 9,000, содержат (по весу) 80 процентов гидрофильных полиоксиэтиленовых групп и 20 процентов гидрофобных полиоксипропиленовых групп. Согласно предпочтительным вариантам реализации изобретения, полисорбат 80 включен в состав в концентрации примерно 0.0075%.

[0033] Предпочтительно, если в составах согласно настоящему изобретению применяют стабилизирующий агент. Стабилизатор выбирают из группы, включающей, но не ограничивающейся указанными, сахарозу, трегалозу, рафинозу и аргинин. Эти вещества присутствуют в составах согласно настоящему изобретению в количестве между 0.5 и 3%, предпочтительно, 1-2%, более предпочтительно, примерно 1%. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации изобретения, трегалоза содержится в композиции в концентрации 1%.

[0034] Согласно предпочтительным вариантам реализации изобретения, фактор IX, применяемый в композициях согласно настоящему изобретению, представляет собой особо чистый фактор IX, полученный из человеческой плазмы, или, что более предпочтительно, может представлять собой фактор IX, полученный путем рекомбинации. Рекомбинантный фактор IX можно получить трансфекцией клеток яичника китайского хомячка (СНО), вектором, содержащим последовательность ДНК, несущую информацию о молекуле фактора IX. Способы создания таких трансфицированных клеток СНО описаны, в частности, в патенте США № 4,757,006, Toole, Jr., хотя в этой области техники также известны альтернативные способы (см., например, патент США № 4,868,112, также Toole, Jr., и международную заявку РСТ WO-А-91/09122).

[0035] Хотя описанные в настоящей заявке композиции, содержащие фактор IX, можно лиофилизировать и восстановить в указанных концентрациях, специалисту в данной области техники будет понятно, что эти препараты можно также восстановить в более разбавленной форме. Например, препарат согласно настоящему изобретению, который лиофилизируют и/или восстанавливают обычным способом в 2 мл раствора, можно также восстановить в большем объеме разбавителя, например, в 5 мл. Такой препарат особенно предпочтителен в случае введения пациенту немедленно после приготовления путем инъекции, поскольку в этом случае фактор IX имеет меньшую вероятность потерять активность, что может произойти быстрее в более разбавленных растворах фактора IX.

ПРИМЕРЫ

[0036] Рекомбинантный фактор IX получали в клетках яичника китайского хомячка, трансфицируемых посредством кДНК, кодирующей человеческий фактор IX. Фактор IX очищали от кондиционированной среды, применяя способ, включающий анионо- и катионообменную хроматографию для отделения требуемого продукта от компонентов среды, в том числе белков и ДНК клеток хозяина.

[0037] Лиофилизацию осуществляли способами, известными в данной области техники. Информацию о лиофилизации можно найти в Carpenter, J.F. и Chang, В.S., Lyophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, изд. K.E.Avis и V.L.Wu (Buffalo Grove, 111.: Interpharm Press, Inc.), стр.199-264 (1996). В контексте настоящего изобретения, термины "лиофильная сушка" и "лиофилизация" применяют взаимозаменяемо и указанные термины включают все стадии концентрирования пробы, в том числе, стадии отжига и сушки. Согласно предпочтительным вариантам реализации изобретения, лиофилизация включает 1-3 стадии отжига. Согласно предпочтительным вариантам реализации изобретения, лиофилизацию осуществляют посредством одной стадии отжига. Термин "отжиг" обозначает стадию в процессе лиофилизации фармацевтического препарата, подвергаемого лиофилизации, перед сублимационной сушкой препарата, в которой температура препарата возрастает от более низкой температуры к более высокой температуре и затем снова падает после некоторого периода времени. Стадии высушивания осуществляют при пониженном давлении, как правило, в диапазоне 50-300 микробар.

[0038] Примерный протокол экспериментов проиллюстрирован ниже в таблице 1.

ТАБЛИЦА 1
Стадия #	Стадия	Температура на полке °С	N2 кровотечение	Время (минуты)	Давление (микробар)
1	Загрузка	Комнатная температура			Окружающая среда
2	Замораживание	-50		100	Окружающая среда
3	Замораживание	-50		120	Окружающая среда
4	Замораживание	-23		60	Окружающая среда
5	Замораживание	-23		120	Окружающая среда
6	Замораживание	-50		60	Окружающая среда
7	Замораживание	-50		120	Окружающая среда
8	Первичная сушка	-50	X	60	150
9	Первичная сушка	-43	X	100	150
10	Первичная сушка	10	X	120	150
11	Первичная сушка	10	X	1440	150
13	Вторичная сушка	50	X	435	150
14	Вторичная сушка	50	X	240	150
15	Предварительная аэрация	25	X		150
16	Закупоривание	25	X	0.15	150
17	Хранение	4	X	<72 часов	<106
18	Аэрация	4	X		Окружающая среда

[0039] Активность определяли с помощью одностадийного анализа коагулирующей активности. Одностадийные анализы известны в данной области техники. В анализе, применяемом в настоящем документе, использовали контрольную плазму для универсальной коагуляции (UCRP) в качестве стандарта для активности фактора IX и плазму с дефицитом фактора IX для разбавления калибровочных стандартов и неизвестных проб. Анализ включает смешивание плазмы с активатором и хлоридом кальция для инициирования каскада свертывания, с образованием сгустка фибрина, измеряемого по оптической плотности на считывающем устройстве для микропланшетов. Время свертывания, измеряемое в этом анализе, представляет собой аРТТ (активированное парциальное тромбопластиновое время), время, необходимое для превышения оптической плотностью предварительно заданного порогового значения. Точное определение активности фактора IX достигают путем сравнения сигнала неизвестных проб с эталоном фактора IX.

Стандартный образец (UCRP) анализировали одновременно. Следует отметить, что все представленные данные соответствуют 1 флакону/при температуре/в момент времени.

ПРИМЕР 1

Фактор IX в стабилизированном составе, содержащем трегалозу, показывал увеличение стабильности во время хранения при 25°С и 40°С.

[0040] Фактор IX был лиофилизирован в каждом из двух исследуемых составов, как показано ниже в таблице 2. Оба состава включали 10 мМ гистидина, 3% маннитола, 66 мМ NaCl, 0.0075% полисорбата 80, рН 6.8. Один из составов (R2) дополнительно содержал трегалозу (1%). Составы исследовали на протяжении 26 недель в условиях хранения в реальном времени при -20°С и 2-8°С, а также при условиях 25°С/60%ОВ и 40°С/75%ОВ. Фактор IX с концентрацией 0.4 мг/мл оценивали на протяжении всего исследования с помощью набора аналитических способов, в том числе, эксклюзионной ВЭЖХ, ионнообменной ВЭЖХ, обращенно-фазовой ВЭЖХ, SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), определения концентрации белка, мутности, рН, визуального внешнего вида (остатка и восстановленной жидкости), остаточной влажности и активности. Конфигурация состава представляла собой 5 мл заполнение в 10 мл стеклянных флаконах.

[0041] Результаты анализа, полученные в каждый момент времени, были стандартизованы путем деления измеренных значений для каждого условия хранения на измеренное значение, полученное для приготовленного продукта, хранящегося при -20°С, которое, по определению, представляет собой 100%. Этот подход был принят с целью минимизировать вариабельность результатов анализа исследовательской лаборатории во время исследования.

ТАБЛИЦА 2
ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ В РАЗНЫЕ МОМЕНТЫ ВРЕМЕНИ
Состав, содержащий	Условия	Недели
фактор IX	хранения	0	2	4	8	12	26
10 мМ гистидина, 3% маннитола, 66 мМ NaCl, 0.0075% полисорбата 80, рН 6.8	-20°С	X	X	X	X	X	X
4°С			X	X	X	X
25°С/60%ОВ		X	X	X	X
40°С/75%ОВ		X	X	X	X
10 мМ гистидина, 3% маннитола, 1% трегалозы, 66 мМ NaCl, 0.0075% полисорбата 80, рН 6.8	-20°C	X	X	X	X	X	X
4°С				X	X	X
25°С/60%ОВ		X	X	X	X
40°С/75%ОВ		X	X	X	X

ТАБЛИЦА 3
Состав без трегалозы
Условия хранения	Константа скорости	Время хранения	% функционального фактора расчет. измерен.	Время хранения	% функционального фактора расчет. измерен	Время хранения	% функционального фактора расчет. измерен
2-8°С	0,00198	12	102%	106%	26	105%	102%	52	111%	н/д
25°С	-	12	79%	74%	26	60%	н/д*	52	36%	н/д
40°С	0,01960	12	11%	15%	26	1%	н/д	52	0%	н/д
	0,18700
Состав с трегалозой
Условия хранения	Константа скорости	Время хранения	% функционального фактора расчет. измерен.	Время хранения	% функционального фактора расчет. измерен	Время хранения	% функционального фактора расчет. измерен
2-8°С	0,00044	12	101%	97%	26	101%	102%	52	102%	н/д
25°С	-0,00390	12	95%	97%	26	90%	90%	52	82%	н/д
40°С	-0,00960	12	89%	99%	26	78%	79%	52	61%	н/д
- нет данных

[0042] Как свидетельствуют результаты, показанные в таблице 3, добавление трегалозы (1%) значительно улучшает стабильность лиофилизированного фактора IX при хранении при условиях 40°С/75%ОВ. Тогда как удельная активность (т.е. активность фактора IX в единицах измерения активности/мг белка в восстановленном лекарственном продукте) состава без трегалозы уменьшилась до -15% в течение 12 недель хранения при условиях 40°С/75%ОВ, удельная активность фактора IX, приготовленного с трегалозой, уменьшилась только незначительно.

[0043] Как показано на фиг.1, анализ скорости ослабления удельной активности на протяжении 12-недельного периода времени подтверждает, что трегалоза уменьшает скорость ослабления при условиях 40°С/75%ОВ в почти 20 раз (-0.0096 нед.^-1 относительно -0.187 нед.^-1).

[0044] Защитное действие трегалозы на стабильность лиофилизированного фактора IX, хранимого в условиях комнатной температуры (номинально 25°С/60%), также заслуживает внимания. Очевидный эффект действия трегалозы состоит в уменьшении скорости ослабления удельной активности в ~5 раз, от 0.0196 нед.^-1 до 0.0039 нед. ^-1 (таблица 3). Кажущаяся скорость ослабления фактора IX, приготовленного с трегалозой, свидетельствует, что лиофилизированный продукт будет стабильным при хранении при комнатной температуре в течение до 26 недель (6 месяцев). Измеренные и расчетные значения удельной активности подтверждают, что приготовленный с трегалозой фактор IX может сохранять ~90% активность через 26 недель (таблица 3).

ПРИМЕР 2

Составы, содержащие фактор IX и трегалозу, проявляют меньшую агрегацию во время хранения лиофилизированного продукта согласно исследованиям с применением эксклюзионной ВЭЖХ (SE-ВЭЖХ)

[0045] Образование высокомолекулярных агрегатов, которые можно обнаружить способом эксклюзионной хроматографии (эксклюзионной ВЭЖХ), снижает видимую чистоту и удельную активность препаратов фактора IX. Добавление трегалозы (1%) к буферу, применяемому для приготовления состава R1, по-видимому, существенно препятствует агрегации фактора IX во время хранения лиофилизированного продукта. Профили элюирования, полученные способом эксклюзионной ВЭЖХ, для приготовленных продуктов R1 и R2 через 12 недель хранения показаны на фиг.2.

[0046] Эксклюзионный анализ фактора IX выполняли с применением колонки Tosoh G3000SWxl (7.8 мм × 30 см, 5 мкм, 250 А) на приборе Agilent 1100 серии ВЭЖХ. При изократическом способе в качестве подвижной фазы применяли 50 мМ Tris, 200 мМ NaCl рН 7.5.

ПРИМЕР 3

Результаты исследования способом эксклюзионной ВЭЖХ в присутствии кальция показали, что фактор IX, хранимый с трегалозой, сохраняет способность подвергаться конформационному изменению, индуцированному кальцием.

[0047] Ионы кальция играют важную роль в функции фактора IX за счет их связывания с фактором IX и индуцирования конформационного изменения в белке, необходимого для поддержания коагулирующей активности. Индуцированное кальцием конформационное изменение, которое уменьшает гидродинамический объем белка в растворе, можно обнаружить в виде уменьшения кажущегося молекулярного веса разными способами, например, с помощью эксклюзионной ВЭЖХ.

[0048] Как можно было наблюдать при непосредственном измерении активности фактора IX (таблица 3), добавление трегалозы (1%) к буферу, применяемому для приготовления состава, резко улучшало стабильность лиофилизированного фактора IX во время хранения в отношении сохранения функции фактора IX, которая, в этом случае, представляет собой способность связывать кальций и подвергаться конформационному изменению, вызванному кальцием. Профили элюирования, полученные способом эксклюзионной ВЭЖХ, в присутствии кальция, для композиций, содержащих фактор IX, в присутствии (R2) и отсутствии (R1) трегалозы через 12 недель хранения показаны на фиг.3. Тогда как процентное содержание функционального фактора IX в приготовленном лекарственном продукте R1 (без трегалозы) уменьшалось до -31% в течение 12 недель хранения при условиях 40°С/75%ОВ, процентное содержание функционального фактора IX в приготовленном лекарственном продукте R2 (+трегалоза) было только незначительно ниже, чем содержание фактора IX, хранимого при низких температурах (-20°С, 2-8°С).

[0049] Как показано на фиг.4, анализ скорости ослабления функции (индуцированного кальцием конформационного изменения) в течение 12-недельного периода подтверждает, что трегалоза уменьшает скорость ослабления при 40°С/75%ОВ в 19 раз (-0.0046 нед.^-1 относительно -0.0853 нед. ^-1), что очень похоже на 20-кратное уменьшение скорости ослабления эффективности (фиг.1).

ПРИМЕР 4

Фактор IX, приготовленный с трегалозой, показывает меньшую загрязненность высокомолекулярными примесями.

[0050] Исследование методом SDS-PAGE выполняли для осуществления прямого визуального сравнения чистоты лиофилизированного фактора IX после хранения в течение 12 недель в различных условиях. Как показано на панели А на фиг.5, следовые количества высокомолекулярных примесей, по-видимому, присутствуют во всех пробах, но это количество прогрессивно больше для фактора IX, который хранили при более высоких температурах. Это наиболее отчетливо видно на линиях 8 и 10 геля при анализе способом SDS-PAGE в не восстановительных условиях, на которых показаны пробы из приготовленного способом R1 фактора IX (без трегалозы), который выдерживали при условиях 25°С/60%ОВ и 40°С/75%ОВ, соответственно. Соответствующие пробы из приготовленного способом R2 фактора IX (плюс трегалоза), показанные на линии 9 и 11, не свидетельствуют об увеличении количества высокомолекулярных примесей по сравнению с пробами фактора IX, приготовленного способами R1 или R2, который хранили при 2-8°С или -20°С (линии 4-7).

[0051] Хотя деградированные формы фактора IX можно было определить в препарате фактора IX, который применяли в настоящем исследовании, их концентрации, по-видимому, не увеличивались со временем хранения в любых экспериментальных условиях. Фактор IX-гамма (Фактор IX ) является укороченной, более низкомолекулярной формой фактора IX, которая образуется, когда интактный белок протеолитически расщепляется в пептидной связи Arg318-Ser319 или около нее с высвобождением пептида с молекулярным весом 10 кДа из карбоксиконцевого участка молекулы. Фактор IX . который присутствует в составах, содержащих фактор IX, можно видеть в гелях при анализе способом SDS-PAGE в не восстановительных условиях (панель А) в виде второстепенной полосы, которая перемещается при кажущемся молекулярном весе приблизительно 45 кДа. Визуальный контроль геля, показанный на панели А, фиг.5, подтверждает, что существенный протеолиз фактора IX до фактора IX не происходил во время хранения на протяжении настоящего исследования.

ПРИМЕР 5

Ионообменная хроматография свидетельствует, что трегалоза стабилизировала композиции, содержащие фактор IX.

[0052] Ионообменная хроматография дает возможность частично разделить изоформы белка, которые различаются по заряду и/или распределению заряда. Исследование фактора IX выполняли способом анионообменной хроматографии с применением колонки GE Healthcare Tricorn MonoQ 5/5ОGL (5×50 мМ, 10 мкм). При применении способа двойного градиента использовали 50 мМ Tris рН 7.5 в качестве подвижной фазы А, и 50 мМ Tris, 1 М NaCl рН 7.5 в качестве подвижной фазы В.

[0053] Применение в настоящем исследовании анионообменной хроматографии приводило к элюированию приготовленного способом R1 фактора IX (без трегалозы) в виде одного симметричного пика, который расширялся со временем при хранении при условиях 40°С/75%ОВ, тогда как элюирование приготовленного способом R2 фактора IX (плюс трегалоза), по-видимому, по-существу, в этом отношении не изменялось. Эти результаты показаны на фиг.6.

Заключение

[0054] При добавлении трегалозы (1%) к составу, применяемому для стабилизации особо чистого лиофилизированного фактора IX в течение по меньшей мере двух лет при 2-8°С, получают даже лучший состав в отношении сохранения структуры и функции белка. Композиция, содержащая фактор IX, без трегалозы (R1) оказалась стабильной при комнатной температуре (25°С/60%ОВ) в течение приблизительно одного месяца. В присутствии трегалозы (R2), лекарственный продукт, содержащий фактор IX, был стабильным в течение приблизительно шести месяцев (исходя из >90% сохраненной активности).

[0055] Если фактор IX приготавливают с трегалозой и без нее в лиофилизированном составе, содержащем гистидин, маннитол, хлорид натрия и полисорбат 80, состав с трегалозой показывает превосходный профиль стабильности во время хранения при 25°С и 40°С, вероятно вследствие криозащитного действия, производимого благодаря свойствам аморфного сухого дисахарида.

[0056] Состав с трегалозой, содержащий фактор IX, демонстрировал данные по стабильности, сравнимые с данными фактора IX, хранимого при температурах охлаждения. Эти данные подтверждают возможность колебаний температуры лекарственного продукта, содержащего фактор IX, в составе с трегалозой при комнатной температуре в течение нескольких недель и возможно даже еще дольше.

[0057] Хранение фактора IX в составе без трегалозы при условиях 40°С/75%ОВ привело к:

- увеличению содержания высокомолекулярных соединений, идентифицированных способом эксклюзионной ВЭЖХ.

- тенденции уменьшения активности на протяжении 12 недель, как определено с помощью одностадийного анализа коагулирующей активности.

- существенному расширению хроматографического профиля, полученного способом ионообменной ВЭЖХ.

[0058] Хранение фактора IX в составе без трегалозы при условиях 25°С/60%ОВ также привело к деградации, как описано выше, хотя и в меньшей степени.

[0059] Не наблюдали существенных различий между составами в отношении морфологии остатков, концентрации, мутности восстановленного продукта или обращенно-фазовой ВЭЖХ.

[0060] Для обоих составов сравнивали 26-недельную стабильность фактора IX при температурах охлаждения и замерзания.

[0061] Уровни остаточной влажности и моменты времени восстановления влагосодержания были немного выше для состава с трегалозой по сравнению с составом, не содержащим трегалозу.

[0062] Специалистам, опытным в данной области техники, следует иметь в виду, что многочисленные и различные изменения могут быть внесены без отступления от сущности настоящего изобретения. Следовательно, необходимо ясно понимать, что указанные формы согласно настоящему изобретению являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.