ферментативная противоопухолевая терапия

Формула изобретения

1. Способ лечения пациента, имеющего опухоль, включающий введение эффективного количества аденозиндеаминазы пациенту, нуждающемуся в этом, где опухоль является солидной опухолью и где аденозиндеаминаза конъюгирована с, по существу, неантигенным полимером, где после лечения опухоль проявляет уменьшенный объем или уменьшенную скорость роста.

2. Способ по п.1, где опухоль является злокачественной.

3. Способ по п.1, где количество вводимой аденозиндеаминазы является эффективным, чтобы существенно снизить уровни аденозина или дезоксиаденозина в ткани указанного пациента, и где рост или распространение опухоли ингибируется в результате снижения уровней аденозина в ткани указанного пациента.

4. Способ по п.1, где опухоль выбрана из группы, состоящей из опухоли предстательной железы, рака яичников и колоректального рака.

5. Способ по п.1, где, по существу, неантигенный полимер является полиалкиленоксидом.

6. Способ по п.5, где полиалкиленоксид является полиэтиленгликолем.

7. Способ по п.5, где размер, по существу, неантигенного полимера варьирует от приблизительно 4000 до приблизительно 45000 Дальтон.

8. Способ по п.1, где конъюгированную аденозиндеаминазу вводят в дозе от приблизительно 10 Е до приблизительно 30 Е на кг.

9. Способ по п.1, где конъюгированную аденозиндеаминазу вводят в течение периода времени, достаточного для поддержания ингибирования опухоли.

10. Способ по п.1, где аденозиндеаминазу вводят в течение периода времени от 1 до приблизительно 20 дней.

11. Способ по п.1, где конъюгат включает две или более молекул аденозиндеаминазы на, по существу, неантигенный полимер.

12. Способ по п.1, где аденозиндеаминаза включает от приблизительно 11 до приблизительно 18 цепей полиэтиленгликоля, присоединенных к эпсилон-аминогруппам одного или нескольких остатков Lys в аденозиндеаминазе.

13. Способ по п.12, где аденозиндеаминаза конъюгирована с полиэтиленгликолем через уретановую связь.

14. Способ по п.1, где аденозиндеаминазу вводят путем, выбранным из группы, состоящей из подкожного, внутривенного, внутримышечного, интратекального, внутрибрюшинного, ингаляционного и трансуретрального путей введения.

15. Способ по п.1, где аденозиндеаминаза является аденозиндеаминазой, выделенной из источника, относящегося к крупному рогатому скоту, или является рекомбинантной аденозиндеаминазой.

16. Способ по п.15, где рекомбинантная аденозиндеаминаза выбрана из группы, состоящей из рекомбинантной бычьей аденозиндеаминазы, включающей SEQ ID NO: 1, рекомбинантной аденозиндеаминазы человека, включающей SEQ ID NO: 3, и рекомбинантной бычьей аденозиндеаминазы, включающей SEQ ID NO: 5.

17. Способ по п.16, где рекомбинантная бычья аденозиндеаминаза, включающая SEQ ID NO: 5, включает Cys74, который кэпирован с целью предотвращения окисления в водной среде.

18. Способ по п.16, где рекомбинантная аденозиндеаминаза соответствует SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5 с аминокислотной заменой, выбранной из группы, состоящей из Gln вместо Lys₁₉₈; Ala вместо Thr245; Arg вместо Gly₃₅₁, и их комбинаций.

19. Способ ингибирования роста опухоли у млекопитающего, включающий введение эффективного количества аденозиндеаминазы или ее активного фрагмента млекопитающему, нуждающемуся в этом, где опухоль является солидной опухолью и где аденозиндеаминаза или ее активный фрагмент конъюгирован с, по существу, неантигенным полимером, где после лечения опухоль проявляет уменьшенный объем или уменьшенную скорость роста.

Описание изобретения к патенту

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 60/913,039, поданной 20 апреля 2007 г., содержание которой включено в настоящую заявку путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение представляет новые способы лечения и замедления роста опухолей, а в особенности злокачественных солидных опухолей, посредством введения аденозиндеаминазы для восстановления уровней аденозина и дезоксиаденозина в тканях.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Опухоль представляет собой доброкачественное или злокачественное образованием клеток или ткани, которое является результатом нерегулируемой клеточной пролиферации. Злокачественная опухоль является такой опухолью, которая распространяется из участка своего образования, и также известна в уровне техники как рак. Таким образом, опухоли и раковые опухоли представляют собой группу заболеваний, обладающих общим свойством нерегулируемого или ненадлежащего роста клеток. В широком смысле, злокачественные опухоли являются либо опухолями, происходящими из кроветворных клеток, такими как лейкоз, либо солидными опухолями. Злокачественные опухоли, происходящие из кроветворных клеток, обычно циркулируют в крови, а солидные злокачественные опухоли распространяются от первичной опухоли по всему телу. Затем распространенные опухолевые клетки могут развиться во множественные вторичные опухоли в процессе метастазирования. Чтобы солидная опухоль могла подвергнуться такому метастатическому распространению, клетки солидной опухоли должны покинуть первичную или исходную опухоль, попасть в кровоток или лимфатическую систему, а затем оттуда проникнуть в ткань других органов, где они делятся и формируют новые опухоли. Метастазирование представляет собой сложный многостадийный процесс, который включает изменения адгезии и подвижности опухолевых клеток, секрецию протеолитических ферментов, хемоатрактантов и протеогликанов, а также другие факторы. Кроме того, ангиогенез или формирование новых кровеносных сосудов также является существенно важным этапом в метастатическом процессе (Folkman, 1995, Nature Medicine 1:27-31).

Иммунная система, как было также показано, ингибирует метастазирование таких злокачественных опухолевых клеток, при этом сообщалось, что аденозин, в свою очередь, может ингибировать такие иммунные защитные реакции. Например, Loshkin и др. (2006, Cancer Res., 66: 7758-7765) сообщали, что аденозин ингибирует активацию и выработку цитокина в киллерных T-клетках. Аденозин отрицательно воздействует на другую свободную функцию, включая клеточные элементы и воспалительные функции (см., например, обзоры Spychala, 2000, Pharmacology & Therapeutics, 87:161-173 и Sitkovesky et al., 2005, Nature Reviews Immunology, 5:713-721). Sitkovesky и др. в WO 03/050241, опубликованном 19 июня 2003 г., также описали способы усиления иммунного ответа на антиген и лечения опухолей путем введения антагониста аденозинового рецептора, который может включать аденозиндеаминазу.

Также было показано, что аденозин способствует миграции опухолевых клеток и ангиогенезу (Barcz et al., 2000, Oncol. Rep., 7(6):1285-91; Adair, 2005, Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 289:R283-R296) и что аденозин стимулирует пролиферацию клеток колоректального рака (Mujoomdar et al., 2003, Biochemical Pharmacology, 66:1737-1747). Asmar и др. (1966, Proc. Am. Assoc. Cancer Res., Реферат № 73) также сообщали, что в мышиной модели асцита рост некоторых опухолевых клеток, более чем на 50%, ингибировала инъекция АДА. Это были клетки лимфатических лейкозов L1210 и L4946, лимфосаркомы 6C3HED, аденокарциномы молочной железы TA3, а также карциномы Эрлиха E2. В том же реферате аденокарцинома 755, как сообщали, была в два раза более устойчивой, а саркома 180 - полностью устойчивой к указанному эффекту. В WO03050241 A2 описаны эффекты ингибитора аденозиновых рецепторов в отношении клеток меланомы B 16. Хотя в WO03050241 A2 АДА упоминается как ингибитор аденозина, не приведено никакого конкретного описания применения АДА при лечении конкретных раковых опухолей, а в частности рака яичников и рака простаты.

Таким образом, для некоторых опухолей присутствие аденозина, по-видимому, обеспечивает сигнал "пуска" пролиферации опухоли и ангиогенеза опухоли, а также сигнал "стоп" для киллерных T-клеток, которые обычно уничтожали бы данные опухоли.

В противоположность вышеописанным результатам Lind и др. (патент США 6579857) сообщили, что аденозин в комбинации с ингибитором фермента аденозиндеаминазы и/или в комбинации с противоопухолевым средством, таким как коформицин, может применяться в способе потенцирования гибели неопластических клеток эпителиального происхождения. Таким образом, данная ссылка позволяет предположить, что роль аденозина в раке является более сложной и неустановленной.

Как указано выше, средством для снижения уровней эндогенного аденозина является фермент аденозиндеаминаза. Аденозиндеаминаза (АДА), обозначенная как EC 3.5.4.4, является важным ферментом в метаболизме пурина. АДА превращает аденозин или дезоксиаденозин, в присутствии воды, в инозин или дезоксиинозин и аммиак. Известно, что у людей, в гене АДА которых присутствуют неблагоприятные мутации, могут развиться иммунодефицитные состояния различной степени, от умеренной до тяжелой, то есть тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД). ТКИД, как было подтверждено, возникает в результате токсического накопления субстратов фермента, аденозина и дезоксиаденозина, в незрелых лимфоцитах. Начало заболевания может варьировать от раннего детского возраста до взрослого состояния, в зависимости от наследуемых мутаций. Дефицит АДА является одной из ведущих причин ТКИД у детей и служит одной из главных целей для методов генной терапии (R. Parkman et al., 2000, "Gene therapy for adenosine deaminase deficiency", Aim. Rev, Med., 51:33-47).

Ранее АДА выделяли в промышленном масштабе из источников, полученных из крупного рогатого скота, и применяли при лечении ряда заболеваний, включая ТКИД, в форме бычьей АДА, конъюгированной с полимером - полиэтиленгликолем (ПЭГ). ПЭГилированная АДА для медицинского применения коммерчески поставляется компанией Энзон Фармасьютикалз под торговой маркой ADAGEN^® (ПЭГилированная АДА). Конъюгирование молекулы ПЭГ с АДА позволяет ферменту произвести свой полный терапевтический эффект благодаря повышению продолжительности циркуляции с сохранением при этом по сути неантигенности АДА в целях минимизации возможности развития иммуногенных реакций. Также можно получать рекомбинантные человеческие или бычьи ферменты АДА для применения в форме конъюгатов, как описано в заявке на патент США 11/738,012 (настоящего заявителя), озаглавленной "Стабилизированные белки" (Stabilized Proteins), и заявке на патент США______(настоящего заявителя), озаглавленной "Стабильная рекомбинантная аденозиндеаминаза" (Stable Recombinant Adenosine Deaminase), поданной в одну и ту же дату с настоящей заявкой и испрашивающей приоритет заявки на патент США 60/913,009, которые полностью включены в настоящую заявку путем отсылки.

Таким образом, в уровне техники существует многолетняя потребность в новых и улучшенных способах лечения или ингибирования роста, распространения и развития раковых опухолей.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В этой связи изобретение обеспечивает способ лечения пациента, имеющего опухоль, включающий введение эффективного количества АДА пациенту, испытывающему в этом потребность. Эффективное количество является количеством, которое, как легко может определить средний специалист в данной области, снижает уровни аденозина или дезоксиаденозина в тканях пациента, и где рост или распространение опухоли ингибируется в результате существенного снижения уровней аденозина в тканях пациента. Путь введения является таким путем, как подкожный, внутривенный, внутримышечный, интратекальный, внутрибрюшинный, ингаляционный и трансуретральный.

Опухоль может быть злокачественной или доброкачественной и предпочтительно является солидной опухолью, например такой опухолью, как опухоль простаты, рак яичников и/или колоректальный рак.

Аденозиндеаминаза предпочтительно конъюгирована с по существу неантигенным полимером, таким как полиалкиленоксид (ПАО). Предпочтительно размер ПАО изменяется в диапазоне от приблизительно 4000 до приблизительно 45000 дальтон. ПАО предпочтительно является полиэтиленгликолем (ПЭГ). Молярное отношение АДА к полимеру может составлять 1:1, или на молекулу полимера может приходиться две или более молекул АДА, или, более предпочтительно, от приблизительно 1 до приблизительно 20 полимерных молекул (то есть 11-18 цепей ПЭГ) на молекулу АДА.

АДА-полимерный конъюгат предпочтительно вводят в дозе, варьирующей в диапазоне от приблизительно 10 Е до приблизительно 30 Е на кг или больше, и в течение достаточного промежутка времени, чтобы поддерживать ингибирование опухоли, например, от приблизительно 1 до приблизительно 20 дней или дольше.

Количество аденозиндеаминазы, которое вводят, является эффективным, чтобы существенно понизить уровни аденозина или дезоксиаденозина в тканях пациента, и где рост или распространение опухоли ингибируются в результате существенного снижения уровней аденозина в тканях указанного пациента. Например, это - доза аденозиндеаминазы, изменяющаяся в диапазоне от приблизительно 10 Е до приблизительно 30 Е на кг. Дозу вводят повторно в течение достаточного промежутка времени, чтобы поддерживать ингибирование опухоли, например, в течение от приблизительно 1 до приблизительно 20 дней или дольше. Дозу вводят любым подходящим путем, например подкожно, внутривенно, внутримышечно, интратекально, внутрибрюшинно, ингаляционно и трансуретрально.

Аденозиндеаминаза необязательно выделена из источника, который относится к крупному рогатому скоту, или является рекомбинантной аденозиндеаминазой. Рекомбинантная аденозиндеаминаза является, например, рекомбинантной бычьей аденозиндеаминазой (Ser₇₄-рбАДА), включающей SEQ ID NO: 1, рекомбинантной аденозиндеаминазой человека (Ser₇₄-рчАДА) включающей SEQ ID NO: 3, и рекомбинантной бычьей аденозиндеаминазой, включающей SEQ ID NO: 5, и/или их вариантами или полиморфизмами. Рекомбинантно полученная бычья аденозиндеаминаза, например SEQ ID NO: 5, необязательно кэпирована по Cys₇₄ для повышения стабильности в водной среде.

В рамках настоящего изобретения термин "остаток", как следует понимать, означает ту часть соединения, к которому она относится, например ПЭГ, АДА, аминокислоту и т.д., которая остается после того, как она подверглась реакции замещения другим соединением.

В рамках настоящего изобретения термин "полимерный остаток", например, "остаток ПЭГ", как следует понимать, означает ту часть полимера или ПЭГ, которая остается после того, как он подвергся реакции с другими соединениями, группами и т.д.

В рамках настоящего изобретения термин "алкил", используемый в настоящем описании, относится к насыщенному алифатическому углеводороду, включая линейные, разветвленные и циклические алкильные группы. Термин "алкил" также включает алкил-тио-алкильные, алкоксиалкильные, циклоалкилалкильные, гетероциклоалкильные и C_1-6-алкилкарбонилалкильные группы. Предпочтительно алкильная группа включает 1-12 атомов углерода. Более предпочтительно алкильная группа является низшим алкилом, включающим приблизительно 1-7 атомов углерода, наиболее предпочтительно приблизительно 1-4 атома углерода. Алкильная группа может быть замещена или незамещена. Когда алкильная группа замещена, замещенная группа (группы) предпочтительно включает гало, окси, азидо, нитро, циано, алкил, алкокси, алкил-тио, алкил-тио-алкил, алкоксиалкил, алкиламино, тригалометил, гидроксил, меркапто, гидрокси, циано, алкилсилил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, гетероарил, алкенил, алкинил, C_1-6-гидрокарбонил, арил и амино.

В рамках настоящего изобретения термин "замещенный", используемый в настоящем описании, относится к добавлению или замене одного или нескольких атомов, содержащихся в пределах функциональной группы или соединения, одной из групп, выбранных из гало, окси, азидо, нитро, циано, алкил, алкокси, алкил-тио, алкил-тио-алкил, алкоксиалкил, алкиламино, тригалометил, гидроксил, меркапто, гидрокси, циано, алкилсилил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, гетероарил, алкенил, алкинил, C_1-6 -алкилкарбонилалкил, арил и амино.

В рамках настоящего изобретения термин "алкенил" относится к группам, содержащим, по меньшей мере, одну углерод-углеродную двойную связь, включая линейные, разветвленные и циклические группы. Предпочтительно алкенильная группа включает приблизительно 2-12 атомов углерода. Более предпочтительно алкенильная группа является низшим алкенилом, включающим приблизительно 2-7 атомов углерода, наиболее предпочтительно приблизительно 2-4 атома углерода. Алкенильная группа может быть замещена или незамещена. Когда алкенильная группа замещена, замещенная группа (группы) предпочтительно включает гало, окси, азидо, циано, нитро, алкил, алкокси, алкил-тио, алкил-тио-алкил, алкоксиалкил, алкиламино, тригалометил, гидроксил, меркапто, гидрокси, циано, алкилсилил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, гетероарил, алкенил, алкинил, C_1-6-алкилкарбонилалкил, арил и амино.

В рамках настоящего изобретения термин "алкинил" относится к группам, содержащим, по меньшей мере, одну углерод-углеродную тройную связь, включая линейные, разветвленные и циклические группы. Предпочтительно алкинильная группа включает приблизительно 2-12 атомов углерода. Более предпочтительно алкинильная группа является низшим алкинилом, включающим приблизительно 2-7 атомов углерода, наиболее предпочтительно приблизительно 2-4 атома углерода. Алкинильная группа может быть замещена или незамещена. Когда алкинильная группа замещена, замещенная группа (группы) предпочтительно включает гало, окси, азидо, нитро, циано, алкил, алкокси, алкил-тио, алкил-тио-алкил, алкоксиалкил, алкиламино, тригалометил, гидроксил, меркапто, гидрокси, циано, алкилсилил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, гетероарил, алкенил, алкинил, C_1-6-гидрокарбонил, арил и амино. Примеры "алкинила" включают пропаргил, пропин и 3-гексин.

В рамках настоящего изобретения термин "арил" относится к ароматической углеводородной кольцевой системе, содержащей, по меньшей мере, одно ароматическое кольцо. Ароматическое кольцо необязательно может быть сконденсировано или иным образом присоединено к другим ароматическим углеводородным кольцам или неароматическим углеводородным кольцам. Примеры арильных групп включают, например, фенил, нафтил, 1,2,3,4-тетрагидронафталин и бифенил. Предпочтительные примеры арильных групп включают фенил и нафтил.

В рамках настоящего изобретения термин "циклоалкил" относится к циклическому C_3-8-углеводороду. Примеры циклоалкила включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил.

В рамках настоящего изобретения термин "циклоалкенил" относится к циклическому C_3-8-углеводороду, содержащему, по меньшей мере, одну углерод-углеродную двойную связь. Примеры циклоалкенила включают циклопентенил, циклопентадиенил, циклогексенил, 1,3-циклогексадиенил, циклогептенил, циклогептатриенил и циклооктенил.

В рамках настоящего изобретения термин "циклоалкилалкил" относится к алкильной группе, замещенной C_3-8-циклоалкильной группой. Примеры циклоалкилалкильной группы включают циклопропилметил и циклопентилэтил.

В рамках настоящего изобретения термин "алкокси" относится к алкильной группе с указанным количеством атомов углерода, присоединенной к основной части молекулы через кислородный мостик. Примеры алкоксигрупп включают, например, метокси, этокси, пропокси и изопропокси.

В рамках настоящего изобретения "алкиларильная" группа относится к арильной группе, замещенной алкильной группой.

В рамках настоящего изобретения "аралкильная" группа относится к алкильной группе, замещенной арильной группой.

В рамках настоящего изобретения термин "алкоксиалкильная" группа относится к алкильной группе, замещенной алкоксигруппой.

В рамках настоящего изобретения термин "алкил-тио-алкил" относится к алкил-S-алкил-тиоэфиру, например метилтиометилу или метилтиоэтилу.

В рамках настоящего изобретения термин "амино" относится к азотсодержащей группе, которая, как известно из уровня техники, получена из аммиака путем замещения одного или нескольких водородных радикалов органическими радикалами. Например, термины "ациламино" и "алкиламино" относятся к определенным органическим радикалам, N-замещенным ацильной и алкильной замещающими группами соответственно.

В рамках настоящего изобретения термин "алкилкарбонил" относится к карбонильной группе, замещенной алкильной группой.

В рамках настоящего изобретения термины "галоген" или "гало" относятся к фтору, хлору, брому и иоду.

В рамках настоящего изобретения термин "гетероциклоалкил" относится к неароматической кольцевой системе, содержащей, по меньшей мере, один гетероатом, выбранный из азота, кислорода и серы. Гетероциклоалкильное кольцо необязательно может быть сконденсировано или иным образом присоединено к другим гетероциклоалкильным кольцам и/или неароматическим углеводородным кольцам. Предпочтительные гетероциклоалкильные группы включают от 3 до 7 членов. Примеры гетероциклоалкильных групп включают, например, пиперазин, морфолин, пиперидин, тетрагидрофуран, пирролидин и пиразол. Предпочтительные гетероциклоалкильные группы включают пиперидинил, пиперазинил, морфолинил и пирролидинил.

В рамках настоящего изобретения термин "гетероарил" относится к ароматической кольцевой системе, содержащей, по меньшей мере, один гетероатом, выбранный из азота, кислорода и серы. Гетероарильное кольцо может быть сконденсировано или иным образом присоединено к одному или нескольким гетероарильным кольцам, ароматическим или неароматическим углеводородным кольцам или гетероциклоалкильным кольцам. Примеры гетероарильных групп включают, например, пиридин, фуран, тиофен, 5,6,7,8-тетрагидроизохинолин и пиримидин. Предпочтительные примеры гетероарильных групп включают тиенил, бензотиенил, пиридил, хинолил, пиразинил, пиримидил, имидазолил, бензимидазолил, фуранил, бензофуранил, тиазолил, бензотиазолил, изоксазолил, оксадиазолил, изотиазолил, бензизотиазолил, триазолил, тетразолил, пирролил, индолил, пиразолил и бензопиразолил.

В рамках настоящего изобретения термин "гетероатом" относится к азоту, кислороду и сере.

В некоторых вариантах осуществления замещенные алкилы включают карбоксиалкилы, аминоалкилы, диалкиламино, гидроксиалкилы и меркаптоалкилы; замещенные алкенилы включают карбоксиалкенилы, аминоалкенилы, диалкениламино, гидроксиалкенилы и меркаптоалкенилы; замещенные алкинилы включают карбоксиалкинилы, аминоалкинилы, диалкиниламино, гидроксиалкинилы и меркаптоалкинилы; замещенные циклоалкилы включают такие группы, как 4-хлорциклогексил; арилы включают такие группы, как нафтил; замещенные арилы включают такие группы, как 3-бромфенил; аралкилы включают такие группы, как толил; гетероалкилы включают такие группы, как этилтиофен; замещенные гетероалкилы включают такие группы, как 3-метокси-тиофен; алкокси включает такие группы, как метокси; и фенокси включает такие группы, как 3-нитрофенокси. Гало, как следует понимать, включает фтор, хлор, иод и бром.

В рамках настоящего изобретения "положительное целое число", как следует понимать, включает целое число, большее или равное 1 и, как будет понятно средним специалистам в данной области, находится в пределах области рациональности.

В рамках настоящего изобретения термин "связанный", как следует понимать, включает ковалентное (предпочтительно) или нековалентное присоединение одной группы к другой, то есть в результате химической реакции.

Понятия "эффективные количества" и "достаточные количества" в рамках настоящего изобретения должны означать количество, которое обеспечивает достижение требуемого эффекта или терапевтического эффекта, причем эффект как таковой понятен средним специалистам в данной области.

В рамках настоящего изобретения термин "аденозин", как следует понимать, включает нуклеозиды аденозин и дезоксиаденозин. Аденозин также включает аденозин и дезоксиаденозин, присутствующие в форме АМФ, АДФ, АТФ, дАМФ, дАДФ или дАТФ.

В рамках настоящего изобретения понятия "аденозин-опосредованная опухоль" или "аденозиндеаминаза-реактивная опухоль", как следует понимать, широко включают любые типы опухолей, при которых успешно применяют введение АДА или ее активной фракции и т.д., независимо от пути введения.

В рамках настоящего изобретения понятия "лечение аденозин-опосредованной опухоли", или "лечение аденозиндеаминаза-реактивной опухоли", или "ингибирование роста аденозин-опосредованной опухоли", или "ингибирование роста аденозиндеаминаза-реактивной опухоли", как следует понимать, означают минимизацию или уменьшение проявления симптомов или состояний, по сравнению с наблюдаемыми в отсутствие лечения с применением АДА. Степень реконвалесценции можно подтвердить, например, по снижению уровня аденозина.

В широком смысле, лечение следует считать успешным, когда получен требуемый клинический ответ. Например, успешность лечения можно подтвердить, получив, например, 10%-ное или выше (то есть 20%-ное, 30%-ное, 40%-ное) ингибирование роста опухоли. В альтернативе успешность лечения можно подтвердить, получив, по меньшей мере, 20%-ное или предпочтительно 30%-ное, более предпочтительно 40%-ное или выше (то есть 50%-ное или 80%-ное) снижение уровня аденозина в раковых клетках или тканях, включая другие клинические показатели, рассматриваемые специалистом в данной области, по сравнению с наблюдаемым в отсутствие лечения с применением АДА, описанного в настоящей заявке.

Кроме того, применение терминов в форме единственного числа для удобства описания никоим образом не следует считать ограничивающим в какой-либо мере. Таким образом, например, ссылка на композицию, включающую фермент, относится к одной или более молекулам данного фермента. Нужно также понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными конфигурациями, стадиями процессов и материалами, описанными в настоящей заявке, поскольку такие конфигурации, стадии процессов и материалы могут несколько изменяться.

Нужно также понимать, что терминология, используемая в настоящей заявке, используется лишь с целью описания конкретных вариантов осуществления и не должна являться ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой и ее эквивалентами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает новые способы лечения опухолей, включая раковые опухоли, посредством введения фермента АДА пациенту, испытывающему в этом потребность, в количестве и в течение некоторого промежутка времени, достаточных для снижения количества аденозина, присутствующего в тканях и/или жидкостях в организме пациента. Предпочтительно фермент АДА конъюгирован с полимером. В отношении опухолей, которые зависят от присутствия аденозина, необходимого для их роста, метастатического распространения и/или для защиты от иммунной системы пациента, достаточное снижение уровня эндогенного аденозина ограничивает или предотвращает развитие рака, распространение метастазов и/или обеспечивает нормальную противоопухолевую активность иммунной системы пациента.

Также предусматривается, что лечение опухолей с применением АДА в соответствии с изобретением необязательно проводят в комбинации или совместно с одним или несколькими другими подходящими, известными из уровня техники способами лечения онкологических заболеваний и противоопухолевыми средствами, как более подробно описано ниже. Комбинированное лечение настоящего изобретения включает введение эффективного количества соединений, описанных в настоящей заявке, отдельно или в комбинации, одновременно или последовательно, со вторым химиотерапевтическим средством.

Примеры известных в уровне техники противоопухолевых средств, предназначенных для подобных способов комбинированного лечения, включают, например, Таксол , бевацизумаб (Авастин 11), винкристин, винбластин, неомицин, комбретастатин(ы), подофиллотоксин(ы), ФНО-альфа, ангиостатин, эндостатин, васкулостатин, антагонисты интегрина альфа_v -бета₃, кальций-ионофоры, средства, индуцирующие поток ионов кальция, а также любые их производные или пролекарства.

Дополнительные противоопухолевые средства также включают химиотерапевтические средства, радиотерапевтические средства, цитокины, антиангиогенные средства, апоптоз-индуцирующие средства или противоопухолевые иммунотоксины или коагулирующие лиганды. Одним из таких иммунотоксинов является, например, Эрбитукс ^® (цетуксимаб). "Химиотерапевтические средства", используемые в настоящей заявке, относятся к классическим химиотерапевтическим средствам или лекарственным средствам, применяемым при лечении злокачественных новообразований. Указанный термин используется для простоты, несмотря на тот факт, что в качестве химиотерапевтических средств технически могут быть указаны другие соединения, которые оказывают противоопухолевое действие. Впрочем, "химиотерапевтический" имеет четкое значение в уровне техники и используется согласно данному стандартному значению.

Таким образом, способ настоящего изобретения может применяться в комбинации с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, которые, как известно, являются эффективными при лечении рака, включающими, помимо прочих, 5-азацитидин, 5-фторурацил, необязательно в комбинации с лейковорином, 5-фтордезоксиуридин, 6-меркаптопурин, 6- тиогуанин, митоксантрон, азиридинилбензохинон (AZQ), кармустин (BCNU или BiCNU^®, Bristol-Myers-Squibb), блеомицин, карбоплатин (CBDCA), ломустин (CCNU), метил-CCNU или MeCCNU, хлорамбуцил, хлордезоксиаденозин, цисплатин, циклофосфамид, цитарабин, дактиномицин, даунорубицин, дезоксикоформицин, доксорубицин, доксикоформицин, DTIC (дакарбазин), эпирубицин, этопозид (VP-16), флударабин, гексаметилмеламин, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, ифосфамид и месна, левамизол, N- ацетилцистеин (NAC), L-фенилаланин мустард, 4'-(9-акридиниламино)-метансульфон-м-анизидид (mAMSA), известные в уровне техники ингибиторы мультирезистентности к лекарственным средствам (то есть ингибиторы MDR), мелфалан, метотрексат, необязательно в комбинации с лейковорином, митрамицин, митомицин-C, ингибиторы белка, ассоциированного с мультирезистентностью к лекарственным средствам (ингибиторы MRP), паклитаксел, прокарбазин, стрептозотоцин, N,N'N'-триэтилентиофосфорамид (tioTEPA), ингибиторы топоизомеразы I и/или топоизомеразы II, таксол, винбластин, винкристин, винкристин, виндезин, тенипозид (VM-26^® ), а также другие, слишком многочисленные для перечисления. Другие способы лечения рака, рассматриваемые для применения в комбинации со способами настоящего изобретения, включают облучение рентгеновским излучением, гамма-излучением, непосредственно или посредством томографического направления, обработку тканей злокачественных опухолей имплантированными радиоактивными гранулами или "зернами", облучение нейтронным пучком тканей, подвергшихся первоначальной обработке соединениями бора, и/или другие известные в уровне техники типы терапии с применением пучка частиц.

Дополнительные противоопухолевые или противораковые средства (противобластомные средства), которые необязательно вводят в комбинации или совместно со способами настоящего изобретения, включают средства, описанные в издании "GOODMAN AND OILMAN'S, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS", TENTH EDITION, Eds. Hardman and Limbird, полностью включенном в настоящую заявку путем отсылки.

В целях более полного понимания изобретения приведено определение следующих терминов.

Ссылка на "аденозин" в настоящем описании также охватывает дезоксиаденозин и их известные из уровня техники варианты и производные, присутствующие in vivo, если не указано иное.

Ссылка на аденозиндеаминазу или АДА включает любую известную из уровня техники форму указанного фермента, включая очищенный природный фермент, например, очищенную природную АДА, рекомбинантную человеческую или бычью АДА, а также их варианты, полиморфизмы и производные. Фермент АДА, выделенный из источников, относящихся к крупному рогатому скоту, имеет последовательность согласно SEQ ID NO: 5, с природно кэпированным или защищенным цистеином остатком Cys₇₄, при этом шесть C-концевых остатков, предсказанных на основе гена, кодирующего АДА SEQ ID NO: 5, не присутствуют. Однако предусматривается, что изобретение может быть осуществлено с альтернативными вариантами природной бычьей АДА, включая альтернативные аллели и полиморфизмы, как природные, так и полученные генно-инженерными методами, с и без предсказанных шести C-концевых остатков. Полиморфизмы бычьей АДА включают, например, глутамин в положении 198 вместо лизина; аланин в положении 245 вместо треонина; аргинин в положении 351 вместо глицина.

Предпочтительные производные фермента АДА включают фермент АДА, полученный генно-инженерными методами, который был мутирован с целью повышения стабильности по сравнению с не мутированным рекомбинантным ферментом АДА. Они включают, например, рекомбинантные ферменты АДА, модифицированные на основе SEQ ID NO: 5 и/или SEQ ID NO: 5 с одним или несколькими вышеуказанными полиморфизмами, чтобы заменить окисляемый гидрофильный остаток Cys подходящим неокисляемым аминокислотным остатком. Такой неокисляемый остаток включает любой известный из уровня техники остаток природной аминокислоты и/или ее любые известные из уровня техники производные. Например, зрелая рекомбинантная АДА, экспрессируемая с гена, первоначально выделенного из источника, относящегося к крупному рогатому скоту или человеку, имеет нестабильный остаток Cys ₇₄, который предпочтительно заменяют неокисляемым аминокислотным остатком, например Ser₇₄. Такие рекомбинантные ферменты АДА приведены в SEQ ID NO: 1 (структура бычьей АДА) и SEQ ID NO: 3 (структура АДА человека). В SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 показаны применяемые молекулы ДНК, предназначенные для экспрессии того же, которые были оптимизированы по кодонам для экспрессии в E. coli. Дополнительные подробности касательно таких рекомбинантных АДА мутеинов, а также получения и очистки указанных белков приведены в заявке на патент США _______, которая испрашивает приоритет заявки на патент США 60/913,009, озаглавленной "Стабильная рекомбинантная аденозиндеаминаза", поданной в одну и ту же дату с настоящей заявкой и включенной в настоящую заявку путем отсылки в полном объеме. Точные данные относительно векторов и способов можно найти в указанной заявке, в особенности в разделе Примеры, а в частности в Примерах 1-4.

В альтернативе ферменты АДА могут быть стабилизированы, при необходимости, посредством кэпирования гидрофильного окисляемого остатка Cys путем обработки фермента АДА достаточным количеством кэпирующего агента, при таких условиях реакции, которые являются достаточными для кэпирования реакционно-способного цистеина, без существенной инактивации белка АДА. В данном процессе предпочтительно используют АДА, полученную генно-инженерными методами, в форме мутеина или фермента дикого типа.

Например, кэпирующие агенты включают без ограничения окисленный (предпочтительно) глутатион, иодацетамид, иодуксусную кислоту, цистин и другие дитиолы, известные средним специалистам в данной области, а также их смеси. Количество и концентрация кэпирующего агента, вводимого в ходе реакционной фазы способов, описанных в настоящей заявке, в некоторой степени зависит от конкретного используемого кэпирующего агента и потребностей специалиста, но не будет подвергаться излишнему экспериментальному исследованию. При использовании окисленного глутатиона в качестве прототипа его концентрация, используемая в ходе взаимодействия с рекомбинантным белком, таким как рчАДА, может варьировать приблизительно от 25 мкМ до приблизительно 100 мМ. Предпочтительно окисленный глутатион взаимодействует с рекомбинантным белком при концентрации приблизительно от 5 нМ до приблизительно 25 мм.

Условия реакции, используемые в ходе взаимодействия кэпирующего агента и рекомбинантного белка, дополнительно включают использование водного раствора, имеющего pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,4, предпочтительно от приблизительно 7,2 до приблизительно 7,8. Кроме того, водный раствор предпочтительно включает подходящий буферный раствор, такой как натрий фосфатный, калий фосфатный, Трис и HEPES, а также их смеси в концентрациях от 10 до 150 мМ (необязательно кэпирование может выполняться при концентрациях буфера, находящихся вне указанного диапазона, например ниже 10 или выше 150 мМ). Условия реакции дополнительно включают проведение реакции при температурах, которые не будут способствовать деградации белка, то есть при температурах приблизительно 4-37°C. Необязательно кэпирование может выполняться вне указанного диапазона температур, например в диапазоне температур ниже 0-4°C или выше 31°C. Реакцию проводят в течение времени, которое является достаточным, чтобы достичь требуемой стабилизации реакционно-способного цистеина. Просто в качестве примера реакцию проводят в течение от приблизительно 5 секунд до приблизительно 8 часов (например, в течение ночи).

Дополнительные подробности касательно кэпированной, стабилизированной рекомбинантной АДА приведены в заявке на патент США (настоящего заявителя) 11/738,012, озаглавленной "Стабилизированные белки", в особенности в разделе Примеры, которая включена в настоящую заявку путем ссылки.

Кроме того, применение терминов в форме единственного числа для удобства описания никоим образом не следует считать ограничивающим в какой-либо мере. Таким образом, например, ссылка на композицию, включающую фермент, относится к одной или более молекулам данного фермента. Нужно также понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными конфигурациями, стадиями способов и материалами, описанными в настоящей заявке, поскольку такие конфигурации, стадии способов и материалы могут несколько изменяться.

A. АДА-полимерные конъюгаты

Предпочтительной формой АДА является форма конъюгированного с полимером фермента. АДА-полимерный конъюгат настоящего изобретения в целом соответствуют формуле (I):

(I) [R-NH]_z-(АДА),

в которой

(ADA) представляет собой фермент аденозиндеаминазу или, необязательно, ее производное или фрагмент;

NH- представляет собой аминогруппу аминокислоты, присутствующей в АДА, ее производном или фрагменте, которая служит для присоединения к полимеру;

(z) является положительным целым числом, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 80, более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 80, наиболее предпочтительно от приблизительно 11 до приблизительно 18; и

R является по существу неантигенным полимерным остатком, который присоединен к АДА обратимым или необратимым способом.

Неантигенная полимерная часть (R) конъюгата может быть выбрана из неограничивающего списка систем на основе полимеров, таких как:

в которых:

R_10-11 и R_22-23 могут быть одинаковыми или различными и являются независимо выбранными неантигенными полимерными остатками;

R_3-9, R_12-21 и R₂₄ (см. ниже) являются одинаковыми или различными, при этом каждый из них независимо выбран из водорода, C_1-6-алкилов, разветвленных C_3-12-алкилов, C_3-8-циклоалкилов, замещенных C_1-6-алкилов, замещенных C_3-8 -циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 -гетероалкилов, C_1-6-алкокси, фенокси и C_1-6 -гетероалкокси;

Ar представляет собой группу, которая формирует многозамещенный ароматический углеводород или многозамещенную гетероциклическую группу;

Y _1-11 и Y₁₃ могут являться одинаковыми или различными и независимо выбраны из O, S и NR₂₄;

A выбран из алкильных групп, направляющих групп, диагностических средств и биологически активных групп;

X представляет собой O, NQ, S, SO или SO₂, где Q представляет собой Н, С_1-8-алкил, разветвленный C_1-8-алкил, замещенный C_1-8-алкил, арил или аралкил;

Z и Z' независимо выбраны из групп, активно транспортируемых в целевую клетку, гидрофобных групп, бифункциональных сшивающих групп и их комбинаций;

L_1-6 и L ₈ могут являться одинаковыми или различными и являются независимо выбранными бифункциональными линкерными группами;

(a), (c), (d), (f), (g), (i), (j), (j'), (k), (l), (n), (o), (p), (q) и (t) могут являться одинаковыми или различными и предпочтительно независимо являются 0 или положительным целым числом, в большинстве аспектов; (b), (e), (r), (r'), (s), (h), (h') и (m) могут являться одинаковыми или различными и независимо являются 0 или 1;

мПЭГ представляет собой метокси-ПЭГ, и

(u) представляет собой положительное целое число, обеспечивая полимеры, имеющие полную молекулярную массу от приблизительно 2000 до приблизительно 100000 Да, предпочтительно от приблизительно 4000 до приблизительно 45000 Да.

В рамках вышеуказанного предпочтительно, что Y_1-11 и Y₁₃ являются O; все R_3-8, R_12-21 и R₂₄ независимо являются либо водородом, либо C _1-6-алкилами, причем наиболее предпочтительными алкилами являются метил и этил, и R_7-9 предпочтительно является CH₃.

В другом аспекте изобретения полимерная часть конъюгата может являться такой частью, которая предоставляет множественные точки для присоединения АДА. Неограничивающий список подобных систем включает:

и

,

где все переменные определены выше.

В альтернативе, и/или предпочтительно, к АДА присоединены множественные цепи ПЭГ. В данных аспектах АДА-полимерный конъюгат может включать, по меньшей мере, от 5 цепей до 80 цепей полиэтиленгликоля, присоединенных к эпсилон-аминогруппам Lys в ферменте, а предпочтительно может включать приблизительно 11-18 цепей ПЭГ, присоединенных к эпсилон-аминогруппам Lys в ферменте.

Хотя АДА конъюгирована с приблизительно от 11 до приблизительно 18 молекул ПЭГ на молекулу фермента, через лизиновые связи, отношение ПЭГ и АДА может быть различным с целью изменения физических и кинетических свойств комбинированного конъюгата, чтобы соответствовать любой конкретной клинической ситуации.

Активированные полимеры, которые могут применяться с целью получения АДА-конъюгатов, обычно непосредственно соответствуют полимерным частям, описанным выше. Главное различие состоит в присутствии уходящей или активирующей группы, иногда обозначаемой в настоящем описании как B₁ , которая облегчает присоединение полимерной системы к аминогруппе (например, эпсилон-аминогруппе лизина), присутствующей в АДА. Таким образом, соединения (i)-(xiii) включают уходящую или активирующую группу, такую как:

или другую подходящую уходящую или активирующую группу, такую как N-гидроксибензотриазолил, галоген, N-гидроксифталимидил, имидазолил, O-ацилмочевины, пентафторфенол или 2,4,6-трихлорфенол или другие подходящие уходящие группы, очевидные средним специалистам в данной области, присутствующую в месте, где АДА присоединяется после реакции конъюгирования.

Некоторые предпочтительные активированные ПЭГ включают активированные ПЭГ, описанные в патентах США (настоящего заявителя) 5122614, 5324844, 5612460 и 5808096 (сукцинимидилкарбонат-активированный полиэтиленгликоль (СК-ПЭГ) и аналогичные активированные ПЭГ) и патенте США 5349001 (ПЭГ, активированные циклическим имидтионом), содержание которых включено в настоящую заявку путем отсылки. Как будет понятно средним специалистам в данной области, такие реакции конъюгирования обычно проводят в подходящем буфере, используя молярный избыток (в несколько раз) активированного ПЭГ. Некоторые предпочтительные конъюгаты, полученные с линейными ПЭГ, такими как вышеуказанный СК-ПЭГ, могут содержать, в среднем, от приблизительно 1 до приблизительно 80 цепей ПЭГ на молекулу фермента. Таким образом, в таком случае могут использоваться молярные избытки в несколько сотен раз, например 200-1000x. Молярный избыток, используемый для разветвленных полимеров и полимеров, присоединенных к ферменту, обычно ниже и может быть определен с использованием методик, описанных в патентах и заявках на патент, описывающих то же, которые указаны ниже в настоящей заявке.

В рамках настоящего изобретения активированные группы, как следует понимать, являются такими группами, которые способны к реакции с аминогруппой (нуклеофилом), присутствующей в АДА, например на Lys.

В рамках настоящего изобретения указанное выше также упоминают как активированные полимерные линкеры. Полимерные остатки предпочтительно являются полимерами на основе полиалкиленоксида, а более предпочтительно на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ), где ПЭГ является линейным, разветвленным или многолучевым.

Далее, обращаясь к полимерам, описанным выше, можно заметить, что Ar является группой, которая формирует многозамещенный ароматический углеводород или многозамещенную гетероциклическую группу. Главная особенность состоит в том, что группа Ar является ароматической по природе. Вообще, чтобы являться ароматическим соединением, -электроны должны быть распределены в "облаке" над и под плоскостью циклической молекулы. Кроме того, число -электронов должно удовлетворять правилу Хюккеля (4n+2). Средние специалисты в данной области осведомлены, что колоссальное количество групп удовлетворяет требованию ароматичности группы и, таким образом, подходит для применения в настоящем изобретении.

В некоторых предпочтительных аспектах изобретения активированные полимерные линкеры полимерных систем, основанные на отщеплении бензила или лактонизации триметильного замка, получают в соответствии с патентами США (настоящего заявителя) 6180095, 6720306, 5965119, 6624142 и 6303569, содержание которых включено в настоящую заявку путем отсылки. В рамках данного контекста предпочтительными являются следующие активированные полимерные линкеры:

В одном альтернативном аспекте изобретения АДА-полимерный конъюгат получают из определенных бицин-полимерных остатков, таких как описанные в патентах США 7122189 и 7087229, а также в заявках на патент США 10/557,522, 11/502,108 и 11/011,818 (все настоящего заявителя). Описание каждой такой заявки на патент включено в настоящую заявку путем отсылки. Некоторые из предпочтительных активированных полимеров включают:

Нужно также понимать, что уходящая или активирующая группа, показанная выше, является лишь одной из подходящих групп, и другие группы, упомянутые в настоящей заявке, также могут использоваться без лишней экспериментальной работы.

В альтернативных аспектах активированные полимерные линкеры получают, используя остатки разветвленных полимеров, такие как описанные в патентах США (настоящего заявителя) 5681567, 5756593, 5643575, 5919455, 6113906, 6153655, 6395266 и 6638499, 6251382, а также 6824766, описания которых включены в настоящую заявку путем отсылки. Такие активированные полимеры соответствуют полимерным системам (iv)-(ix), примером которых является следующее соединение:

,

в котором B₁ является активирующей группой, а все переменные определены выше.

В других альтернативных аспектах в активированных полимерах может применяться стерически затрудненный линкер на основе сложного эфира. См. PCT/US07/78593, озаглавленный "Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers", содержание которого включено в настоящую заявку путем отсылки. Например, неограничивающий список таких соединений включает:

где (u) является целым числом от приблизительно 10 до приблизительно 2300, предпочтительно обеспечивая полимеры, имеющие полную молекулярную массу от приблизительно 4000 до приблизительно 45000.

В одном предпочтительном варианте осуществления активированный полиэтиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль, который обеспечивает образованием уретановой связи или амидной связи с белком.

Способы получения полимеров, имеющих концевые карбоксильные группы, с высокой чистотой описаны в заявке на патент США 11/328,662, содержание которой включено в настоящую заявку путем отсылки. Способы включают сначала получение сложного третичного алкилэфира полиалкиленоксида с последующим превращением в соответствующее производное карбоновой кислоты. Первая стадия способа получения ПАО карбоновых кислот включает формирование промежуточного соединения, такого как т-бутиловый эфир полиалкиленоксид-карбоновой кислоты. Данное промежуточное соединение образуется в реакции ПАО с т-бутилгалогенацетатом в присутствии основания, такого как т-бутилат калия. После образования промежуточного т-бутилового эфира производное полиалкиленоксид-карбоновой кислоты может быть легко получено с чистотой, превышающей 92% предпочтительно превышающей 97%, более предпочтительно превышающей 99% и наиболее предпочтительно с чистотой, превышающей 99,5%.

В других альтернативных аспектах полимеры, имеющие концевые аминогруппы, могут использоваться для получения АДА конъюгатов. Способы получения полимеров, содержащих концевые амины, с высокой чистотой, описаны в заявках на патент США 11/508,507 и 11/537,172, содержание которых включено путем отсылки. Например, полимеры, имеющие азиды, взаимодействуют с восстановителем на основе фосфина, таким как трифенилфосфин, или с боргидридом щелочного металла, таким как NaBH₄ . В альтернативе полимеры, включающие уходящие группы, взаимодействуют с солями защищенных аминов, такими как калиевая соль метил-трет-бутилимидодикарбоната (KNMeBoc) или калиевая соль ди-трет-бутилимидодикарбоната (KNBoc ₂), с последующим снятием защиты с защищенной аминогруппы. Чистота полимеров, содержащих концевые амины, полученных с помощью указанных способов, превышает приблизительно 95% и предпочтительно превышает 99%.

1. По существу неантигенные полимеры

Как указано выше, R_10-11 и R_22-23 предпочтительно являются растворимыми в воде полимерными остатками, которые предпочтительно являются по существу неантигенными, такими как полиалкиленоксиды (ПАО), и наиболее предпочтительно полиэтиленгликолями, такими как мПЭГ. В целях неограничивающей иллюстрации часть полиэтиленгликолевого (ПЭГ) остатка R_10-11 и R_22-23 может быть выбрана из следующего:

J-O-(CH₂CH ₂O)_u-,

J-O-(CH₂CH ₂O)_u-CH₂C(O)-O-,

J-O-(CH₂CH₂O)_u-CH₂ CH₂ NR₂₅- и

J-O-(CH ₂CH₂O)_u-CH₂CH₂ SH-,

где:

(u) является степенью полимеризации, то есть равно от приблизительно 10 до приблизительно 2300;

R₂₅ выбран из водорода, C _1-6-алкилов, C_2-6-алкенилов, C_2-6 -алкинилов, разветвленных C_3-12-алкилов, C_3-8 -циклоалкилов, замещенных C_1-6-алкилов, замещенных C_2-6-алкенилов, замещенных C_2-6-алкинилов, замещенных C_3-8-циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6-гетероалкилов, замещенных C_1-6 -гетероалкилов, C_1-6-алкокси, фенокси и C_1-6 -гетероалкокси, и

J является кэпирующей группой, то есть группой, которая присутствует на конце полимера и в некоторых аспектах может быть выбрана из любого из NH₂ (или CH₂CH₂NH₂), H, SH (или CH ₂CH₂SH), CO₂H (или CH₂ CO₂H), C_1-6-алкилов, предпочтительно метила, или других ПЭГ-концевых активирующих групп, причем указанные группы известны средним специалистам в данной области.

В одном наиболее предпочтительном варианте осуществления R _10-11 и R_22-23 выбраны из:

CH ₃-O-(CH₂CH₂O)_u-, CH ₃-O-(CH₂CH₂O)_u-CH ₂C(O)-O-,

CH₃-O-(CH₂ CH₂O)_u-CH₂CH₂ NH- и CH₃-O-(CH₂CH₂O)_u -CH₂CH₂ SH-,

где (u) является положительным целым числом, предпочтительно выбранным так, чтобы средняя полная молекулярная масса полимерной части варьировала от приблизительно 2000 до приблизительно 100000 Да. Более предпочтительно R_10-11 и R_22-23 независимо имеют среднюю полную молекулярную массу приблизительно от 4000 Да до приблизительно 45000 Да, при этом наиболее предпочтительная средневесовая молекулярная масса составляет приблизительно от 5000 Да. Другие молекулярные массы также считают подходящими в соответствии с потребностями специалиста.

ПЭГ имеет общую формулу:

-О-(CH₂CH₂O)_u-,

а R_10-11 и R_22-23 предпочтительно включают остатки данной формулы. Степень полимеризации полимера представляет собой число повторяющихся звеньев в полимерной цепи и зависит от молекулярной массы полимера.

В альтернативе часть полиэтиленгликолевого (ПЭГ) остатка согласно изобретению может быть представлена структурой:

-Y₃₁ -(CH₂CH₂O)_u-CH₂CH ₂Y₃₁-,

-Y₃₁-(CH ₂CH₂O)_u-CH₂C(=Y₃₂ )-Y₃₁-,

-Y₃₁-(=Y₃₂ )-(CH₂)_а11-Y₃₃-(CH₂ CH₂O)_u-CH₂CH₂-Y ₃₃-(CH₂)_а11-C(=Y₃₂)-Y ₃₁-,

-Y₃₁-(CR₃₁R ₃₂)_a12-Y₃₃-(CH₂)_b11 -O-(CH₂CH₂O)_u-(CH₂ )_b11-Y₃₃-(CR₃₁R₃₂ )_a12-Y₃₁-,

-Y₃₁ -(CH₂CH₂O)_u-CH₂CH ₂-,

-Y₃₁-(CH₂CH ₂O)_u-CH₂C(=Y₃₂)-,

C(=Y₃₂)-(CH₂)_а11-Y₃₃ -(CH₂CH₂O)_u-CH₂CH ₂-Y₃₃-(CH₂)_а11-C(=Y ₃₂)- и

-(CR₃₁R₃₂) _a12-Y₃₃-(CH₂)_b11-O-(CH ₂CH₂O)_u-(CH₂)_b11 -Y₃₃-(CR₃₁R₃₂)_a12 -,

где:

Y₃₁ и Y ₃₃ независимо являются O, S, SO, SO₂, NR ₃₃ или связью;

Y₃₂ является O, S или NR₃₄;

R_31-34 независимо выбраны из водорода, C_1-6-алкила, C_2-6-алкенила, C_2-6-алкинила, разветвленного C_3-19-алкила, C_3-8-циклоалкила, замещенного C_1-6-алкила, замещенного C_2-6-алкенила, замещенного C_2-6 -алкинила, замещенного C_3-8-циклоалкила, арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила, C_1-6-гетероалкила, замещенного C_1-6-алкокси, арилокси, C_1-6 -гетероалкокси, гетероарилокси, C_2-6-алканоила, арилкарбонила, C_2-6-алкоксикарбонила, арилоксикарбонила, C_2-6 -алканоилокси, арилкарбонилокси, замещенного C_2-6-алканоила, замещенного арилкарбонила, замещенного C_2-6-алканоилокси, замещенного арилоксикарбонила, замещенного C_2-6-алканоилокси и замещенного арилкарбонилокси;

(a11), (a12) и (b11) являются независимо нулем или положительным целым числом, предпочтительно 0-6, а более предпочтительно 0, 1 или 2; и

(u) является целым числом от приблизительно 10 до приблизительно 2300.

Например, ПЭГ может быть функционализован следующим неограничивающим образом:

-C(=Y₃₄)-(CH₂)_m11-(CH₂ CH₂O)_u-,

-C(=Y₃₄ )-O-Y)-(CH₂)_m11-(CH₂CH₂ O)_u-,

-C(=Y₃₄)-NR₃₁ -(CH₂)_m11-(CH₂CH₂ O)_u-,

-CR₃₅R₃₆ -(CH₂)_m11-(CH₂CH₂ O)_u-,

где

R₃₁ , R₃₅ и R₃₆ независимо выбраны из H, C _1-6-алкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, гетероалкилов, замещенных гетероалкилов и замещенных C_1-6-алкилов;

(m11) является нолем или положительным целым числом, и предпочтительно равно 1 или 2;

Y₃₄ является O или S; и

(u) представляет собой степень полимеризации.

В данных аспектах кэпирующая группа (J), такая как метил, присоединена на конце ПЭГ.

Например, конъюгаты настоящего изобретения могут быть получены способами, которые включают превращение многолучевых ПЭГ-ОН и "звездообразных ПЭГ" продуктов, таких как описанные в каталоге NOF Corp. Drug Delivery System catalog. Ver. 8, апрель 2006, содержание которого включено в настоящую заявку путем отсылки, в подходящий активированный полимер, с использованием методик активации, которые описаны в вышеуказанных патентах США 5122614 или 5808096. См. также каталог корпорации Shearwater "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application", 2001, включенный в настоящую заявку путем отсылки.

Многолучевые полимеры содержат четыре или больше полимерных цепей, а предпочтительно четыре или восемь полимерных цепей. В целях неограничивающей иллюстрации остаток многолучевого полиэтиленгликоля (ПЭГ) может иметь формулу:

в которой:

(x) является 0 и положительным целым числом, то есть приблизительно от 0 до приблизительно 28; и

(n) является степенью полимеризации.

В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения многолучевой ПЭГ имеет следующую структуру:

в которой (n) является положительным целым числом. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения полимеры имеют полную молекулярную массу приблизительно от 2000 Да до приблизительно 100000 Да и предпочтительно от 4000 Да до 45000 Да.

В частности ПЭГ может иметь формулу:

в которой:

(u') является целым числом от приблизительно 10 до приблизительно 570, чтобы предпочтительно обеспечивать полимеры, имеющие полную молекулярную массу приблизительно от 4000 Да до приблизительно 45000 Да; и при этом до 3 концевых частей остатка кэпированы метилом или другим низшим алкилом.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления все 4 цепи ПЭГ превращены в подходящие функциональные группы, то есть СК и т.д., для того чтобы облегчить присоединение к рекомбинантному белку. Такие соединения до превращения включают:

Полимерные вещества, включенные в настоящее изобретение, предпочтительно растворимы в воде при комнатной температуре. Неограничивающий список таких полимеров включает гомополимеры полиалкиленоксидов, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоли, полиоксиэтилированные полиолы, их сополимеры и блок-сополимеры, при условии, что сохраняется водорастворимость блок-сополимеров.

В другом варианте осуществления, и в качестве альтернативы полимерам на основе ПАО, каждый R_10-11 и R_22-23 необязательно выбран из одного или нескольких фактически неаллергенных материалов, таких как декстран, поливиниловые спирты, полимеры на основе углеводов, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, например гидроксипропилметакриламид (HPMA), полиалкиленоксиды и/или сополимеры вышеуказанных полимеров. См. также патент США (настоящего заявителя) 6153655, содержание которого включено в настоящую заявку путем отсылки. Средние специалисты в данной области сумеют понять, что используется тот же тип активации, как описанный в настоящей заявке применительно к ПАО, такому как ПЭГ. Средние специалисты в данной области также поймут, что вышеприведенный список является лишь иллюстративным, и что рассматриваются все полимерные материалы, обладающие описанными в настоящей заявке качествами, и что другие производные полиалкиленоксидов, такие как полипропиленгликоли и т.д., также рассматриваются.

2. Бифункциональные линкерные группы

Во многих аспектах изобретения L_1-6 и L₈ являются линкерными группами, которые облегчают присоединение полимерной цепи, например R_10-11 и/или R_22-23. Образуемая связь может являться непосредственной либо включать дополнительные сшивающие группы, известные средним специалистам в данной области. В данном аспекте изобретения L_1-6 и L₈ могут являться одинаковыми или различными и могут быть выбраны из большого разнообразия групп, известных средним специалистам в данной области, таких как бифункциональные и гетеробифункциональные алифатические и ароматические-алифатические группы, аминокислоты и т.д. Таким образом, L_1-6 и L₈ могут являться одинаковыми или различными и включать такие группы, как:

Предпочтительно L_1-6 и L₈ выбраны из:

В альтернативе подходящие аминокислотные остатки могут быть выбраны из любых известных природных L-аминокислот, например аланина, валина, лейцина и т.д., и/или их комбинации, а также многих других. L_1-6 и L₈ могут также включать пептид, размер которого варьирует, например, от приблизительно 2 до приблизительно 10 аминокислотных остатков.

Производные и аналоги природных аминокислот, а также различных известных из уровня техники неприродных аминокислот (D или L), гидрофобных или негидрофобных, также включены в объем изобретения.

3. Z-группы и их функция

В одном аспекте изобретения Z и Z' представляют собой L₇-C(=Y₁₂), где L₇ является бифункциональным линкером, выбранным из группы, которая определяет L_1-6, а Y₁₂ выбран из тех же групп, которые определяют Y₁. В данном аспекте изобретения группа Z служит в качестве связи между АДА и остальной частью полимерной системы доставки. В других аспектах изобретения Z является группой, которая активно транспортируется в целевую клетку, гидрофобной группой, а также комбинациями перечисленного. В случае присутствия Z' может служить бифункциональным линкером, группой, которая активно транспортируется в целевую клетку, гидрофобной группой, включая комбинации перечисленного.

В данном аспекте изобретения получены обратимо-связанные полимерные системы, которые подвергаются гидролизу in vivo с отщеплением полимера от АДА, что приводит к высвобождению фермента, все еще связанного с Z группой, в межклеточную жидкость. Например, некоторые возможные Z-B комбинации включают лейцин-АДА и Gly-Phe-Leu-Gly-АДА.

B. Получение АДА-конъюгатов

В целях иллюстрации в настоящей заявке описаны подходящие реакции конъюгирования, включающие взаимодействие АДА с активированной требуемым образом полимерной системой. Реакцию предпочтительно проводят с использованием известных средним специалистам условий модификации белков, включая использование PBS буферной системы и т.д., с pH в диапазоне приблизительно 6,5-8,5. Предполагается, что в большинстве случаев с АДА реагирует избыток активированного полимера.

Реакции данного типа часто приводят к образованию конъюгатов, в которых к АДА присоединен один или более полимеров. Следует понимать, что часто необходимо выделить различные фракции и получить более гомогенный продукт. В большинстве аспектов изобретения реакционную смесь собирают, наносят на колонку, загруженную подходящей смолой, и последовательно элюируют целевые фракции при повышении уровней буфера. Фракции анализируют подходящими аналитическими методами, чтобы определить чистоту конъюгированного белка перед последующей обработкой. Независимо от пути синтеза и выбранного активированного полимера, конъюгаты соответствуют Формуле (I), определенной в настоящей заявке. Некоторые из предпочтительных конъюгатов, полученных с помощью методов синтеза, описанных в настоящей заявке, включают:

где B представляет собой АДА.

Еще одни конъюгаты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, включают:

где все переменные определены выше, а B представляет собой АДА.

Другие конъюгаты включают:

где B представляет собой АДА.

Особо предпочтительным конъюгатом является:

где молекулярная масса мПЭГ составляет от приблизительно 4000 до приблизительно 45000.

Когда используются полимерные системы на основе бицина, два предпочтительных конъюгата представляют собой:

где молекулярные массы мПЭГ являются такими же, как указано выше. Более предпочтительные конъюгаты включают:

Следует отметить, что ПЭГилирование АДА эмпирически оптимизировано относительно общего присоединения ПЭГ в расчете на молекулу белка, размера полимера ПЭГ, а также структуры линкера ПЭГ. Ключевые характеристики ПЭГилированной АДА для оценки оптимизации ПЭГилирования включают как in vitro анализы (например, анализы активности и стабильности фермента), так и in vivo анализы (например, фармакокинетику и фармакодинамику).

C. Опухоли, подвергаемые лечению

Способы изобретения могут применяться для лечения всех типов опухолей, включая раковые опухоли, которые чувствительны к снижению уровней аденозина или дезоксиаденозина в крови и/или ткани человека или животного, подвергаемых лечению. В более широком смысле они включают опухоли, происходящие из кроветворных клеток, а также солидные опухоли. Из солидных опухолей включены те опухоли, которые угнетаются, когда снижение уровней аденозина позволяет иммунной системе пациента более эффективно подавлять опухоль, и/или опухоли, которые угнетаются, когда снижение уровней аденозина ингибирует кровоснабжение, например, в уже гипоксических опухолях.

Более предпочтительно опухолями, чувствительными к лечению с применением способов изобретения, являются солидные опухоли, которые успешно подавляются в результате дополнительного эффекта снижения ангиогенной стимуляции, сопутствующего снижению уровней аденозина в тканях.

Опухоли, подвергаемые лечению, включают, лишь в качестве примера, те опухоли, которые изначально образуются в иммунной системе, скелетной системе, мышцах и сердце, молочной железе, желудочно-кишечном тракте, центральной и периферической нервной системе, почечной системе, репродуктивной системе, дыхательной системе, коже, системах соединительных тканей, включая суставы, жировые ткани, сердечно-сосудистую систему, включая стенки кровеносных сосудов и т.п.

Опухоли скелетной системы включают, например, саркомы и бластомы, такие как остеосаркому, хондросаркому, хондробластому и т.д. Мышечные и сердечные опухоли включают опухоли скелетных и гладких мышц, например лейомиомы (доброкачественные опухоли гладких мышц), лейомиосаркомы, рабдомиомы (доброкачественные опухоли скелетного мускула), рабдомиосаркомы, саркому сердца и т.д. Опухоли желудочно-кишечного тракта включают, например, опухоли рта, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки и колоректальные опухоли, а также опухоли секреторных органов желудочно-кишечного тракта, таких как слюнные железы, печень, поджелудочная железа, желчные протоки и т.п.

Опухоли центральной нервной системы включают опухоли мозга, сетчатки и спинного мозга и могут также образовываться в связанной соединительной ткани, костной ткани, ткани кровеносных сосудов или нервной ткани. Опухоли периферической нервной системы также могут подвергаться лечению. Кроме того, опухоли периферической нервной системы включают злокачественные опухоли оболочки периферических нервов.

Опухоли почечной системы включают опухоли почек, например почечно-клеточную карциному, а также опухоли мочеточника и мочевого пузыря. Опухоли репродуктивной системы включают опухоли шейки матки, матки, яичника, предстательной железы, мужских половых желез и сопутствующих секреторных желез. Опухоли иммунной системы включают как опухоли на основе кроветворных клеток, так и солидные опухоли, включая лимфомы, например ходжкинские и неходжкинские.

Опухоли дыхательной системы включают опухоли носовых ходов, бронхов и легких. Опухоли молочной железы включают, например, и лобулярную, и протоковую карциному.

В частности, общие типы злокачественных опухолей, подвергаемых лечению, включают, лишь в качестве примера: рак предстательной железы, рак легкого, рак молочной железы, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак эндометрия, рак яичников, кожную меланому, лимфомы, неходжкинскую лимфому, рак поджелудочной железы, нейробластому, опухоль Вильмса, рабдомиосаркому (возникающую в мышцах), ретинобластому, остеосаркому и саркому Юинга, а также многие другие.

D. Выбор дозы

Специалист сумеет оценить, что в клинической ситуации дозировка Adagen^® индивидуализирована в зависимости от клинического ответа опухоли и профиля побочного действия у отдельного пациента - животного или человека. В примерах, приведенных ниже, наиболее высокая доза является максимально допустимой дозой, которую можно перенести. Adagen^® поставляется коммерчески в дозировке 250 Е/мл. Это соответствует 2000 Е/кг для мыши весом приблизительно 25 г после введения 0,2 мл Adagen^®. Минимальная доза, применяемая в примерах, приведенных ниже, приблизительно соответствует клинической дозе для человека. Рекомендуемая схема дозирования при лечении пациентов, страдающих ТКИД, составляет 10 Е/кг для первой дозы, 15 Е/кг для второй дозы и 20 Е/кг для третьей дозы. Допускаются последующие повышения дозы в размере 5 Е/кг/неделя, до максимальной разовой дозы 30 Е/кг. Доза в приведенном ниже примерном протоколе (100 Е/кг) является мышиной дозой, эквивалентной клинической детской дозе приблизительно 12 Е/кг.

Доза, основанная на количестве фермента, варьирует, например, от приблизительно 0,10 Е/кг до приблизительно 30 Е/кг включительно, или выше, предпочтительно от приблизительно 0,5 Е/кг до приблизительно 20 Е/кг, и более предпочтительно от приблизительно 0,5 Е/кг до приблизительно 12 Е/кг (то есть на кг веса пациента), как, например, от приблизительно 0,5 Е/кг до приблизительно 5 Е/кг. Общая еженедельная доза может составлять до 40 Е/кг или более, если переносится реципиентом. Допускаются последующие повышения дозы в размере 5 Е/кг/неделя, до максимальной разовой дозы 30 Е/кг или более, если указанная доза переносится реципиентом. Обычно после еженедельных инъекций ADAGEN^® при дозировке 15 Е/кг средний минимальный уровень активности АДА в плазме составляет от 20 до 25 мкмоль/ч/мл.

Конечно, специалист сумеет оценить, что доза АДА-полимерного конъюгата может быть также скорректирована в зависимости от размера конкретного полимера, химического линкера и валентности. Например, режим дозирования для полимерного конъюгата, включающего два или более ферментов АДА на полимер, регулируется согласно единицам АДА в мл раствора любого конкретного полимерного конъюгата АДА.

При обеспечении АДА или конъюгата АДА с ПЭГ посредством инъекции оптимальный диапазон доз предпочтительно устанавливают при контроле плазмы. В целом желательно предоставить реципиенту такую дозировку, которая поддерживает активность АДА в плазме (минимальные уровни) в диапазоне от приблизительно 10 до 100 мкмоль/ч/мл, предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 35 мкмоль/ч/мл (в анализе при 37°C), и демонстрирует снижение эритроцитарного аденозина, то есть дАТФ, до приблизительно 0,001-0,057 мкмоль/мл, предпочтительно приблизительно до 0,005 - приблизительно 0,015 мкмоль/мл в упакованных эритроцитах, или приблизительно 1% общего эритроцитарного аденозина (то есть содержание АТФ+дАТФ), относительно нормального уровня аденозина, при измерении в образце, взятом до инъекции. Нормальное значение дАТФ составляет менее чем приблизительно 0,001 мкмоль/мл.

Подробная информация относительно дозировки АДА приведена на вкладыше с инструкцией по медицинскому применению препарата ADAGEN^® (Enzon, Inc.), содержание которого включено в настоящую заявку.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры служат для обеспечения более полного понимания изобретения, но никоим образом не ограничивают фактический объем изобретения.

ПРИМЕР 1

Противоопухолевая эффективность Adagen^® в ксенографтной модели опухоли предстательной железы человека DU145.

А) Тест-система

Вид:	Мышь домовая, Mus musculus
Линия:	бестимусная, бесшерстная
Поставщик:	Harlan-Sprague Dawley
Пол:	самка
Средний начальный вес:	27,2 г
Номер в тесте:	40
Период адаптации:	7 дней после прибытия
Идентификация:	номер клетки и штамп на ухе

B) Методы

Схема эксперимента:

Клетки рака предстательной железы человека DU 145 были получены из Американской коллекции тканевых культур (ATTC), Manassas, VA. Опухоли приживляли «голым» мышам с помощью подкожной инъекции 2,0×10⁶ клеток DU 145/мышь в правую подмышечную область. Рост опухоли проверяли два раза в неделю и проводили измерения сразу после того, как опухоль стала прощупываться. Когда опухоли достигали среднего объема 78 мм³, мышей делили на экспериментальные группы (по 8 в группе). Мышам вводили Adagen^® по 2000, 500 или по 100 МЕ/кг два раза в неделю в течение 5 недель. В качестве положительного контроля мышам вводили Авастин^® (бевацизумаб, анти-VEGF моноклональное антитело) в дозе 5 мг/кг с такой же частотой, как Adagen^®. Экспериментальные группы обрабатывали согласно схеме, приведенной ниже в Таблице 1. Первый день дозирования обозначали как день 1. Объем опухоли у каждой мыши определяли путем измерения по двум габаритам с помощью штангенциркуля и последующего вычисления с использованием формулы: объем опухоли = (длина × ширина²)/2. Вес мыши и размер опухоли определяли в начале исследования и два раза в неделю на протяжении 8-недельного периода.

Таблица 1
№ группы	Группа	Кол-во животных (n)	Доза (МЕ/кг)	Путь введения	Схема дозирования
1	Контроль	8	физраствор	в/б	два раза в неделю × 5
2	Adagen®	8	2000	в/б	два раза в неделю × 5
3	Adagen®	8	500	в/б	два раза в неделю × 5
4	Adagen®	8	100	в/б	два раза в неделю × 5
5	Авастин ®	8	5 мг/кг	в/б	два раза в неделю × 5

Выбор дозы:

Adagen^® или Авастин ^® вводили внутрибрюшинно (в/б) дважды в неделю в течение пяти недель (всего 10 доз).

Adagen^® : Номер партии: NV0604, концентрация: 229 МЕ/мл.

Авастин^®: Номер партии: M66781, концентрация: 25 мг/мл.

Вычисления дозы проводили на основе массы тела в день 1.

Клинические испытания:

Мышей обследовали визуально после прибытия. Затем мышей обследовали индивидуально, два раза в неделю после начала прощупывания опухоли, на предмет клинических симптомов, общих изменений поведения, а также контролировали массу тела. Регистрировали все случаи смерти и клинические симптомы. Потребление пищи и воды не отслеживали. Мышей с опухолями, которые показывали открытые некротические повреждения, умерщвляли. Мышей, теряющих более 20% массы тела, также гуманно умерщвляли.

Статистический анализ:

Различия в % изменения объема опухоли между различными обработками сравнивали, используя однофакторный дисперсионный анализ. Все парные многократные сравнения выполняли, используя метод Холма-Сидака.

C) Результаты

Определения использованных терминов:

(a) % от начального объема опухоли: (объем опухоли в какой-либо день/объем опухоли в день 1)×100.

(b) % изменение объема опухоли: [(объем опухоли в какой-либо день - объем опухоли в день 1)/объем опухоли в день 1]×100.

(c) % ингибирование роста опухоли (TGI): [(средний объем опухоли в контрольной группе - средний объем опухоли в обработанной группе)/средний объем опухоли в контрольной группе]×100.

(d) Регрессию опухоли определяют как уменьшение объема опухоли по сравнению с днем 1.

(e) Выздоровление определяют как полное отсутствие опухоли при наблюдении невооруженным глазом.

Средний размер опухоли в начале исследования составлял 78 мм³. Средняя масса тела в начале исследования составляла 27,20 г. Мыши во всех группах набрали вес, а к концу исследования вес мышей в различных группах увеличился на 20-25% от веса до обработки. Исследование завершали в день 57, когда большинство животных имело либо изъязвленные опухоли, либо имело объем опухоли более 1500 мм³. В Таблицах 2 и 3 ниже приведены окончательные результаты, зарегистрированные на 49-й день исследования (в последний день, в который еще сохранялось 100%-ное выживание контрольных животных), а также приведено сравнение выживаемости между группами животных, получавших Adagen^® , и группами животных, получавших Авастин^®. Опухоли в контрольной группе в течение исследования росли стабильно. В 49-й день средний объем опухоли составлял 783,1 (±556,2) мм³. Процентное изменение роста опухоли составляло 833,3% (±622,7). Обработка с применением Adagen^® при всех трех уровнях дозы обеспечивала эффективное ингибирование роста опухоли. Нужно отметить, что во всех обрабатываемых группах опухоли росли с медленной скоростью до последнего дня дозирования (день 33), после которого опухоли росли с более высокой скоростью (данные не показаны). С данным наблюдением согласуется тот факт, что % изменение объема опухоли при всех трех уровнях дозы Adagen ^® существенно отличалось от изменения в контрольной группе до 36 дня (P<0,05) (данные не показаны).

Это позволяет предположить, что Adagen^® проявляет цитостатический эффект в отношении роста опухоли. Хотя % изменение объема опухоли статистически не отличалось от соответствующего показателя в контрольной группе после 36-го дня и до конца исследования, обработка с применением Adagen^® приводила к детектируемому ингибированию роста опухоли. В частности, опухоли, обработанные 2000 МЕ/кг Adagen^®, имели средний объем 343,0 (±249,8) мм³ в 49-й день. Среднее изменение объема опухоли составляло 424,2% (±360,6). Adagen^® в дозировке 2000 МЕ/кг показал 56%-ное ингибирование роста опухоли.

Опухоли, обработанные 500 МЕ/кг Adagen^® , имели средний объем 696,3 (±290,4) мм³ в 49-й день. Среднее изменение объема опухоли составляло 797,6% (±492,7), а изменение от начального объема опухоли составляло 897,6% (±492,7). Ингибирование роста опухоли составляло 11,1%. Опухоли в данной группе показывали подобные скорости роста, как и в других группах, получавших Adagen^®, до 40 дня, после которого они росли с намного более высокой скоростью. Причина данного несоответствия неизвестна.

Опухоли относились с 100 МЕ/кг Adagen^®, имели средний объем 414,8 (±219,0) мм³ в 49-й день. Среднее изменение объема опухоли составляло 489,9% (±307,0), а среднее процентное изменение от начального объема опухоли составляло 589,9% (±307,0). Ингибирование роста опухоли или TGI составляло 47,0%.

Терапевтический эффект Adagen^® достигал максимального уровня при минимальной дозе 100 МЕ/кг. Нужно отметить, что доза 100 МЕ/кг приближается к клинической дозе Adagen^® для человека (доза, применяемая для лечения детей с ТКИД). Авастин ^® показал наиболее эффективное уменьшение размера опухоли с ингибированием роста опухоли или TGI, составившим 92,5%.

В заключение необходимо отметить, что обработка с применением Adagen^® при всех трех уровнях дозы обеспечивала эффективное ингибирование роста опухолей DU 145 in vivo.

Таблица 2
Заключительные результаты (День 49)
№ группы	Соединение	Средний конечный объем опухоли	Срединное значение конечного объема опухоли	% изменение объема опухоли	% начального объема опухоли	% от начального объема опухоли	Случаи ослабления симптомов	Случаи выздоров- ления	% выживших
1	физраствор	783,1 (556,2)	680,0	833,3 (622,7)	933,3 (622,7)	-	0	0	62,5
2	Adagen (2000 МЕ/кг)	343,0 (249,8)	283,8	424,2 (360,6)	524,2 (360,6)	56,2	0	0	75,0
3	Adagen (500 МЕ/кг)	696,3 (290,4)	766,2	797,6 (492,7)	897,6 (492,7)	11,1	0	0	75,0
4	Adagen (100 МЕ/кг)	414,8 (219,0)	349,8	489,9 (307,0)	589,9 (307,0)	47,0	0	0	75,0
5	Авастин (5 мг/кг)	58,5 (36,1)	49,3	-15,7 (59,6)	84,3 (59,6)	92,5	7/8	0	87,5
Приведено число случаев ослабления симптомов, случаев выздоровления и % выживших на день 56. Приведены средние объемы опухоли, срединные значения, % изменение объема опухоли, % от начального объема опухоли и % ингибирования роста опухоли на день 49.

Таблица 3
Сравнение выживаемости в группах (количество выживших животных)
Группа	1	5	8	12	15	19	22	26	29	33	36	40	43	49	51	55	57
1:физраствор	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	5a	5	5	5
2:Adagen (2000 Е/кг)	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	7b	7	6c	6	6	6
3:Adagen (500 Е/кг)	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	7b	7	6c	6	5d	5
4:Adagen (100 Е/кг)	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	6e	6	6	6	5d	5
5:Авастин (5 мг/кг)	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	8	7c	7	7	7
a Двух животных умертвили, так как размер опухоли превышал 1500 мм3. Одно животное умертвили из-за изъязвления опухоли. b Животное умертвили из-за изъязвления опухоли на 49 день. c Животное умертвили из-за изъязвления опухоли на 49 день. d Животное умертвили из-за изъязвления опухоли на 55 день. e Двух животных умертвили из-за изъязвления опухолей на 49 день.

ПРИМЕР 2

Противоопухолевая эффективность Adagen ^® в ксенографтной модели опухоли яичников человека sk-ov-3

А) Тест-система

Вид:	Мышь домовая, Mus musculus
Линия:	бестимусная, бесшерстная
Поставщик:	Harlan-Sprague Dawley
Пол:	самка
Средний начальный вес:	22,18 г
Номер в тесте:	54
Период адаптации:	7 дней после прибытия

B) Методы

Схема эксперимента:

Клетки SK-OV-3 аденокарциномы яичников человека приживляли «голым» мышам с помощью подкожной инъекции 3×10⁶ клеток/мышь в правую подмышечную область. Рост опухоли проверяли два раза в неделю и проводили измерения сразу после того, как опухоль стала прощупываться. Объем опухоли у каждой мыши определяли путем измерения по двум габаритам с помощью штангенциркуля и последующего вычисления с использованием формулы: объем опухоли = (длина × ширина²)/2. Когда опухоли достигали среднего объема 90 мм³, мышей делили на экспериментальные группы (по 9 в группе). Экспериментальные группы обрабатывали согласно схеме, приведенной в Таблице ниже. Первый день дозирования обозначали как день 1. Вес мыши и размер опухоли определяли в начале исследования и два раза в неделю до завершения исследования. Исследование завершали приблизительно через 7 недель (52 дня), когда у большинства животных развивались большие или изъязвленные опухолевые массы.

Таблица 4
№ группы	Группа	Кол-во животных (n)	Доза (Е/кг)	Путь введения	Схема дозирования
1	контроль	9	физраствор	в/б	два раза в неделю × 5
2	Adagen®	9	2000	в/б	два раза в неделю × 5
3	Adagen®	9	500	в/б	два раза в неделю × 5
4	Adagen®	9	100	в/б	два раза в неделю × 5
5	Авастин®	9	100 мкг/мышь	в/б	два раза в неделю × 5
6	Нативная АДА	9	2000	в/б	два раза в неделю × 5

Схема дозирования:

Adagen^® или Авастин^® вводили внутривенно (в/в) дважды в неделю в течение пяти недель (всего 10 доз)

Испытываемые продукты:

Adagen^® : Номер партии: NV0604, концентрация: 229 МЕ/мл

Авастин^®: Номер партии: M66781, концентрация: 25 мг/мл

Нативная АДА: Номер партии: 06-0315-111

Расчет дозы:

На основе массы тела в день 1.

Клинические испытания:

Мышей обследовали визуально после прибытия. Затем мышей обследовали индивидуально, два раза в неделю после начала прощупывания опухоли, на предмет клинических симптомов, общих изменений поведения, а также контролировали массу тела. Регистрировали все случаи смерти и клинические симптомы. Потребление пищи и воды не отслеживали. Мышей с опухолями, которые показывали открытые некротические повреждения, умерщвляли. Мышей, теряющих более 20% массы тела, также гуманно умерщвляли.

Статистический анализ:

Различия в % изменения объема опухоли между различными обработками сравнивали, используя однофакторный дисперсионный анализ. Все парные многократные сравнения выполняли, используя метод Тьюки-Крамера.

C) Результаты

Определения использованных терминов:

(a) % от начального объема опухоли: (объем опухоли в какой-либо день/объем опухоли в день 1)×100.

(b) % изменение объема опухоли: [(объем опухоли в какой-либо день - объем опухоли в день 1)/объем опухоли в день 1]×100.

(c) % ингибирование роста опухоли (TGI): [(средний объем опухоли в контрольной группе - средний объем опухоли в обработанной группе)/средний объем опухоли в контрольной группе]×100.

(d) Регрессию опухоли определяют как уменьшение объема опухоли по сравнению с днем 1.

(e) Выздоровление определяют как полное отсутствие опухоли при наблюдении невооруженным глазом.

Средний размер опухоли в начале исследования составлял 90 мм³. Средняя масса тела в начале исследования составляла 22,2 г. Средний вес мышей во всех группах в ходе исследования значительно не увеличился. Исследование завершали в день 52. Четыре животных умертвили, поскольку объем опухоли у них составлял более 1500 мм³.

В Таблице 5 ниже приведены заключительные результаты на день 32 (в последний день 66%-ного выживания животных в контрольной группе). Опухоли в контрольной группе в течение исследования росли стабильно. В 32-й день средний объем опухоли составлял 754,9 (±700,7) мм³. Процентное изменение роста опухоли составляло 693,2% (±673,6) мм ³.

Таблица 5
Заключительные результаты (День 32)
№ группы	Соединение	Средний конечный объем опухоли	Срединное значение конечного объема опухоли	% изменение объема опухоли	% начального объема опухоли	% от начального объема опухоли	Случаи ослабления симптомов	Случаи выздоров- ления	% выживших
1	физраствор	754,9 (700,7)	485,5	693,2 (673,6)	793,2 (673,6)	-	0	0	66
2	Adagen (2000 МЕ/кг)	437,7 (122,2)	446,4	402,1 (177,7)	502,1 (177,7)	42,0	0	0	100
3	Adagen (500 МЕ/кг)	471,1 (60,0)	465,8	421,3 (102,2)	521,3 (102,2)	37,6	0	0	89
4	Adagen (100 МЕ/кг)	497,7 (152,6)	478,9	450,7 (172,7)	550,7 (172,7)	34,1	0	0	100
5	Авастин (5 мг/кг)	210,2 (65,9)	198,6	161,6 (88,3)	261,6 (88,3)	72,2	0	0	100
6	Нативная АДА (2000 МЕ/кг)	356,6 (213,0)	329,7	340,1 (239,1)	440,1 (239,1)	52,8	0	0	77

Опухоли, обработанные 2000 МЕ/кг Adagen^®, имели средний объем 437,7 (±122,2) мм³ в 32-й день. Среднее изменение объема опухоли составляло 402,1% (±177,7). Adagen^® в дозировке 2000 МЕ/кг показал 42%-ное ингибирование роста опухоли.

Опухоли, обработанные 500 МЕ/кг Adagen^®, имели средний объем 471,1 (±60,0) мм³ в 32-й день. Среднее изменение объема опухоли составляло 421,3% (±102,2), а изменение от начального объема опухоли составляло 521,3% (±102,2). Ингибирование роста опухоли составляло 37,6%.

Опухоли, обработанные 100 МЕ/кг Adagen^®, имели средний объем 497,7 (±152,6) мм³ в 32-й день. Среднее изменение объема опухоли составляло 450,7% (±172,7), а среднее процентное изменение от начального объема опухоли составляло 550,7% (±172,7). Ингибирование роста опухоли составляло 34,1%.

Опухоли, обработанные 2000 МЕ/кг нативной АДА, имели средний объем 356,6 (213,0) мм³ в 32-й день исследования. Среднее изменение в объеме опухоли составляло 340,1% (±210,0), а среднее процентное изменение от начального объема опухоли составляло 440,1% (239,1). Ингибирование роста опухоли составляло 52,8%.

Обработка с применением Adagen^® при любом уровне дозы была сопоставима с результатами в контрольных группах. Однако Adagen^® при каждом уровне дозы вызывал TGI, как указано выше.

Терапевтический эффект Adagen^® достигал максимального уровня при минимальной дозе 100 МЕ/кг. Нужно отметить, что доза 100 МЕ/кг приближается к клинической дозе Adagen^® для человека (доза, применяемая для лечения детей с ТКИД). Авастин ^®, служивший в качестве положительного контроля в данном исследовании, показал наиболее эффективное уменьшение размера опухоли со значением TGI 72%.

В заключение необходимо отметить, что обработка с применением Adagen^® в дозировке 100, 500 или 2000 МЕ/кг приводила к ингибированию роста опухоли в пределах от 34-42%.

Альтернативные рекомбинантные ферменты АДА для способов изобретения описаны далее.

ПРИМЕР 3

Конструирование экспрессионного штамма E. Coli, экспрессирующего рекомбинантную АДА человека с заменой Cys/Ser в положении 74 зрелого белка

Опубликованную аминокислотную последовательность длиной 363 а.к. аденозиндеаминазы человека (GenBank NP_000013, включенная в настоящую заявку путем отсылки) проанализировали на присутствие кодонов цистеина. Пять положений в зрелом (с отщепленным N-концевым Met) полипептиде кодируют цистеин (C74, C 12, C153, C168, C261). В сконструированном и модифицированном гене, экспрессирующем АДА человека, лишь один из указанных пяти кодонов цистеина (Цистеин 74, TGC) заменили кодоном серина (TCC) (это 75 положение в транслированном белке). Определенную полипептидную последовательность (см. SEQ ID NO: 3) предоставили корпорации Blue Heron (Bothell, Вашингтон, США) для синтеза нового полноразмерного гена, включающего кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, с использованием стандартного химического синтеза с перекрывающимися олигонуклеотидными фрагментами. Вкратце, последовательность оптимизировали для бактериальной экспрессии в соответствии со стандартными бактериальными кодонами, используемыми для Escherichia coli K12, используя данные по кодонам, описанные Grantham R. et al.; 1981, "Codon catalogue usage in genome strategy modulated for gene expressivity," Nucleic Acid Res. 9:r43-r47, и Lathe, R. 1985, "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data, Theoretical and practical considerations," J. Mol. Biol.; 183:1-12.

Затем соответствующую последовательность РНК анализировали на предмет формирования шпилечной структуры или петель и подвергали вычислениям минимальной свободной энергии. Фланкирующие сайты рестрикции NdeI и BamHI вводили в концевые участки гена. После расщепления синтетической ДНК ферментами рестрикции NdeI и BamHI 1,1 т.п.н. ген лигировали с помощью T4 ДНК лигазы в плазмидный вектор pET-28a (Novagen), который был также расщеплен указанными двумя ферментами. Рекомбинантную плазмиду вводили в штамм E. coli BLR (DE3) или HMS 174 (DE3) с помощью электропорации, используя BTX Electro Cell Manipulator 600, согласно инструкциям изготовителя. Трансформированную культуру высевали на чашки с LB агаром, содержащие канамицин (15 мкг/мл) с целью отбора колоний, содержащих плазмиду pET-28a/ADAcysSer (обозначенных ADAc75s/pET28a:BLR (DE3) или ADAc75s/pET28a:HMS174 (DE3)). Нуклеотидную последовательность варианта гена АДА подтверждали посредством анализа последовательности ДНК с помощью ABI Prism 310 Genetic Analyzer, используя Big Dye Terminators. Последовательность ДНК, кодирующая открытую рамку считывания Ser₇₄-рчАДА, соответствовала SEQ ID NO: 4.

Затем выделенные колонии очищали, пересевая на чашки, и анализировали на предмет экспрессии, индуцируемой изопропил- -D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG), в среде LB стандартными методами, такими как описанные в девятом выпуске Novagen pET System Manual, включенном путем ссылки в настоящую заявку.

Исследовали несколько параметров индукции, включая время, температуру и концентрацию индуктора. Предпочтительные условия индукции, включающие индукцию 50 мкМ IPTG в течение 12 часов при 25°C, обеспечивали продукцию АДА с высоким уровнем в цитоплазме бактерий-хозяев в количестве приблизительно 20% от суммарного белка клетки. Экспрессированный белок АДА, проанализированный с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, обладал требуемой молекулярной массой приблизительно 40 кДа (данные не показаны).

ПРИМЕР 4

Конструирование экспрессионного штамма E. Coli, экспрессирующего рекомбинантную бычью АДА с заменой Cys/Ser в положении 74 зрелого белка

Очищенный зрелый белок АДА, полученный из препаратов кишечного тракта крупного рогатого скота, является белком длиной 356 аминокислот, без N-концевого метионина, а также без шести C-концевых остатков, предсказанных из последовательности кДНК (GenBank NP_776312, включенной путем отсылки в настоящую заявку). Аминокислотная последовательность бычьей АДА анализировали на предмет присутствия кодонов цистеина. Пять положений в зрелом полипептиде кодируют цистеин (C74, C152, C153, C168, C261). В сконструированном и модифицированном синтетическом гене бычьей АДА только одно из указанных пяти положений цистеина (цистеин 74) заменили остатком серина. Это выполняли, вводя кодон серина (TCC) вместо нормального кодона цистеина в положение 74 зрелого полипептида (или положение 75 продукта трансляции). Ген также оптимизировали по кодонам для экспрессии в E. coli .

Вкратце, определенную полипептидную последовательность (см. SEQ ID NO: 1) предоставили компании BioCatalytics для синтеза нового полноразмерного гена, включающего кодоны, оптимизированные для экспрессии в E. coli, с использованием собственных способов BioCatalytics, которые включают химический синтез с перекрывающимися олигонуклеотидными фрагментами. Способы BioCatalytics более подробно описаны в патенте США 6366860, содержание которого полностью включено путем отсылки в настоящую заявку.

Экспрессию бычьей АДА анализировали в нескольких системах экспрессии. Например, в концевые участки гена вводили фланкирующие сайты рестрикции NdeI и BamHI. После расщепления синтетической ДНК ферментами рестрикции NdeI и BamHI ген 1,1 т.п.н. лигировали с помощью T4 ДНК лигазы в плазмидный вектор pET-9d (Novagen), который был также расщеплен указанными двумя ферментами. Рекомбинантную плазмиду вводили в штамм E. coli BLR (DE3) или HMS 174 (DE3) с помощью электропорации, используя BTX Electro Cell Manipulator 600, согласно инструкциям изготовителя. Трансформированную культуру высевали на чашки с LB агаром, содержащие канамицин (15 мкг/мл) с целью отбора колоний, содержащих плазмиду pET-9d/bADA (обозначенных bADA/pET9d:BLR(DE3) or bADA/pET9d:HMS 174(DE3)). Нуклеотидную последовательность варианта гена АДА подтверждали посредством анализа последовательности ДНК с помощью ABI Prism 310 Genetic Analyzer, используя Big Dye Terminators. Последовательность ДНК, содержащая открытую рамку считывания Ser₇₄-рчАДА, приведена в SEQ ID NO: 2.

Затем выделенные колонии очищали, пересевая на чашки, и анализировали на предмет IPTG-индуцируемой экспрессии гена в среде LB стандартными методами, такими как описанные в девятом выпуске Novagen pET System Manual. Анализировали несколько параметров индукции, включая время, температуру и концентрацию индуктора. Предпочтительные условия индукции, включающие индукцию 0,3% лактозой в течение 12 часов при 37°C, обеспечивали продукцию АДА с высоким уровнем в цитоплазме бактерий-хозяев в количестве приблизительно 20% от суммарного белка клетки. Продукт АДА, пронализированный с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, обладал требуемой молекулярной массой приблизительно 40 кДа.

ПРИМЕР 5

Очистка мутеина рекомбинантной АДА человека

Очистку мутеина рчАДА выполняли с использованием 3-стадийной хроматографической очистки, разработанной Enzon. Культивирование бактериальных клеток проводили со штаммом E. coli, экспрессирующим белок рчАДА с синтетического гена в плазмиде pET28a (Novagen) в клетке-хозяине HMS 174(DE3). В минимальную среду с глицерином включали рифампицин (200 мкг/мл) и канамицин (мкг/мл) с добавлением дрожжевого экстракта (30 г/л) и выращивали клетки при 28°C до OD₆₀₀ 11, после чего добавляли индуктор IPTG до конечной концентрации 5 мМ. Через 40 часов (OD₆₀₀~110) клетки собирали центрифугированием и замораживали при -20°C. Вкратце, размороженную клеточную пасту (50 г) ресуспендировали в 1800 мл буфера, содержащего 10 мМ Трис, 1 мМ ДТТ, pH 8,0, и гомогенизировали при 1200 об/мин в течение 10 секунд на Tempest Virtis (Sentry^TM, Microprocessor, Boston, MA). Полученную суспензию пропускали через сито из нержавеющей стали (с отверстиями 250 мкм, № 60, W.S Tyler) для удаления крупных частиц. Однородную клеточную суспензию гомогенизировали с использованием гомогенизатора высокого давления в 3 циклах при 103,4 МПа (15000 psi) (установку охлаждали льдом) (MicroFluidizer, Microfluidics Corp., Model#110Y, Boston, MA). В конце микрогомогенизации 200 мл того же указанного выше буфера использовали для промывки установки, а полученный раствор объединяли с вышеуказанной суспензией. Растворимый белок из лизатов клеток выделяли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 40 минут при 4°C (Sorvall RC 5C plus, ротор SLA-1000). Супернатант собирали осторожно, чтобы избежать нежелательного смешивания. Уровень pH доводили до 8,0, после чего добавляли 1 мМ MgCl₂ и 20 мг/мл ДНКазы, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем pH доводили до 6,5 1Н HCl. Второе центрифугирование проводили так же, как описано выше, супернатант собирали и добавляли ЭДТА до концентрации 2 мМ с последующим фильтрованием с использованием фильтра Nalgene (90 мм фильтровального прибора). Объем отфильтрованного супернатанта составлял 500 мл, концентрация общего белка по методу BCA (с бицинхониновой кислотой) составила 8,5 мг/мл.

Клеточный экстракт (100 мл) доводили до pH 7,2, 4,5 мС/см и наносили на HiTrap^® DEAE ff в 20 мМ Бис-Трис, 20 мМ NaCl, pH 6,5 и элюировали в 20 мМ Бис-Трис, 500 мМ NaCl, pH 6,5. Пиковые фракции анализировали с помощью ферментного анализа и электрофореза в ДСН-ПААГ, после чего добавляли сульфат аммония до концентрации 1,5 М в 20 мМ NaHPO₄, pH 6,5 и наносили на колонку HiTrap Phenyl ff. Белок элюировали в градиенте буфера для нанесения и 20 мМ NaHPO₄, pH 6,5. Пиковую фракцию (55 мл, 0,4 мг/мл) подвергали диафильтрации против буфера, содержащего 20 мМ NaHPO₄, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, pH 6,5 и наносили на HiTrap SP-Sepharose ff и элюировали в 20 мМ NaHPO₄ , 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, pH 6,5. Собранная фракция содержала очищенный белок АДА (77 мл, 0,1 мг/мл).

ПРИМЕР 6

Очистка рекомбинантного бычьего белка АДА

Очистку мутеина рбАДА, экспрессируемого клоном Примера 2, выполняли с использованием 3-стадийной хроматографической очистки, разработанной Enzon. Вкратце, 200 г размороженной клеточной пасты (полученной от Blue Hereon или Biocatalytics, соответственно), которую хранили при -80°C, ресуспендировали в 1800 мл буфера, содержащего 20 мМ Бис-Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4, и гомогенизировали при 1200 об/мин в течение 5 минут на Tempest Virtis (Sentry ^TM, Microprocessor, Boston, MA). Полученную суспензию пропускали через сито из нержавеющей стали (с отверстиями 250 мкм, № 60, W.S Tyler) для удаления крупных частиц. Однородную суспензию клеток гомогенизировали с использованием гомогенизатора высокого давления в 3 циклах при 103,4 МПа (15000 psi) (установку охлаждали льдом) (MicroFluidizer, Microfluidics Corp., Model#110Y, Boston, MA). В конце микрогомогенизации 200 мл того же указанного выше буфера использовали для промывки установки, а полученный раствор объединяли с вышеуказанной суспензией. Растворимый белок из лизатов клеток выделяли центрифугированием при 7100 об/мин (12000×g) в течение 60 минут при 4°C (Avanti J-201, Beckman Coulter, ротор JLA8.1000). Супернатант собирали осторожно, чтобы избежать нежелательного смешивания.

Для удаления нуклеотидов в данном клеточном экстракте к вышеуказанному супернатанту добавляли полиэтиленимин (PEI) (до конечной концентрации 0,15%, масс/об) и тщательно смешивали в течение 10 мин. Затем полученный клеточный экстракт оставляли на ночь при 4°C. Осадок из указанного ночного образца удаляли с помощью центрифугирования при 7100 об/мин (12000×g) в течение 60 минут при 4°C (Avanti J-201, Beckman Coulter, ротор JLA8.1000). Точно так же супернатант осторожно собирали, чтобы избежать нежелательного смешивания. Чтобы поспособствовать связыванию АДА на первой колонке к данному клеточному экстракту медленно добавляли 10%-ный PEG4600 и pH полученного клеточного экстракта медленно доводили до 6,5 1Н NaOH и 1Н HCl. Затем супернатант снова центрифугировали при 7100 об/мин (12000×g) в течение 60 минут при 4°C (Avanti J-201, Beckman Coulter, ротор JLA8.1000) перед нанесением на следующую колонку.

Клеточный экстракт наносили на предварительно уравновешенную колонку Capto Q (номер по кат. 17-5316-01, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Объем слоя 350 мл в колонке XK-50 заранее насыщали буфером, содержащим 20 мМ Бис-Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 6,5. Перед элюированием АДА из колонки уравновешивающим буфером с 80 мМ NaCl для удаления примесей сначала выполняли элюирование при 60 мМ и 70 мМ NaCl. Профиль элюции анализировали на активность АДА, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, вестерн-блоттинга и ОФ-ВЭЖХ.

После колонки Capto Q одну за другой проводили две очистки с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), чтобы дополнительно повысить чистоту белка. Первую HIC-очистку проводили на октил-сефарозе 4FF (номер по кат. 17-0946-02, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Объединенные фракции АДА после колонки Capto Q непосредственно осаждали порошком сульфата аммония при концентрации 1,5 М (NH₄)₂SO₄ и доводили pH до 6,5. Отфильтрованный образец (Nalgene Nunc, номер по кат. 540887, MEMB 0.2 PES, Rochester, NY) наносили на первую колонку HIC, предварительно уравновешенную 1,5 М (NH ₄)₂SO₄, 20 мМ фосфатом калия, 1 мМ ЭДТА, pH 6,5 (объем слоя 150 мл, в XK-50, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Белок АДА элюировали в градиенте сульфата аммония, а профиль чистоты полученного элюата определяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и ОФ-ВЭЖХ. Белок АДА во фракциях первой колонки HIC объединяли и доводили концентрацию (NH₄)₂ SO₄ до 1 М, после чего непосредственно наносили на вторую колонку HIC (объем слоя 150 мл, XK-50, HIC Phenyl HP, номер по кат. 17-1082-01, Piscataway, NJ), предварительно уравновешенную 1 М (NH₄)₂SO₄, 20 мМ KH ₂PO₄-K₂HPO₄, 1 мМ ЭДТА, pH 6,5. АДА элюировали в градиенте сульфата аммония от 1 М до 300 мМ в 20 мМ KH₂PO₄-K₂HPO ₄, 1 мМ ЭДТА, pH 6,5. Чистоту АДА в полученных фракциях анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и ОФ-ВЭЖХ. Затем очищенные рбАДА или рчАДА обессоливали и концентрировали с помощью систем LabScale TFF (Membrane BioMax 5, Bedford, MA) против буфера для хранения (например, 100 мМ фосфат натрия, 1 мМ ЭДТА, pH 6,5).

ПРИМЕР 7

Получение ПЭГилированной Ser₇₄-рбАДА через образование

уретановой связи

СК-ПЭГ (N-гидроксисукцинимидилкарбонат-активированный полиэтиленгликоль, 0,084 ммоль) добавляли к раствору Ser ₇₄-рбАДА (0,00027 ммоль) в 3 мл натрий фосфатного буфера (0,1 М, pH 7,8) при легком перемешивании. Раствор перемешивали при 30°C в течение 30 минут. С целью контроля ПЭГ-конъюгирования использовали ГПХ-колонку (Zorbax GF-450). В конце реакции (о чем свидетельствовало отсутствие нативного фермента) смесь разбавляли 12 мл буфера для приготовления композиции (0,05 М фосфат натрия, 0,85% хлорид натрия, pH 7,3), после чего подвергали диафильтрации с использованием концентратора Centriprep (Amicon) для удаления непрореагировавшего ПЭГ. Диафильтрацию продолжали при 4°C столько, сколько необходимо, пока свободного ПЭГ более не обнаруживалось при смешивании равных количеств фильтрата и 0,1% PMA (полиметакриловой кислоты в 0,1 М HCl).

ПРИМЕР 8

Получение ПЭГилированной Ser₇₄-рчАДА через образование

уретановой связи

Реакцию СК-ПЭГ (0,084 ммоль) и Ser₇₄-рчАДА (0,00027 ммоль) проводили с использованием тех же условий, как описано в Примере 7.

ПРИМЕР 9

Получение ПЭГилированной Ser₇₄-рбАДА через образование

амидной связи

СС-ПЭГ (N-гидроксисукцинимидилсукцинат-активированный полиэтиленгликоль, 0,084 ммоль) добавляли к раствору Ser₇₄-рбАДА (0,00027 ммоль) в 3 мл натрий фосфатного буфера (0,1 М, pH 7,8) при легком перемешивании. Раствор перемешивали при 30°C в течение 30 минут. С целью контроля ПЭГ-конъюгирования использовали ГПХ-колонку (Zorbax GF-450). В конце реакции (о чем свидетельствовало отсутствие нативного фермента) смесь разбавляли 12 мл буфера для приготовления композиции (0,05 М фосфат натрия, 0,85% хлорид натрия, pH 7,3), после чего подвергали диафильтрации с использованием концентратора Centriprep (Amicon) для удаления непрореагировавшего ПЭГ. Диафильтрацию продолжали при 4°C столько, сколько необходимо, пока свободного ПЭГ более не обнаруживалось при смешивании равных количеств фильтрата и 0,1% PMA (полиметакриловой кислоты в 0,1 М HCl).

ПРИМЕР 10

Получение ПЭГилированного мутеина рчАДА через образование амидной связи

Реакцию СС-ПЭГ (0,084 ммоль) и мутеина рчАДА (0,00027 ммоль) проводили с использованием тех же условий, как описано в Примере 9.