способ получения концентрата культуральной жидкости активных анаморфных видов грибов рода cordyceps с антибиотической активностью

Формула изобретения

Способ получения концентрата культуральной жидкости активных анаморфных видов грибов Р. farinosus, С. militare, В. brongniartii с антибиотической активностью, включающий культивирование грибов рода Cordyceps на жидких питательных средах (среда Чапека, отвары зерновых, неохмеленное пивное сусло (7%)) в стационарных условиях с последующей концентрацией культуральной жидкости, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют заражение тест-насекомых G. mellonella интрагемоцеллюлярно (введение в гемоцель 0,01 мл суспензии), погружение личинок в суспензию на 30 секунд, инфицирование корма грибами рода Cordyceps для получения вирулентных анаморфных форм, а затем от мумифицированных и меланизированных личинок G. mellonella путем пересева грибов с насекомого на жидкие питательные среды получают биотехнологические культуры, концентрированная культуральная жидкость которых обладает повышенной антибиотической активностью.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области фармакологии и медицины и может найти применение в области онкологии как препараты, обладающие выраженной противоопухолевой активностью, а также для лечения таких заболеваний, как бронхит, пневмония, туберкулез, цирроз, ревматизм, действует как натуральный антибиотик, укрепляет здоровье, продлевает жизнь.

Хорошо известны БАД Cordyceps (Кордицепс NSP), используя которые, китайская женская команда по легкой атлетике установила мировые рекорды в 1993-1994 годах (http://vitolife.ru/product/bad-cordyceps-kordiceps-ot-kompanii-nsp).

Препарат Cordycepin from Cordyceps militaris (Sigma-Aldrich) известен как антибиотик и противораковый препарат. Cordyceps получил известность в коммерческой реализации как «гриб-насекомое», на его основе производят различные БАДы и лекарственные препараты. Род Cordyceps насчитывает более 200, в практике используют чаще всего два вида - С.sinensis и С.militaris. (Евлахова А.А. Энтомопатогенные грибы. Л.: Наука, 1974. 260 с.; Коваль Э.З. Определитель энтомофильных грибов СССР. Киев: Наукова думка, 1974. 260 с.; Коваль Э.З. Клавиципитальные грибы СССР. Киев: Наукова думка, 1984. - 287 с.). Насекомое со стромами находят в лесной подстилке, это телеоморфная стадия гриба (мейотическое половое спороношение). Как правило, для поражения насекомого и прорастания стромы нужно несколько месяцев. Наряду с телеоморфной стадией присутствует и анаморфная (бесполая) стадия, где размножение гриба происходит путем митотических делений, конидиями. Собираемые в природе насекомые со стромами, пораженные грибами (телеоморфная стадия), встречаются не часто и являются достаточно дорогим товаром. Корпорации, которые занимаются производством препаратов на основе грибов рода Cordyceps (китайские, японские, корейские и др.), чаще всего используют анаморфную стадию развития таких грибов, как Paecilomyces hepiali C., P.farinosus (Dicks et Fr.), Brown a Smith (телеоморфа С.sinensis (Berk.) Sacc.); Cephalosporium militare Y.Kabaysi (телеоморфа С.militaris (Fr.).

Известен гриб С.sinensis, паразитирующий на насекомых из различных отрядов (Lepidoptera, Coleoptera и др.). Этот гриб собирают в горах Тибета и Непала и используют как основу для получения биотехнологического мицелия и склероция при производстве БАВ и лекарственных препаратов (Коренева Н.В. Кордицепс и иммунная система: Некоммерческое Экспериментальное издание. М.: 2009. - 60 с., илл.).

Известный метод культивирования Cordyceps sinensis (Заявка Кореи № 20100012923, A01G 1/04; A23K 1/14; A23L 1/28, 2010 г.) включает культивирование гриба в питательной среде, содержащей 1-3% кожицы цитрусовых, отруби риса 3%, патоку 1% и дрожжи, и получение 2% культуры Cordyceps sinensis при температуре 25-35°С в течение 4-7 дней.

Известен способ культивирования гриба Cordyceps (Заявка Китая № 101215527, C12N 1/14, 2008 г.), в котором дикая и естественная спора, порожденная на Тибетском плато, привита организму куколки тутового шелкопряда после искусственного проращивания в куколке тутового шелкопряда.

Ближайшим аналогом является способ выращивания Cordyceps sinensis (Патент США № 6737065, A23K 1/00, A23K 1/175, A23L 1/28, 2004 г.) в бульонах, содержащих воду от мытья от зерен, таких как рис, клейкий рис, ячмень, пшеница, просо, клейкое сорго обыкновенное, клейкое просо борова, и Кукушкины слезки с добавлением хрома, селена и германия.

Недостатком известного способа являются сложные и многокомпонентные составы питательной среды, ее несбалансированность по составу для многоразового использования, поэтому состав среды сложно унифицировать.

Задачей предлагаемого изобретения является стабильность и предсказуемость результатов за счет использования стандартных питательных сред и пассажей Cordyceps через тестовых насекомых.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения концентрата культуральной жидкости анаморфных видов грибов рода Cordyceps с антибиотической активностью, включающем культивирование грибов рода Cordyceps на жидких питательных средах в стационарных условиях с последующей концентрацией культуральной жидкости, дополнительно осуществляют заражение тест-насекомых грибами рода Cordyceps для получения вирулентных анаморфных форм и затем от мумифицированных и меланизированных насекомых путем пересева грибов с насекомых на стандартные жидкие питательные среды получают биотехнологические культуры, концентрированная культуральная жидкость которых обладает повышенной антибиотической активностью.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Биологическая активность грибов рода Cordyceps зависит прежде всего от вирулентной активности. Среди грибов рода Cordyceps только немногие виды (Р.farinosus, С.militart, B.brongniartii) способны вызвать микоз тест-насекомых с достаточно высоким % гибели. Поэтому проводят отбор вирулентных форм после обнаружения пораженных кордицепсами насекомых в биогеоценозах, используя различные методы заражения: интрагемоцеллюлярно (введение в гемоцель 0,01 мл суспензии), погружение личинок в суспензию на 30 секунд, инфицирование корма. В качестве тест-насекомых используются личинки Galleria mellonella. Для заражения используют различный по составу инфекционный материал:

1. Р.farinosus (телеоморфа С.sinensis) - суспензия из растертых в порошок стром, склероций и мицелия, доза заражения личинок G.mellonella максимальная;

2. С.militare (телеоморфа С.militarise - такой же материал, как в п.1, доза заражения личинок G.mellonella максимальная;

3. В.brongniartii (телеоморфа С.brongniartii) - суспензия, состоящая из конидий и мицелия, доза заражения личинок G.mellonella максимальная (табл.1).

Таблица 1
Заражение личинок G.mellonella различными способами для отбора вирулентных форм грибов рода Cordyceps (в каждом варианте опыта использовали по 30 личинок G.mellonella)
Видовое название гриба	Состав инфекционного материала	Гибель личинок G.mellonella (%) при заражении путем
интрагемоцеллюлярным (введение в гемоцель личинкам 0,01 мл суспензии)	погружения в водную суспензию	скармливания инфицированного корма
P.farinosus (телеоморфа С.sinensis)	Стромы + склероций + мицелий	33,3	0	0
C.militare (телеоморфа С.militaris)	Стромы + склероций + мицелий	60,0	16,6	0
В.brongniartii (телеоморфа С.brongniartii)	Склероций + мицелий	100,0	43,3	36,6
	Контроль - вода	0	0	0

Грибы рода Cordyceps относятся к видам средней вирулентной активности, поэтому для поражения ими насекомых наиболее подходящим местом является лесная подстилка. Период заражения длится несколько месяцев. При заражении насекомых грибами Cordyceps возникает инфекционное заболевание, которое часто заканчивается гибелью насекомых с признаками мускардиноза (мумифицирование насекомых). На первом этапе микозы сопровождаются меланизацией - окислением фенольных соединений, катализируемым ферментом полифенолоксидазой. Одной из предпосылок меланизации следует считать резкое увеличение в крови насекомых количества гемоцитов, содержащих полифенолоксидазу, непосредственно после попадания микроорганизма в полость тела (Евлахова А.А., Павлюшин В.А. Механизмы защиты у насекомых от грибных патогенов в связи с факторами вирулентности. В сб.: Микроорганизмы в защите растений. - Иркутск: изд-во Иркут. ун-та, 1983. - 156 с.). Меланизация у насекомых, например у личинок большой вощинной моли (G.mellonella L.), характеризуется наличием черно-бурых пятен, которые появляются за несколько дней до гибели. Форма, размеры, расположение и количество пятен не зависят от вида гриба, но коррелируют с вирулентностью штамма. Так, при заражении высоковирулентными штаммами Metarhizium anisopliae и В.bassiana у личинок G.mellonella в большом количестве регистрировали мелкие бурые пятна (Логинов Е.В. Развитие меланоза и изменения плотности тела при бактериально-грибных смешанных инфекциях личинок большой пчелиной огневки. В сб.: Энтомопатогенные микроорганизмы и их использование в народном хозяйстве. - Иркутск: изд-во Иркут. ун-та, 1992. - 121 с.). Бурые пятна кутикулы насекомых представляют собой меланотическую капсулу или меланотический тромб, где кроме меланина и склеротина находятся протеины и аминокислоты. Поскольку лекарственное сырье, например С.sinensis, представляет гриб-насекомое, то ценность мумифицированных насекомых с большим количеством меланина в кутикуле значительно выше.

Признак меланизации личинок G.mellonella взят в качестве теста при отборе грибов рода Cordyceps. Мумифицированные меланизированные личинки G.mellonella служили основой для получения биотехнологических культур.

Для этого личинки выкладывали на стерильную влажную фильтровальную бумагу в чашки Петри и после их обрастания грибами производили пересев грибов на стерильные жидкие питательные среды: Чапека (NaNO₃ - 3 г; KH₂PO₄ - 1 г; MgSO₄·7 H₂O - 0,5 г; KCl - 0,5 г; FeSO₄ - 0,01 г; сахароза - 30 г; вода (дистиллированная) - 1 л) отвары злаков (овес (пшеница) - 100 г отваривается в течение 1 ч в 1 л воды, фильтруется, добавляется 30 г сахарозы), неохмеленное пивное сусло (1 л пивного сусла 7-8° по Баллингу). Указанные среды являются стандартными для оптимального роста многих микроскопических грибов, в том числе и энтомопатогенных, в данном случае для грибов рода Cordyceps.

Культивирование осуществляют в колбах в стационарных условиях. После 14-дневного культивирования при температуре 24-26°С культуральную жидкость (КЖ) отделяют фильтрованием и концентрируют при трехкратном замораживании. Для этого КЖ грибов, выращенных на жидкой питательной среде, отделяли от мицелия фильтрованием, а затем концентрировали вымораживанием в цилиндрах при температуре 18°С. После размораживания светлую часть КЖ отделяли. Повторяли замораживание трижды. Таким образом, КЖ освобождали от связанной воды и низкомолекулярных фракций жизнедеятельности грибов.

Пример 2. Жидкие концентраты КЖ анаморфных форм Р.farinosus, C.militare, В.brongniartii проверяли на антибиотическую активность. Для этого в центр чашки Петри со стерильной агаризованной средой РПА помещали стерильные стандартные диски фирмы BioMerieux, пропитанные исследуемыми концентратами КЖ грибов (табл.2).

Таблица 2
Антибиотическая активность анаморфных видов грибов рода Cordyceps
Анаморфные грибы рода Cordyceps	Зона задержки роста тест культур микроорганизмов (мм)
Sarcina rubra S2	Bacillus mycoides B27	Bacillus megaterium B35	Staphylococcus sp. St.34
Р.farinosus	6,60±0,10	6,43±0,03	5,60±0,21	5,13±0,49
С.militare	9,00±0,01	8,07±0,43	8,77±0,09	8,73±0,09
В.brongniartii	9,00±0,01	8,83±0,12	8,82±0,03	8,85±0,09

Пример 3. Одновременно с выявлением антибиотической активности анаморфных видов рода Cordyceps, определяли антибиотическую активность и телеоморфных стадий развития грибов этого рода. Постановка эксперимента осуществлялась по той же методике, что и для анаморфной стадии, но материалом служили спиртовые экстракты, полученные:

- для гриба С.sinensis - из стром, склероция и мицелия;

- для гриба С.militaris - из стром;

- для гриба С.brongniartii - из склероция и мицелия (табл.3).

Таблица 3
Антибиотическая активность телеоморфных видов грибов рода Cordyceps
Телеоморфные грибы рода Cordyceps	Зона задержки роста тест культур микроорганизмов (мм)
Sarcina rubra S2	Bacillus mycoides B27	Bacillus megaterium B35	Staphylococcus sp. St.34
С.sinensis	7,00±0,50	5,43±0,15	4,10±0,12	7,30±0,12
С.militaris	7,60±0,15	6,70±1,00	4,63±0,07	4,90±0,31
С.brongniartii	6,37±0,09	7,03±0,03	7,53±0,12	6,40±0,10

Для грибов рода Cordyceps как для анаморфных стадий развития (концентрированная КЖ биотехнологических культур), так и для телеоморфных прослеживается общая закономерность (таблицы 1-3), чем выше вирулентность культур (% гибели насекомых) с последующей мумификацией и меланизацией, тем выше антибиотическая активность.

Технический эффект заключается в унификации процесса получения концентрата культуральной жидкости анаморфных видов грибов рода Cordyceps. Учитывая распространенность препаратов на основе этих грибов, и то, что они не всегда отвечают требованиям терапевтической практики, способ позволяет получать биотехнологические культуры грибов рода Cordyceps на стандартных питательных средах со стабильными антибиотическими свойствами.