способ определения токсичности почвы методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий paramecium caudatum ehrenberg

Формула изобретения

Способ определения токсичности почвы методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg, включающий экстракцию почвенного образца водой, фильтрацию с получением прозрачного раствора и рН 7,0-8,2, приготовление шкалы разведений экстракта и определение токсичности образца по тест-реакции инфузорий, отличающийся тем, что почву повторно экстрагируют водным раствором ацетона, проводят фильтрование, далее экстрагируют гексаном, сливают нижнюю гексановую фракцию и повторяют переэкстракцию новой порцией гексана, гексановый экстракт упаривают досуха, добавляют этанол, закрывают и настаивают с последующим переводом в коллоидный раствор путем разбавления этанолового экстракта до концентрации 2% водным раствором препарата сухой желчи КРС с концентрацией 0,01%, биотестируют шкалу разбавлений по тест-реакции скорости сокращений выделительных вакуолей инфузорий и оценивают уровень токсичности почвенного образца по величинам токсичности водорастворимой фракции и водонерастворимой с ДДТ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области сельского хозяйства, экологии и может быть использовано в системе экотоксикологического мониторинга земель сельскохозяйственного назначения.

Суть изобретения.

Способ заключается в фракционном извлечении остатков пестицидов из почвы: с помощью водной экстракции - водорастворимых токсикантов и с помощью органического растворителя - остатков ДДТ с последующими испарением растворителя, переводом экстракта в коллоидное состояние в воде с применением поверхностно-активного вещества (ПАВ) и после дующего биотестирования на инфузориях Paramecium caudatum по тест-реакции скорости сокращения выделительных вакуолей.

Описание

Анализ интегральной токсичности почвы, определяемой с помощью инфузорий, показывает отсутствие в ее составе токсичности наиболее экологически опасных как по уровню токсичности, так и по степени накопления веществ, относящихся к стойким органическим загрязнителям (СОЗ), таких как ДДТ, диоксины, полихлорированные бифенилы, фураны, полициклические ароматические углеводороды, нефтепродукты.

Данное явление связано с плохой растворимостью соединений этого класса (хлорорганические) в воде, а также с тем фактом, что инфузории в силу своих размеров поглощают в основном растворенные вещества.

Водорастворимость стойких органических загрязнителей (СОЗ) почв.

пестицид	ДДТ	линдан	диоксины	атразин	ПХБ	бенз(а)пирен
Водо растворимость	<1 мкг/мл	5-7 мг/мл	<1 мкг/мл	33 мг/мл	<1 мкг/мл	<1 мкг/мл

Определение данных загрязнителей, характеризующихся тенденцией к накоплению в окружающей среде, является приоритетной задачей при биотестировании почв.

Известен способ биотестирования на инфузориях стилонихиях, где объект исследования корма экстрагируется ацетоном с последующим разбавлением

ацетонового экстракта водой до 1% содержания ацетона (Экспресс-метод определения общей токсичности фуражного зерна, продуктов его переработки и комбикормов с использованием инфузорий стилонихий. ГОСТ 13496.7-92 «Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности». ГОСТ 29136-91 «Мука кормовая из рыбы, морских млекопитающих, ракообразных и беспозвоночных. Методы определения токсичности»).

Недостатком данного способа является тот факт, что инфузории как одноклеточные микроскопические организмы проявляют тест-реакцию в первую очередь на растворенные токсичные вещества.

В то же время растворяющая сила 1% раствора ацетона в воде очевидно недостаточна для растворения токсикантов класса СОЗ, токсины же, выпавшие в осадок, действуют на инфузории, в силу их тигмоотрицательности, только как неблагоприятные условия среды (шумовой эффект) проведения эксперимента.

При пробоподготовке по данному способу в процессе перевода ацетонового экстракта в 1% водноацетоновый раствор присутствующие СОЗ выпадают в осадок и не оказывают непосредственное токсическое действие на инфузории.

Однако существуют приемы повышения доступности для инфузорий труднорастворимых веществ с помощью поверхностно-активных веществ (ПАВ) и последующим биотестированием их на гидробионтах (Виноходов Д.О. Научные основы биотестирования с использованием инфузорий: автореф. дис., докт. биол. наук: 03.00.23. - М, 2007).

Выявлена чувствительность инфузорий к поверхностно-активным веществам - твину-80, тритону Х-305, додецилсульфату натрия. Полученные данные позволяют говорить о том, что для суспензирования не растворимых в воде токсичных веществ целесообразно применять этанол, ацетон, тритон Х-305 и твин-80, так как эти вещества не обладают высокой токсичностью по отношению к инфузориям.

Доступность труднорастворимых веществ для инфузорий при использовании ПАВ обусловлена процессами увеличения их дисперсности в водной среде.

Основной проблемой при использовании поверхностно-активных веществ для биотестирования является их токсичность для гидробионтов, характеризующаяся прямой зависимостью от степени достигаемой дисперсности, получаемых с помощью ПАВ коллоидных растворов. Кроме того, время сохранения достигнутого уровня дисперсности (стабильность) так же взаимозависимо от степени токсичности и количества применяемого ПАВ.

В процессе биотестирования в исследуемых диспергированных образцах могут возникать тенденции снижения дисперсности, приводящие к снижению чувствительности инфузорий.

Решением данной проблемы могут служить тест-реакции инфузорий, регистрируемые в сроки в интервале нескольких минут (до 1 часа).

Известен метод, включающий прием краткосрочного биотестирования, что позволяет решить задачу нестабильности во времени уровня дисперсности, включающий определение тест-реакции инфузорий на токсические вещества в течение короткого отрезка времени (Патент RU 2281507 С2, МПК G01N 33/483 (2006.01).

Способ определяет токсичность объекта на физиологическом уровне - по снижению числа сокращений выделительных вакуолей на 50%, когда морфологические изменения в клетке еще не достаточно выражены.

Инфузории Paramecium caudatum имеют две сократительные (выделительные) вакуоли - одна в передней, другая в задней части тела, вакуоли попеременно сокращаются по мере наполнения их жидкостью с продуктами обмена веществ и выбрасывают содержимое в окружающую среду через специальное отверстие в клеточной стенке - экскреторную пору. Длительность интервала между двумя сокращениями вакуолей (частота пульсации) зависит от температуры окружающей среды (при температуре 16°С она равна 3-4 в мин). При добавлении в среду токсического вещества оно немедленно поступает внутрь инфузории, т.к. всасывание происходит всей поверхностью ее тела. Токсические вещества, поступившие внутрь клетки, нарушают ее жизнедеятельность, что сказывается и на выделительной системе, число сокращений выделительных вакуолей уменьшается вплоть до полной блокады их функции.

При полном прекращении сокращений вакуоли переполняются продуктами обмена, их объем значительно увеличивается. Следующим этапом губительного действия токсина на инфузории при его высокой концентрации в среде являются грубые морфологические изменения в клеточной стенке инфузорий в виде множественных округлых выростов («вакуолизация» клеточной стенки), которые затем разрываются, и содержимое клетки (эндоплазма)выходит в окружающую среду. По данному способу в культуру инфузорий Paramecium caudatum вносят исследуемый токсин в различных разведениях, выдерживают в течение трех минут при комнатной температуре, подсчитывают число сокращений выделительных вакуолей за 1 мин у 6-7 инфузорий, определяют токсическое воздействие бактериального антигена по степени угнетения выделительной функции инфузорий, и за токсическую концентрацию принимают концентрацию антигена, снижающую на 50% число сокращений выделительных вакуолей инфузорий по сравнению с контролем.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ (прототип) определения токсичности почвы с применением культуры равноресничных инфузорий Paramecium caudatum (Методика определения токсичности отходов, почв, осадков сточных, поверхностных и грунтовых вод методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg.

Федеральный реестр (ФР) ФР. 1.39.2006.02506 ПНД Ф 14.1:2:3.13-06).

Недостатком способа является определение в почве только водорастворимых токсинов. Даже при значительных превышениях ПДК такого загрязнителя как ДДТ в 10, в 100 раз, реакция инфузорий будет отсутствовать.

Способ включает почвенную пробоподготовку с экстракцией, биотестирование с высокочувствительной и легко воспроизводимой культурой инфузорий.

Цель предлагаемого изобретения - повышения точности оценки биотестирования за счет включения в состав определяемых веществ труднорастворимого в воде ДДТ.

Поставленная цель достигается за счет процесса пробоподготовки почвы. Суть метода заключается в переводе извлеченных из почвы труднорастворимых в воде токсикантов в виде дисперсии, доступной для инфузорий в водной среде, способом конденсации. Для этого почвенный экстракт органического растворителя упаривается досуха, растворяется в 1 мл этанола и переводится в водную фазу в присутствии специально подобранных поверхностно-активных веществ. При этом токсиканты, переходящие в слабый растворитель (воду), начинают создавать осадок, образуя кристаллы - точки роста. Одновременно ПАВ, подобранное по степени подвижности и величине гидрофильно-липофильного баланса, локализуется на границе раздела фаз (вода/токсикант), препятствуя росту кристаллов и стабилизируя уровень дисперсности.

В качестве ПАВ для стабилизации дисперсии ДДТ, экспериментальным путем была выбрана желчь КРС. Входящие в ее состав желчные кислоты, обладающие хорошей подвижностью, как низкомолекулярные ПАВ, а также лецитин, создающий стероидную защиту дисперсной фазы, показали результаты относительно низкой токсичности при достаточном уровне дисперсности.

Табл. № 1
Токсичность поверхностно-активных веществ для инфузорий в Log фазе % гибели относительно контроля (инфузории в культуральной среде). Экспозиция 3 часа
ПАВ	Paramecium caudatum	Tetrahymena pyriformis
Тритон-100 0,02%	100	100
Тритон-100 0,01%	100	100
Тритон-100 0,005%	49,4	100
Tween-20 0,02%	36,7	-
Tween-20 0,01%	24,5	-
Tween-20 0,005	12,4	-
Желчь КРС 0,02%	14,7	27,8
Желчь КРС 0,01%	+5,8	11,1
Желчь КРС 0,005%	+3,9	10,9

По данных таблицы видно, что желчь, как ПАВ, стабилизирующее дисперсную фазу, будет иметь преимущество, так как при высоком показателе гидрофильно-липофильного баланса (ГБЛ) может применяться в больших количествах и соответствовать широкому разбросу дозы токсикантов в исследуемых образцах.

Основной функцией выбранного ПАВ является создание такого уровня дисперсности, который соответствует поглотительной способности инфузорий.

Табл. № 2
Сравнительная чувствительность инфузорий к токсикантам, диспергированным с помощью желчи КРС (экспозиция - сутки, культуры - 3 дня после пересева)
Варианты	Parameciuin caudatum количество клеток начало конец %	Tetrahymena pyriformis количество клеток начало конец %
Контроль-дисперсная среда (водный раствор этанола 2%, желчи - 0,01%)	10	18	+80,0	1238	939	-24
ДДТ 0,04 мг/мл (суспензия в воде)	12	22	+83,3	1109	1977	+78
Бенз(а)пирен 0,008 мг/мл (суспензия в воде)	11	20	+81,8	809	871	+7,6
ДДТ 0,04 мг/мл в дисперсной среде (коллоид)	10	0	-100	1222	785	35,7
Бенз(а)пирен 0,008 мг/мл в дисперсной (коллоид) среде	12	5	58,3	975	867	11,1

По данным биотестирования, проведенным с помощью автоматизированной системы БиоЛАТ, очевидна наибольшая эффективность предлагаемого метода в вариантах с использованием культуры Paramecium caudatum. Более высокий уровень чувствительности, по-видимому, связан с большими размерами клеток данной культуры инфузорий, адекватными уровню достигаемой дисперсности, достигаемой с помощью желчи.

Таким образом нами предлагается способ определения токсичности почвы методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg, включающий экстракцию почвенного образца водой, фильтрацию с получением прозрачного раствора и рН 7,0-8,2, приготовление шкалы разведений экстракта и определение токсичности образца по тест-реакции инфузорий, отличающийся тем, что почву повторно экстрагируют водным раствором ацетона, проводят фильтрование, далее экстрагируют гексаном, сливают нижнюю гексановую фракцию и повторяют переэкстракцию новой порцией гексана, гексановый экстракт упаривают досуха, добавляют этанол, закрывают и настаивают, с последующим переводом в коллоидный раствор, путем разбавления этанолового экстракта до концентрации 2% водным раствором препарата сухой желчи КРС с концентрацией 0,01%, биотестируют шкалу разбавлении по тест-реакции скорости сокращений выделительных вакуолей инфузорий и оценивают уровень токсичности почвенного образца по величинам токсичности водорастворимой фракции и водонерастворимой с ДДТ.

Пример осуществления изобретения.

Модельный образец почвы содержит ДДТ в количестве 1 ПДК (0,1 мг/кг почвы).

Навеску почвы 200 г в воздушно-сухом состоянии помещают в колбу емкостью 1000 мл и приливают 4-кратное количество дистиллята. На аппарате для встряхивания полученную смесь обрабатывают в течение 2-х часов, после чего отстаивают в течение 30 мин. Надосадочную жидкость декантируют, а остаток фильтруют через бумажный обеззоленый фильтр (белая лента).

Первые порции фильтрата часто бывают мутными. Их необходимо перефильтровать до прозрачного раствора. При повышенной мутности допускается отстаивание в холодильнике до 5 суток. Вытяжка из почвы должна иметь рН в диапазоне 7,0-8,2. Переходят к биотестированию водорастворимой фракции.

Почву, оставшуюся на фильтре, взвешивают, отбирают четверть (соответствует 50 г), помещают в круглодонную колбу на 250 мл, добавляют 40 мл водного раствора хлористого аммония 1% концентрации, закрывают притертой пробкой и оставляют на сутки.

Почву заливают 100 мл 75% ацетона в воде и встряхивают на аппарате в течение часа. Жидкую часть экстракта из круглодонной колбы переносят на фильтр, проводя фильтрование в делительную воронку 500 мл.

В делительную воронку приливают 100 мл гексана, взбалтывают воронку в течение 1-2 минут, сливают нижнюю гексановую фракцию в круглодонную колбу со шлифом от ротационного испарителя и повторяют переэкстракцию повторно новой порцией гексана 50 мл. Объединенный гексановый экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 50 градусов. Последнюю стадию упаривания проводят в пробирке 5 мл.

К сухому остатку в пробирке приливают 0,5 мл этанола, закрывают пробирку и настаивают 3 часа (до полного растворения ДДТ).

Одновременно с растворением сухого остатка готовят дисперсионную среду для диспергирования ДДТ методом конденсации (перехода от сильного растворителя к слабому). Для этого готовят 0, 01% раствор желчи КРС (максимальная концентрация нетоксичная для инфузорий) и подогревают раствор на водяной бане до температуры 37 градусов.

0,5 мл этанолового экстракта шприцом быстро и при помешивании вводится в раствор желчи 25 мл. Получившийся коллоидный раствор с эффектом светорассеивания немедленно биотестируют.

Процесс биотестирования.

1. Биотестирование водорастворимой фракции.

Для биотестирования используют микроаквариум с лунками, который помещают на предметный столик стереомикроскопа. Одну из лунок заполняют культурой инфузорий с помощью капиллярной пипетки. В свободные лунки капиллярной пипеткой помещают по (10-12) особей в каждую лунку, так, чтобы на одну тестируемую пробу приходилось не менее 50 инфузорий в пяти лунках. При помещении тест-объекта количество культуральной жидкости в лунке не должно превышать 0,02 см. Пять лунок используют в качестве контрольных.

После помещения инфузорий наливают в контрольные лунки по 0,6 см культивационной воды, в опытные - по 0,6 см тестируемой пробы. Отмечают время начала биотестирования и подсчитывают под микроскопом количество особей в каждой лунке.

Микроаквариум с заполненными лунками помещают в термостат и выдерживают в течение 24 часов при температуре (22-24)°С. По истечении этого времени производят подсчет о выживших и погибших особей под микроскопом. Выжившими считаются инфузории, которые свободно перемещаются в толще воды. Обездвиженных особей относят к погибшим.

Если гибель парамеции в контроле превышает 10%, результаты опыта не учитывают, и его повторяют снова.

2. Биотестирование фракции с ДДТ.

Биотестирование проводят в лунках полистироловой планшеты. В лунки дозатором с съемным наконечником впрыскивают культуральный раствор с инфузориями в количестве 8-10 клеток в 30-40 мкл. В контрольные лунки приливают по 500 мкл дистиллированной воды, а в остальные - разведения коллоидного опытного экстракта. Через 30 мин микроскопируют лунки, подсчитывая число сокращений выделительных вакуолей у 6-7 неподвижных клеток. С учетом стандарта количества сокращений 7-8 в минуту, определяют степень токсичности испытуемого экстракта, принимая за токсическую дозу 50% уменьшение скорости сокращений.

С учетом изменения количества сокращений в примере 2,35-2,47 сокращения в минуту в варианте коллоидный раствор без разведения образец почвы содержит хроническую токсичность, т.е. содержит токсичность стойкого органического загрязнителя - ДДТ.