способ получения биоинженерной конструкции для замещения костных дефектов

Формула изобретения

Способ получения биоинженерной конструкции для замещения костных дефектов, основой которой является деиммунизированная костная ткань, отличающийся тем, что кость, анатомически соответствующую замещаемой, деиммунизируют в 5-10%-ном растворе, приготовленном из сухой смеси хлорита натрия, перхлората натрия, натрия хлорида в соотношении 7:2:1 и дистиллированной воды; покрывают гетерогенным имплантируемым гелем и колонизируют мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками, выделенными из костного мозга реципиента методом иммуномагнитной сепарации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к реконструктивной хирургии, предназначено для применения в области трансплантологии, травматологии, хирургии и онкологии.

Известен способ получения биоинженерной конструкции для закрытия костных дефектов с восстановлением в них костной ткани, при котором используется синтетическая основа, выделение стромальных клеток из жировой ткани или костного мозга реципиента с последующим культивированием, после чего клетки пассируют на поверхность многофункционального, биосовместимого, нерезорбируемого покрытия гибридного имплантата, представляющего собой пористую мембрану из политетрафторэтилена с размерами пор 200-500 мкм, и инкубируют в остеогенной среде в течение 14 дней (патент РФ № 2416434).

Недостатки указанного аналога: синтетическая основа конструкции не имеет анатомических особенностей кости; поверхность конструкции колонизируют клетками-предшественниками костной ткани, не способными сформировать фиксирующую соединительнотканную капсулу и капиллярную сеть; при повреждении биоактивного покрытия политетрафторэтилен основы конструкции не способен обеспечить адгезию клеток на своей поверхности, что ведет к ухудшению функциональных характеристик биоимплантата и развитию местной воспалительной реакции; возможна хроническая травматизация тканей реципиента в зонах крепления конструкции к кости из-за различной плотности материалов.

Известны способы получения биоинженерных конструкций для замещения костных дефектов, в основе которых лежит насыщение культурой аутологичных мультипотентных клеток, выделенных из костного мозга, пористых матриксов из гранулированных биокерамических материалов на основе гидроксиапатита или из натуральных кораллов Acropora sp., Porites sp. [Vaccaro A.R. The Role of the Osteoconductive Scaffold in Synthetic Bone Graft // Orthopedics, 2002, V.25, № 5, Suppl., P. s571-s578; Louisia S., Stromboni M., Meunier A., Sedel L, Petite H. Coral grafting supplemented with bone marrow // J Bone Joint Surg [Br], 1999; V.81-B, № 4, P.719-724]. Однако установлено, что такой подход имеет значимые недостатки. В частности, биокерамические материалы в организме плохо рассасываются, и их остатки оказываются замурованными в костную ткань, что делает ее менее прочной [Сергеева Н.С., Франк Г.А., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Антохин А.И. Роль аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в тканеинженерных конструкциях на основе натуральных кораллов и синтетических биоматериалов при замещении костных дефектов у животных. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2009, т.IV, № 4, с.56-64]. Кроме того, керамику на основе гидроксиапатита можно использовать только для замещения участков костей, не несущих значительных механических нагрузок, что обусловлено хрупкостью материала и его высокой чувствительностью к коррозии под напряжением в физиологических жидкостях организма, приводящей к разрушению имплантата [Баринов С.М. Керамические и композиционные материалы на основе фосфатов кальция для медицины. // Успехи химии, 2010, 79(1), с.15-32]. Высокая порозность естественных корралов обусловливает хрупкость материала. По этой причине подобные конструкции рекомендовано использовать либо для восстановления дефектов губчатой костной ткани, либо в сочетании с металлическими пластинами, несущими опорную функцию [Demers С., Hamdy С.R., Corsi К., Chellat F., Tabrizian M., Yahia L. Natural coral exoskeleton as a bone graft substitute: A review // Bio-Medical Materials and Engineering, 2002, V.12, № 1, P.15-35].

Наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является способ получения трансплантата "Био-матрикс имплант I" для стоматологии [патент РФ 2136298). Этот способ предусматривает деиммунизацию донорской кости, включает предварительное распиливание кости на блоки размером 3×2×1 см, получение сквозных отверстий размером от 0,1 мм до 10 мм в каждой плоскости блока, не менее одного отверстия на 1 см², обработку блоков смесью ферментов, состоящей от 0,1-1% раствора трипсина и 0,125-0,3% раствора папаина, взятых в соотношении 1:1. Затем в смеси 1% раствора перекиси водорода и 1% раствора этанола, взятых в соотношении 1:1, отмывают и заполняют каждое отверстие блока материалом, состоящим из солей двух- и/или трехвалентных металлов, коллагена, алкилпроизводных, или карбоксилалкилпроизводных, или гидроксиалкилпроизводных целлюлозы, сульфатированных гликозаминогликанов и воды, после чего костный блок замораживают, лиофилизируют и стерилизуют облучением дозой 2,5 Мград.

Недостатки прототипа: 1) при использовании имплантата, полученного указанным способом, возможно замещение костных дефектов только небольшой площади (не более 3×2×1 см), что ограничивает его применение в области стоматологии и челюстно-лицевой хирургии; 2) длительный процесс фиксации и репарации имплантата в организме реципиента.

Задачей изобретения является разработка способа получения биоинженерной конструкции для замещения костных дефектов значительных по площади, обеспечивающего сохранение физических и анатомических особенностей донорской кости, высокую прочность, быструю фиксацию в зоне имплантации и репарацию тканью реципиента, отсутствие реакции отторжения имплантата.

Задача решается тем, что в качестве основы биоинженерной конструкции используют донорскую кость, которую деиммунизируют с помощью хлорсодержащих окислителей, затем наносят гетерогенный имплантируемый гель и колонизируют мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК).

Заявляемый способ получения биоинженерной конструкции осуществляют следующим образом. Кость человека или животного очищают от мягких тканей. При толщине стенки кости более 5 мм ее перфорируют. Затем кость помещают в деиммунизирующий 5-10% раствор, приготовленный из сухой смеси хлорита натрия, перхлората натрия, натрия хлорида в соотношении 7:2:1 и дистиллированной воды. Кость полностью погружают в приготовленный раствор и выдерживают в темноте от 1 до 4 месяцев в зависимости от размеров и толщины стенки кости. Костно-мозговой канал промывают раствором указанного состава 1 раз в 3 суток. Деиммунизированную кость хранят при t=-70°C в смеси диметилсульфоксида и 6% раствора декстрана в соотношении 1:9 в 0,9% растворе хлорида натрия. Затем деиммунизированную кость последовательно промывают в дистиллированной воде и стерильном 0,9% растворе хлорида натрия, поверхность покрывают гетерогенным имплантируемым гелем, таким как «Сферогель» или «Матригель». Для получения ММСК у реципиента производят забор костного мозга. Мононуклеарные клетки выделяют на градиенте фиколл-урографин (плотность 1,077) центрифугированием при 900 g. Затем клетки дважды отмывают от фиколла, центрифугируют при 600 g в среде RPMI 1640. Из полученной суспензии методом иммуномагнитной сепарации выделяют мезенхимальные CD 271+ клетки, которые культивируют в среде MACS NH Expansion Medium (Miltenyi Biotec), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина 2 мМ, пенициллина G 100 МЕ/мл, стрептомицина 100 мкг/ мл, в пластиковых культуральных флаконах при t 37°C и 5% CO₂ в течение 2-3 пассажей. Затем среду с взвешенными клетками удаляют и фракцию, способную к адгезии, культивируют в течение 3-6 пассажей в среде указанного состава. Оценивают фенотип клеток методом проточной цитометрии. Клетки равномерно распределяют по поверхности конструкции сразу после нанесения геля. Для заселения конструкции используют суспензию клеток, содержащую не менее 85% CD271+ клеток. Конструкцию помещают в среду RPMI 1640, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина 2 мМ, пенициллина G 100 МЕ/мл, стрептомицина 100 мкг/ мл, и инкубируют при 37°C в течение 3-10 суток.

Прочность полученной биоинженерной конструкции изучали на сжатие по показателям «предел текучести», «модуль упругости» и «предел прочности» в соответствие с ГОСТ 4651-82 на участке деформационной кривой от 10 до 30 МПа. Для проведения исследований использовали лучевые и плечевые кости пяти взрослых собак, подвергнутых эвтаназии вследствие получения травм, несовместимых с жизнью. Средний возраст животных 9±1,2 года. Кости очищали от мягких тканей, из костно-мозгового канала удаляли остатки костного мозга. Для сравнительного анализа использовали диафизарные фрагменты костей цилиндрической формы высотой 20 мм. Подготовленные фрагменты костей были разделены на две группы: контрольная и опытная (фрагменты костей обработаны по заявляемому способу). Испытания на сжатие проводились на универсальной испытательной машине Zwick/Roell z020. Результаты исследования представлены в таблице.

Кость	Группа	Предел текучести 0,2, МПа	Модуль упругости, МПа	Предел прочности, МПа
Плечевая	опытная	84±2,1	1740±353	89±2,1
контрольная	81±12,5	1602±102	90±5,2
Лучевая	опытная	78±8,2	1720±233	87±16,3
контрольная	79±21,0	1852±212	94±18,6

Достоверных различий в группах сравнения не выявлено (p>0.05),

Реакцию острого отторжения биоинженерной конструкции и ее репарацию клетками донора изучали на мышах линии СВА. Для получения биоинженерной конструкции по заявляемому способу использовали бедренные кости мышей. Далее выполняли гетеротопную сингенную имплантацию полученной биоинженерной конструкции мышам линии Balb/c под кожу на спине. Через 3 месяца после имплантации биоинженерную конструкцию извлекали и проводили морфологическое исследование.

Изобретение иллюстрировано фигурами 1-4.

Фиг.1 - продольный срез биоинженерной конструкции из бедренной кости мыши через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации. Ув.100.

Фиг.2 - продольный срез биоинженерной конструкции из бедренной кости мыши с сохранением структуры губчатого вещества костно-мозгового канала через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации. Ув.200.

Фиг.3 - реколонизация клетками поверхности биоинженерной конструкции из бедренной кости мыши через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации. Ув.400.

Фиг.4 - реколонизация клетками донорской ткани биоинженерной конструкции из бедренной кости мыши через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации. Ув.900.

Через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации признаки механической и ферментативной деградации макро- и микроструктуры биоинженерной конструкции не наблюдали (Фиг.1, 2). На фиг.3 и 4 представлена реколонизация бесклеточной костной основы имплантированной биоинженерной конструкции клетками реципиента. На поверхности конструкции - формирование клеточного слоя, морфологически сходного с тканью надкостницы (Фиг.3), и соединительно-тканного слоя (Фиг.2).

Технический результат

Заявляемый способ обеспечивает замещение костных дефектов, значительных по площади, высокую прочность, быструю фиксацию и репарацию конструкции в зоне имплантации, не приводит к развитию реакции отторжения.