способ снижения содержания димера в композиции, содержащей полипептид фактора vii путем тепловой обработки

Формула изобретения

1. Способ снижения содержания димеров в композиции, содержащей полипептид Фактора VII, который включает следующие стадии:

(a) при необходимости, доведение рН указанной композиции до значения в интервале 5,0-10,0 (согласно изменениям при 5°С);

(b) нагревание композиции до температуры в интервале 20-50°С в течение периода, составляющего 10 мин до 72 ч; и

(c) последующее охлаждение композиции до температуры не выше 5°С.

2. Способ по п.1, где температура на стадии (b) находится в интервале 30-45°С, а период нагревания на стадии (b) - в интервале 10-600 мин.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, где на стадии (а) доводят рН до значения в интервале 5,0-6,5.

4. Способ по п.1, который включает следующие стадии:

(a) при необходимости, доведение рН указанной композиции до значения в интервале 5,0-6,5 (согласно изменениям при 5°С);

(b) нагревание композиции до температуры в интервале 30-45°С в течение периода, составляющего от 20 мин до 600 мин; и

(c) последующее охлаждение композиции до температуры не выше 5°С.

5. Способ по п.1, который включает следующие стадии:

(а) при необходимости, доведение рН указанной композиции до значения в интервале 9,0-10,0 (согласно изменениям при 5°С);

(b) нагревание композиции до температуры в интервале 30-45°С в течение периода, составляющего от 20 до 600 мин; и

(c) последующее охлаждение композиции до температуры не выше 5°С.

6. Способ по любому из пп.1 и 2, где полипептид Фактора VII является вариантом Фактора VII.

7. Способ по любому из пп.1-6, где полипептид Фактора VII активируют на стадии, следующей за стадией (b).

8. Способ по любому из пп.1-6, где стадии (а) предшествует анионообменная хроматография.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу снижения содержания димеров в композициях полипептида Фактора VII, особенно в композициях, включающих варианты Фактора VII.

Предшествующий уровень техники

Доказано, что фактор VII, участвующий в каскаде реакций свертывания крови, является эффективным терапевтическим агентом для лечения различных патологических состояний. Соответственно, существует необходимость в композициях, включающих полипептиды активированного Фактора VII, которые являются фармацевтически доступными и имеют единообразную и заранее определенную клиническую эффективность.

При коммерческом производстве полипептидов Фактора VII серьезней задачей является предотвращение образования агрегатов, таких как ди- и олигомеры интересующего полипептида. Подобные загрязнения, связанные с продуктом, нежелательны из-за их потенциальной антигенности. Как правило, в целях контроля образования агрегатов/димеров в ходе производства избегают крайних значений рН и высоких температур.

WO 2007/026020 А1 касается способа очистки композиции, включающей полипептиды фактора VII и фактора VIIa, от побочных продуктов производства, с минимизацией сопутствующего образования продуктов аутодеградации фактора VII или фактора VIIa.

Следовательно, в связи с изготовлением полипептидов фактора VII требуется стадия производства, в ходе которой содержание димеров (включая более высокомолекулярные олигомеры) полипептида фактора VII снижается без существенной потери выхода. Это приведет к более безопасному и более стабильному лекарственному веществу и, следовательно, более безопасному и более стабильному лекарственному продукту.

Краткое описание изобретения

Настоящим изобретением решается упомянутая выше проблема путем применения стадии тепловой обработки для снижения содержания димеров (и более высокомолекулярных олигомеров).

В частности, настоящее изобретение предоставляет способ снижения содержания димеров в композиции, содержащей полипептид Фактора VII, который включает следующие стадии:

(a) при необходимости, доведение рН указанной композиции до значения в интервале 4,5-10,0 (согласно изменениям при 5°С);

(b) нагревание композиции до температуры в интервале 20-50°С в течение периода, равного по меньшей мере 5 мин; и

(c) последующее охлаждение композиции до температуры не выше 10°С.

Краткое описание фигур

На Фиг.1 отображено изменение содержания димеров в образце композиции V158D/E296V/M298Q-FVII, который подвергали тепловой обработке при 37°С в течение 120 минут. Шкала: время в минутах.

На Фиг.2 отображено изменение содержания димеров в трех идентичных во всех остальных отношениях образцах композиции V158D/E296V/M298Q-FVII, которые либо нагревали при 23°С или 37°С, либо хранили при 5-8°С (контроль) в течение 48 часов. Шкала: время в часах.

На Фиг.3 представлено количество высокомолекулярных белков (полимер и олигомер), мономера и соли, которое остается по завершении способа по изобретению, описанному здесь.

На Фиг.4 отображено изменение содержания димеров в образце композиции V158D/E296V/M298Q-FVII, где рН была доведена до 9,5 перед тепловой обработкой при 37°С в течение 168 часов. Шкала: время в часах.

Подробное описание изобретения

Как было сказано выше, настоящее изобретение относится к способу снижения содержания димеров в композиции, включающей полипептид фактора VII. Способ предпочтительно применяют на конечной стадии общего процесса производства полипептида фактора VII, поскольку дальнейшие манипуляции с композицией, включая нагревание, изменения рН, приведение в контакт с хроматографическими материалами и т.д., могут вызвать повторное образование димеров.

Способ включает следующие стадии, из которых стадия (а) не является обязательной:

(a) при необходимости, доведение рН указанной композиции до значения в интервале 4,5-10,0 (согласно изменениям при 5°С);

(b) нагревание композиции до температуры в интервале 20-50°С в течение периода, равного по меньшей мере 5 мин; и

(c) последующее охлаждение композиции до температуры не выше 10°С.

Композиция, включающая полипептид фактора VII

В данном тексте выражение «композиция» использовано для обозначения жидкой композиции, предпочтительно водной жидкой композиции, т.е. композиции, включающей менее чем 5% неводных растворителей. Композиция, предназначенная для обработки по данному способу, включает полипептид фактора VII, а также определенные примеси в форме димеров.

Подразумевают, что термин «димер» включает истинные димеры, а также более высокомолекулярные олигомеры и агрегаты (например, тримеры, тетрамеры и т.д.) любого пептида фактора VII. Было сделано наблюдение, что некоторые варианты полипептида фактор VII имеют повышенную склонность к образованию димеров по сравнению с фактором VII дикого типа. Повышенное образование димеров можно объяснить тем фактом, что варианты полипептида фактора VII имеют структуру, отличную от структуры фактора VII дикого типа, и, следовательно, другие свойства. Одним из примеров таких свойств, которые могут отличаться, является температура, при которой они денатурируют, т.е. их точка плавления. Когда полипептиды фактора VII денатурируют, их поверхность становится более гидрофобной и они поэтому могут стремиться к взаимодействию с другими денатурированными, гидрофобными полипептидами фактора VII, образуя при этом димеры. По этой причине данное изобретение можно рассматривать как применимое в особенности, хотя и не исключительно, к композициям таких вариантов полипептида фактора VII.

Способ по данному изобретению особенно подходит для композиций, имеющих сравнительно высокое содержание димеров, т.е. содержание димеров в необработанной композиции (т.е. перед стадией (b)) составляет по меньшей мере 3%, например по меньшей мере 4%, например по меньшей мере 5%, например по меньшей мере 6%, например по меньшей мере 8% или даже по меньшей мере 10%.

Термин «полипептид фактора VII» будет описан более детально ниже. На основании предварительных наблюдений полагают, что настоящее изобретение особенно подходит для ненативных форм фактора VII, таких как варианты фактора VII, поскольку полипептиды внутри этой группы, как оказалось, имеют более высокую склонность к образованию димеров. Поэтому в одном из воплощений полипептид фактора VII, используемый в способе по настоящему изобретению, представляет собой человеческий фактор VIIa не дикого типа, т.е. вариант фактора VII.

Концентрацию фактора VIIa в композиции удобно выражать в мг/мл или в МЕ/мл, причем 1 мг обычно представляет 43000-56000 ME или более. Концентрация полипептида фактора VII в композиции обычно составляет по меньшей мере 0,01 мг/мл или по меньшей мере 0,1 мг/мл. В различных воплощениях полипептид фактора VII присутствует в композиции в концентрации 0,1-90 мг/мл; 0,5-80 мг/мл; 1,0-80 мг/мл; 1,5-70 мг/мл; 2-60 мг/мл; 3-50 мг/мл; или 5-50 мг/мл.

Композиция перед стадией (а) и особенно после применения любым способом стадии (а) может включать буферный агент (который следует понимать как единственный агент или комбинацию агентов), способный держать значение рН в пределах указанного диапазона, т.е. в интервале 4,5-10,0.

В одном воплощении буферным агентом является по меньшей мере один компонент, выбранный из групп веществ, состоящих из кислот и солей MES, PIPES, ACES, BES, TES, HEPES, TRIS, гистидина, имидазола, глицина, глицилглицина, глицинамида, фосфорной кислоты, уксусной кислоты (например, ацетата натрия или кальция), молочной кислоты, глутаровой кислоты, лимонной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты и янтарной кислоты. Следует понимать, что буферный агент может включать смесь двух или более компонентов, причем смесь способна обеспечивать значение рН в заданном интервале. В качестве примеров можно упомянуть уксусную кислоту и ацетат натрия и т.п.

Концентрацию буферного агента выбирают таким образом, чтобы поддерживать желаемое значение рН композиции. В различных воплощениях концентрация буферного агента составляет 1-100 мМ; 1-50 мМ; 1-25 мМ или 2-20 мМ.

Было отмечено, что полипептиды фактора VII склонны к аутоактивации и, следовательно, к деградации при повышении рН. С другой стороны, при понижении рН полипептиды фактора VII будут с большей вероятностью димеризоваться и агрегировать. Интервал рН композиции полипептида фактора VII выбирают таким образом, чтобы найти лучший компромисс в решении этих двух проблем, связанных с рН. Можно ожидать, что такие интервалы рН будут различными у разных полипептидов фактора VII, имеющих отличающиеся друг от друга химические и, следовательно, структурные характеристики. В одном воплощении данного изобретения рН композиции выдерживают в интервале 4,5-10; например в интервале 5-10; например в интервале 9-10. В другом воплощении изобретения рН композиции выдерживают в интервале 4,5-9,5; например в интервале 4,5-8,5; например в интервале 4,5-7,5; например в интервале 4,5-6,5; например в интервале 4,5-6,0; например в интервале 5,0-6,5; например в интервале 5,0-6,0; например в интервале от 5,2 до примерно 5,9.

Везде, где указаны значения рН, подразумевают значение, измеренное при 5°С.

Желательно, чтобы перед применением тепловой обработки (стадия (b)) композиция находилась при температуре не выше 10°С, в особенности не выше 5°С.

В предпочтительном воплощении композиция включает соль кальция или магния, например хлорид кальция или ацетат кальция. Ионы кальция связываются с полипептидом фактора VII и являются необходимыми для правильной сборки Gla-домена полипептида фактора VII, таким образом, чтобы полипептид фактора VII, особенно Gla-домен, стал защищенным от аутопротеолитической деградации. Предполагают, что ионы магния могут защищать полипептиды фактора VII таким же образом, как и ионы кальция.

Композиция может включать также дополнительные компоненты, например агенты, регулирующие тоничность, которые вносят вклад в осмолярность раствора. Такой агент, регулирующий тоничность, обычно включает по меньшей мере один агент, выбранный из группы веществ, состоящей из нейтральных солей, аминокислот, пептидов из 2-5 аминокислотных остатков, моносахаридов, дисахаридов и сахарных спиртов. В некоторых предпочтительных воплощениях композиция содержит два или более таких агентов в их комбинации. Под выражением «нейтральная соль» подразумевают соль, которая не является ни кислотой, ни основанием, будучи растворенной в водном растворе.

В одном воплощении по меньшей мере один агент, регулирующий тоничность, представляет собой нейтральную соль, выбранную из групп веществ, состоящих из солей натрия, солей калия, солей кальция и солей магния, например хлорида натрия, хлорида калия, хлорида кальция, ацетата кальция, глюконата кальция, левулината кальция, хлорида магния, ацетата магния, глюконата магния и левулината магния.

В одном предпочтительном воплощении агент, регулирующий тоничность, включает хлорид натрия в комбинации по меньшей мере с одним агентом, выбранным из группы веществ, состоящей из хлорида кальция, ацетата кальция, хлорида магния и ацетата магния.

В другом предпочтительном воплощении агент, регулирующий тоничность, представляет собой по меньшей мере один агент, выбранный из группы веществ, состоящей из хлорида натрия, хлорида кальция, сахарозы, глюкозы и маннита.

Как правило, агент, регулирующий тоничность, присутствует в концентрации, составляющей по меньшей мере 1 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 10 мМ, по меньшей мере 20 мМ, по меньшей мере 50 мМ, по меньшей мере 100 мМ, по меньшей мере 200 мМ, по меньшей мере 400 мМ, по меньшей мере 800 мМ, по меньшей мере 1000 мМ, по меньшей мере 1200 мМ, по меньшей мере 1500 мМ, по меньшей мере 1800 мМ, по меньшей мере 2000 мМ или по меньшей мере 2200 мМ.

В одной серии воплощений агент, регулирующий тоничность, присутствует в концентрации 5-2200 мМ, например 25-2200 мМ, 50-2200 мМ, 100-2200 мМ, 200-2200 мМ, 400-2200 мМ, 600-2200 мМ, 800-2200 мМ, 1000-2200 мМ, 1200-2200 мМ, 1400-2200 мМ, 1600-2200 мМ, 1800-2200 мМ или 2000-2200 мМ; 5-1800 мМ, 25-1800 мМ, 50-1800 мМ, 100-1800 мМ, 200-1800 мМ, 400-1800 мМ, 600-1800 мМ, 800-1800 мМ, 1000-1800 мМ, 1200-1800 мМ, 1400-1800 мМ, 1600-1800 мМ; 5-1500 мМ, 25-1400 мМ, 50-1500 мМ, 100-1500 мМ, 200-1500 мМ, 400-1500 мМ, 600-1500 мМ, 800-1500 мМ, 1000-1500 мМ, 1200-1500 мМ; 5-1200 мМ, 25-1200 мМ, 50-1200 мМ, 100-1200 мМ, 200-1200 мМ, 400-1200 мМ, 600-1200 мМ или 800-1200 мМ.

Часто композицию, включающую полипептид фактора VII, получают в ходе предшествующей стадии очистки. В особенно удачном воплощении стадии (а) предшествует анионообменная хроматография. Было отмечено, что димеры полипептида фактора VII образуются в высокой концентрации именно в течение этой стадии анионного обмена. В связи с этим особенно удобно помещать эту стадию перед стадиями доведения рН, нагревания и охлаждения по настоящему изобретению, которые в своей совокупности снижают число остающихся димеров.

Полипептид фактора VII

В данном тексте термин «полипептид фактора VII» или «полипептид FVII» обозначает любой белок, включающий последовательность аминокислот 1-406 человеческого фактора VII дикого типа (т.е. полипептида, имеющего последовательность аминокислот, раскрытую в Патенте США № 4784950), его вариантов, а также относящихся к фактору VII полипептидов, производных фактора VII и конъюгатов фактора VII. Сюда включены варианты фактора VII, производные фактора VII и конъюгаты фактора VII, проявляющие по существу аналогичную или улучшенную биологическую активность по отношению к человеческому фактору VIIa дикого типа.

Подразумевается, что термин «фактор VII» охватывает полипептиды фактора VII в их нерасщепленной форме (в форме зимогена), а также те, которые были подвергнуты протеолитическому расщеплению с получением их соответствующей биоактивной формы и которые можно обозначить как фактор VIIa. Обычно расщепление фактора VII происходит между остатками 152 и 153 с получением фактора VIIa, т.е. активированной формы фактора VII. Подобные варианты фактора VII могут проявлять иные свойства в сравнении со свойствами человеческого фактора VII, включая стабильность, связывание с фосфолипидами, измененную специфическую активность и т.п.

«Фактор VII» или «фактор VIIa» в рамках приведенного выше определения включает также природные аллельные вариации, которые могут существовать и встречаться у разных индивидуумов. Кроме того, степень и локализация гликозилирования или других посттрансляционных модификаций могут варьироваться в зависимости от выбранных клеток хозяина и природы окружающей среды клеток хозяина.

В данном тексте термин «человеческий FVIIa дикого типа» представляет полипептид, имеющий последовательность аминокислот, раскрытую в Патенте США № 4784950.

В данном тексте термин «полипептиды, относящиеся к фактору VII» охватывает полипептиды, включая варианты, в которых биологическая активность фактора VIIa была существенно изменена, например снижена, по отношению к активности фактора VIIa дикого типа. Эти полипептиды включают, не ограниваясь этим, фактор VII или фактор VIIa, в которых были произведены специфические изменения последовательности аминокислот, которые видоизменяют или подавляют биологическую активность полипептида.

В данном тексте под термином «производное фактора VII» подразумевают полипептид FVII, проявляющий по существу такую же или улучшенную биологическую активность, по отношению к фактору VII дикого типа, в котором одна (или более) аминокислота родительского пептида была генетически и/или химически и/или энзиматически модифицирована, например, путем алкилирования, гликозилирования, ПЭГилирования, ацилирования, образования сложного эфира или амида или подобным образом. Этот термин включает (но не ограничивается ими) ПЭГилированный человеческий фактор VIIa, цистеин-ПЭГилированный человеческий фактор VIIa или их варианты. Не ограничивающие собой примеры производных фактора VII включают: глико-ПЭГилированные производные фактора VII, раскрытые в WO 03/31464 и Заявках на патент США US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557, US 20040132640, WO 2007022512 и US 20070105755 (Neose Technologies, Inc.); конъюгаты FVII, раскрытые в WO 01/04287, Заявке на Патент США 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) и WO 02/02764, Заявке на Патент США US 20030211094 (Миннесотский Университет).

Термин «улучшенная биологическая активность» относится i) к полипептидам FVII, имеющим, по существу, такую же или повышенную протеолитическую активность по сравнению с рекомбинантным человеческим фактором VIIa дикого типа, или ii) к полипептидам FVII, имеющим, по существу, аналогичную или повышенную TF-связывающую активность по сравнению с рекомбинантным человеческим фактором VIIa дикого типа, или iii) к полипептидам FVII, имеющим, по существу, аналогичное или повышенное время жизни в плазме крови по сравнению с рекомбинантным человеческим фактором VIIa дикого типа.

Термин «ПЭГилированный человеческий фактор VIIa» означает человеческий фактор VIIa, содержащий молекулу ПЭГ, конъюгированную с полипептидом человеческого фактора VIIa. Следует понимать, что молекула ПЭГ может быть присоединена к любой части полипептида фактора VIIA, включая любой аминокислотный остаток или любую углеводную часть полипептида фактора VIIa.

Термин «цистеин-ПЭГилированный человеческий фактор VIIa» означает фактор VIIA, содержащий молекулу ПЭГ, конъюгированную с сульфгидрильной группой цистеина, введенную в человеческий фактор VIIa.

В данном тексте термин «вариант фактора VII» означает полипептид FVIIa, проявляющий по существу такую же или лучшую биоактивность по сравнению с фактором VII дикого типа, или, наоборот, проявляющий существенно измененную или сниженную биоактивность по отношению к фактору VII дикого типа, причем эти полипептиды имеют аминокислотную последовательность, отличие которой от последовательности фактора VII дикого типа заключается в инсерции, делеции или замене одной или более аминокислот.

Не ограничивающие собою примеры вариантов Фактора VII, имеющих по существу идентичную или повышенную протеолитическую активность по сравнению с рекомбинантным человеческим фактором VIIa дикого типа, включают: S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); варианты FVIIa, проявляющие повышенную протеолитическую устойчивость, раскрытые в Патенте США № 5580560; фактор VIIa, который был протеолитически расщеплен между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); окисленные формы фактора VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); варианты FVII, раскрытые в PCT/DK02/00189 (что соответствует WO 02/077218); а также варианты FVII, проявляющие повышенную протеолитическую устойчивость, раскрытые в WO 02/38162 (Скриппсовский Исследовательский Институт); варианты FVII, имеющие модифицированный Gla-домен и проявляющие повышенную способность к связыванию с мембраной, раскрытые в WO 99/20767, Патентах США US 6017882 и US 6747003, Заявке на Патент США US 20030100506 (Миннесотский Университет) и WO 00/66753, Заявке на Патент США US 20010018414, US 2004220106 и US 200131005, Патентах США US 6762286 и US 6693075 (Миннесотский Университет); и варианты FVII, раскрытые в WO 01/58935, Патенте США US 6806063, Заявке на патент США US 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS), WO 04/029091 (Maxygen ApS), WO 04/083361 (Maxygen ApS) и WO 04/111242 (Maxygen ApS), а также в WO 04/108763 (Канадская Служба Крови, Canadian Blood Services).

He ограничивающие собой примеры вариантов FVII, имеющих повышенную биологическую активность по сравнению с FVIIa дикого типа, включают варианты FVII, раскрытые в WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/027147, WO 04/029090, WO 05/075635 и заявке на Европейский патент с номером заявки 05108713.8 (Novo Nordisk A/S), WO 02/38162 (Скриппсовский Исследовательский Институт); а также варианты FVIIa с повышенной активностью, раскрытые в JP 2001061479 (Хемо-Серо-Терапевтический исследовательский институт, Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst).

делеции в аминокислотной последовательности от 233Thr до 240Asn; FVII имеющий замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от 304Arg до 329Cys; и FVII имеющий замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от 153Ile до 223Arg.

Таким образом, варианты с заменой в полипептиде фактора VII включают, не ограничиваясь этим, замены в положениях Р10, К32, L305, М306, D309, V158, Е296, К337, М298, S336, S314, К316, F374, S52, S60, R152, S344, Т106, К143, N145, V253, R290, А292, G291, R315, V317, а также замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от Т233 до N240, или от R304 до С329, или от I153 до R223, или же их комбинацию, особенно такие варианты, как P10Q, К32Е, L305V, M306D, D309S, L305I, L305T, F374P, V158T, M298Q, V158D, E296V, К337А, M298Q, М298К, S336G, S314E, К316Н, K316Q, F374Y, S52A, S60A, R152E, S344A, T106N, K143N, N145T, V253N, R290N, А292Т, G291N, R315N, V317T, а также замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от Т233 до N240, или от R304 до С329, или от I153 до R223, или их комбинацию.

Биологическая активность фактора VIIa в процессе свертывания крови происходит из его способности (i) связываться с тканевым фактором (TF) и (ii) катализировать протеолитическое расщепление фактора IX или фактора Х с образованием активированного фактора IX или Х (фактор IXa или Ха соответственно).

Для целей данного изобретения биологическую активность полипептидов фактора VII можно количественно определить путем измерения способности образца активировать свертывание крови (см. для сравнения описанный здесь Опыт 4). В этом опыте биологическая активность выражается как сокращение времени свертывания по отношению к контрольному образцу и сводится к «единицам фактора VII» путем сравнения со стандартным пулом человеческой сыворотки, содержащим 1 ед./мл активности фактора VII. Как вариант, биологическую активность можно количественно определить с помощью (i) измерения способности полипептида, родственного фактору VIIa или фактору VII, продуцировать активированный фактор Х (Фактор Ха) в системе, включающей TF, иммобилизованный на липидной мембране, и фактор Х (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) измерения гидролиза фактора X в водной системе («Анализ In Vitro протеолиза», см. ниже Опыт 2); (iii) измерения физического связывания полипептида, родственного фактору VIIa или VII, с помощью аппаратуры, основанной на поверхностном плазмон-резонансе (surface plasmon resonance) (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); (iv) измерения гидролиза синтетического субстрата под действием полипептида, родственного фактору VIIa и/или VII («Анализ In Vitro гидролиза», см. ниже Опыт 1); или (v) измерения генерации тромбина в TF-независимой in vitro системе (см. ниже Опыт 3).

Варианты фактора VII, имеющие по существу аналогичную биологическую активность по отношению к фактору VIIa дикого типа, включают такие, которые проявляют по меньшей мере около 25%, желательно по меньшей мере около 50%, более предпочтительно по меньшей мере около 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 90% специфической активности фактора VIIa, который был продуцирован в клетках того же типа, при ее тестировании одним или более способом: с помощью анализа коагулирующей активности (Опыт 4), анализа протеолиза (Опыт 2) или анализа связывания TF, как описано выше. Вариантами фактора VII, имеющими существенно сниженную биологическую активность по отношению к фактору VIIa дикого типа, являются такие, которые проявляют менее чем примерно 25%, желательно менее чем примерно 10%, предпочтительнее менее чем примерно 5% и наиболее предпочтительно менее чем примерно 1% специфической активности фактора VIIa дикого типа, который был продуцирован в клетках того же типа, при ее тестировании одним или более способом: с помощью анализа коагулирующей активности (Опыт 4), анализа протеолиза (Опыт 2) или анализа связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, имеющие существенно измененную биологическую активность по отношению к фактору VIIa дикого типа, включают, без ограничения, варианты фактора VII, которые проявляют независимую от TF протеолитическую активность, направленную на фактор X, а также такие, которые связывают TF, но не расщепляют фактор X.

Стадия (а) - Доведение рН

На первой стадии (а), не являющейся обязательной, рН композиции при необходимости доводят до значения в интервале 4,5-10. Как упоминалось выше, обычно этого достигают путем добавления одного или более буферных агентов. Композиции, которые уже имеют рН в пределах указанного интервала, разумеется, не требуют доведения в отношении рН, но может оказаться желательным довести рН, например, с учетом какой-либо из последующих стадий активации и приготовления лекарственной формы.

Стадия доведения рН композиции может также включать разбавление или концентрирование (например, выпаривание растворителя) композиции.

Композицию желательно держать при температуре не более 10°С, предпочтительно не более 5°С, предпочтительнее близкой к 0°С, в ходе стадии (а).

Стадия (b) - Тепловая обработка

Тепловая обработка является ключевой стадией способа снижения содержания димеров в композиции.

Было обнаружено, что температура нагревания должна быть по меньшей мере 20°С, для того чтобы снижение содержания димеров происходило по меньшей мере в пределах разумных временных рамок, например в пределах 72 часов. С другой стороны, полагают, что температура нагревания свыше 50°С вызовет риск денатурации (и, следовательно, дезактивации) полипептида фактора VII.

Нагревание до желаемой температуры может быть осуществлено путем помещения контейнера, содержащего композицию, в термостатируемую баню, например на масляную или водяную баню, или в термостат. Период времени, который требуется для достижения желаемой температуры, будет среди прочего зависеть от коэффициента теплопередачи контейнера по отношению к окружающей среде. Часто бывает желательным, чтобы желаемая температура была достигнута максимально быстро или по меньшей мере чтобы температура 20°С или температура примерно на 5°С ниже заданной была достигнута максимально быстро.

В альтернативных воплощениях тепловую обработку проводят периодическим или непрерывным образом в проточном реакторе, где время прохождения потока соответствует желаемому периоду времени для тепловой обработки. Число вариантов практических воплощений очевидно для квалифицированного специалиста в данной области.

Желаемая температура и необходимый период времени для тепловой обработки могут быть определены, например, в модельном примере, таком как описанный здесь Пример 2. Минимальный требуемый период времени для тепловой обработки составляет обычно около 5 минут, например 10 минут, тогда как максимальный период времени может в принципе достигать нескольких или многих дней, например 168 часов. С практической точки зрения предпочтительным периодом времени для обработки является период от 10 мин до 72 часов.

Полагают, что длительная тепловая обработка может вызвать образование димеров другого типа, чем тот тип, содержание которого снижают тепловой обработкой. Эта гипотеза подтверждается наблюдениями в Примере 2, где тепловая обработка при 37°С в течение более чем 10 часов фактически приводит к значительному (повторному) образованию димеров.

Учитывая вышесказанное, предпочтительный период времени для тепловой обработки при 30-45°С составляет обычно 10-600 минут. Предпочтительный период времени для тепловой обработки при 20-30°С составляет обычно 5-72 часов, а предпочтительный период времени для тепловой обработки при 35-50°С составляет обычно 10-300 минут. В наиболее предпочтительном на данный момент воплощении тепловую обработку проводят при температуре около 37°С в течение 10-120 минут.

Следует понимать, что оптимизация способа по изобретению может привести к тепловой обработке, не обязательно включающей постоянную температуру, а наоборот, может оказаться более выгодным использовать постепенное или скачкообразное увеличение температуры и/или постепенное или скачкообразное понижение температуры в пределах всего интервала температурного диапазона 20-50°С.

Целью тепловой обработки является снижение содержания димеров в композиции, включающей полипептид фактора VII. В особенности, следует ожидать значительного снижения, для того чтобы обосновать дополнительные стадии в общем процессе производства. Поэтому желательно, чтобы уровень димеров (определяемый методом HMWP GPC, описанным здесь) в указанной композиции, выраженный в процентах по отношению к общему пулу полипептида фактора VII, был снижен по меньшей мере с коэффициентом 1,2, например по меньшей мере с коэффициентом 1,5, особенно по меньшей мере с коэффициентом 2 или даже по меньшей мере с коэффициентом 3.

Предусматривают, что содержание димеров может быть снижено до уровня ниже 5%, особенно до уровня ниже 4% и предпочтительнее до уровня ниже 3%, или даже до уровня 2%, или даже предпочтительнее до уровня 1,5%.

Стадия (с) - Охлаждение

Композицию далее охлаждают до температуры не выше 10°С, например не выше 5°С. Предпочтительно проводить охлаждение довольно быстро, например путем охлаждения на ледяной бане (около 0°С) или добавлением льда к композиции. В другом варианте и, как сказано выше, охлаждение можно проводить в проточном реакторе. С помощью быстрого охлаждения можно избежать длительного существования условий, при которых могут повторно образовываться димеры (например, при температуре 5-15°С).

После охлаждения композицию можно подвергать дальнейшим стадиям обработки. Принимают во внимание, что такие стадии обработки желательно не должны вызывать существенного повторного образования димеров. Учитывая вышесказанное, в предпочтительном воплощении проводят активацию полипептида фактора VII на стадии, следующей за стадией (b), т.е. полипептид фактора VII активируют или до, или после охлаждения композиции. Предпочтительно активировать полипептид фактора VII на стадии, следующей за тепловой обработкой, поскольку может оказаться трудным контролировать активацию во время нагревания.

Предпочтительное воплощение

В одном из особенно предпочтительных воплощений изобретение относится к способу снижения содержания димеров в композиции, содержащей вариант фактора VII, который включает следующие стадии:

(a) при необходимости, доведение рН указанной композиции до значения в пределах 5,0-6,5;

(b) нагревание композиции до температуры в интервале 30-45°С в течение периода в пределах 20-600 минут; и

(c) последующее охлаждение композиции до температуры не выше 5°С.

Предпочтительное воплощение

Во втором особенно предпочтительном воплощении изобретение относится к способу снижения содержания димеров в композиции, содержащей вариант фактора VII, который включает следующие стадии:

(a) при необходимости, доведение рН указанной композиции до значения в интервале 9,0-10,0;

(b) нагревание композиции до температуры в интервале 30-45°С в течение периода в интервале 20-600 минут; и

(c) последующее охлаждение композиции до температуры не выше 5°С.

Приготовление и очистка полипептидов фактора VII

Очищенный полипептид человеческого фактора VIIa, который подходит для обработки способом по настоящему изобретению, предпочтительно получают с помощью технологии рекомбинантной ДНК, например, как описано в литературе (Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986) или как описано в Европейском Патенте № 0200421 (ZymoGenetics, Inc.).

Фактор VII может быть также получен способами, описанными в литературе (Broze and Majerus, J.Biol. Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980; Hedner and Kisiel, J.CIin.Invest. 71: 1836-1841, 1983). Эти способы дают на выходе фактор VII, не содержащий детектируемого количества других факторов свертывания крови. Еще более высокоочищенный препарат фактора VII может быть получен путем включения дополнительной фильтрации в геле в качестве конечной стадии очистки. Фактор VII далее переводят в активированный фактор Vila известными способами, например с помощью нескольких различных плазменных белков, таких как фактор XIIa, IXa или Ха. В другом варианте, как описано в литературе (Bjoern et al., Research Disclosure, 269 September 1986, p.564-565), фактор VII может быть активирован путем его пропускания через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) или ей подобную, или путем аутоактивации в растворе. Стадии способа по изобретению предпочтительно применяют непосредственно перед активацией полипептида фактора VII.

Пептиды, относящиеся к фактору VII, могут быть получены путем модификации фактора VII дикого типа или с помощью рекомбинантной технологии. Пептиды, относящиеся к фактору VII, с измененной аминокислотной последовательностью по сравнению с фактором VII дикого типа, могут быть получены путем модификации последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей фактор VII дикого типа, а также путем замены аминокислотных кодонов или удаления нескольких аминокислотных кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фактор VII дикого типа, известными способами, например с помощью сайт-специфичного мутагенза.

Для специалистов в данной области очевидно, что можно сделать замены за пределами регионов, критичных для функциональности молекулы фактора VIIa, и при этом все же будет получен активный полипептид. Аминокислотные остатки, которые имеют значение для активности полипептида фактора VII и которые в связи с этим предпочтительно не должны быть заменены, могут быть идентифицированы способами, известными в данной области, такими как направленный мутагенез или сканирующий аланином мутагенез (см., например: Cunningham and Wells, 1989, Science 244:1081-1085). В последнем способе мутации вводятся на каждом положительно заряженном остатке молекулы и получаемые мутантные молекулы тестируют на предмет коагулирующей и, соответственно, перекрестно-сшивающей активности для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критичными для активности молекулы. Сайты взаимодействия «субстрат-энзим» также могут быть определены с помощью анализа трехмерной структуры, определяемой с помощью таких способов, как анализ методом ядерно-магнитного резонанса, кристаллография или фотоаффинное мечение (см. например, de Vos et al., 1992, Science 255:306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224:899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309:59-64).

Введение в последовательность нуклеиновой кислоты мутации, состоящей в замене одного нуклеотида другим нуклеотидом, может быть достигнуто посредством направленного мутагенеза с применением любого способа, известного в данной области. Особенно подходящим является способ, где применяют вектор суперспиральной двухцепочечной ДНК, включающий интересующую вставку, и два синтетических праймера, содержащих нужную мутацию. При циклическом колебании температуры, под действием Pfu ДНК-полимеразы, происходит элонгация олигонуклеотидных праймеров, каждый из которых комплементарен противоположным цепям вектора. При инкорпорации праймеров генерируется мутированная плазмида, содержащая ступенчатые одноцепочечные разрывы (staggered nicks). По завершении циклического колебания температуры продукт обрабатывают [рестриктазой] Dpnl, которая специфична к метилированной и полуметилированной ДНК, для расщепления родительской ДНК-матрицы и выделения синтезированной ДНК, содержащей мутацию. Можно применять и другие известные в данной области способы для создания, идентификации и выделения вариантов, например такие, как перетасовка генов (gene shuffling) или фаговое отображение (phage display).

Отделение полипептидов от клеток, в которых они синтезируются, можно проводить любым способом, известным в данной области, включая, не ограничиваясь этим: снятие культуральной среды, содержащей нужный продукт, с адгезированной культуры клеток; центрифугирование или фильтрация с целью удаления неадгезированных клеток; и т.п.

Полипептиды фактора VII могут быть по желанию подвергнуты дальнейшей очистке. Очистку можно проводить любым способом, известным в данной области, включая, не ограничиваясь этим: аффинную хроматографию, например, на колонке с антителами к фактору VII (см., например: Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; а также: Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988); хроматографию гидрофобных взаимодействий; ионообменную хроматографию; эксклюзионную хроматографию; электрофоретические методы (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование (IEF)); дифференциальное осаждение (например, осаждение с помощью сульфата аммония) или экстракцию и т.п. В общем случае см. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; a также Protein Purification, J.C.Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989. После очистки препарат желательно должен содержать менее 10% по весу, предпочтительнее менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% полипептидов, не являющихся Фактором VII, происходящих из клеток хозяина.

Полипептиды фактора VII могут быть активированы путем протеолитического расщепления с помощью фактора XIIa или других протеаз, имеющих трипсиноподобную специфичность, таких как, например, Фактор IXa, калликреин, Фактор Ха и тромбин. (См., например: Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, Патент США № 4456591; а также Hedner et al., J.Clin. Invest. 71:1836 (1983). Как вариант, полипептиды фактора VII могут быть активированы путем их пропускания через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q® (Pharmacia) или ей подобную, или путем аутоактивации в растворе. Стадии способа по изобретению предпочтительно осуществляют, как было указано выше, непосредственно перед активацией полипептидов фактора VII.

Получаемый на выходе активированный фактор VII можно далее использовать для приготовления лекарственной формы и вводить согласно имеющимся описаниям в данной области.

Следующие примеры иллюстрируют практическое осуществление изобретения. Эти примеры включены исключительно с целью наглядного представления, и при этом не подразумевается, что они каким-либо образом ограничивают заявляемое изобретение.

ПРИМЕРЫ

Методы

Определение содержания димеров - метод HMWP GPC

Для анализа образцов FVIIa в условиях отсутствия диссоциации применяли SE-HPLC,

метод эксклюзионной хроматографии. Содержание высокомолекулярных белков (HMWP, high molecular weight proteins), т.е. агрегатов FVIIa в форме димеров, олигомеров и полимеров, определяли исходя из процентной доли площади относительно пика целевого мономерного продукта.

Была использована колонка Waters Protein Pak 300 SW (7,5×300 мм, что соответствует объему колонки (CV) 13,25 мл) или колонка с такими же характеристиками. Общие условия анализа были следующими.

Температура: комнатная (RT, 21-25°С); детектирование: УФ-детектирование на выходе с колонки при 215 нм; скорость потока: 0,5 мл/мин, что соответствует 2,25 CV/час.

Аналитический прогон осуществляли с помощью подвижного буфера, имеющего следующий состав: 0,2 М сульфат аммония, 5% изопропиловый спирт, значение рН доведено до 7,0.

После уравновешивания колонки и пропускания 0,5 CV подвижного буфера размораживали образцы FVIIa, содержащие примерно 1 мг FVIIa/мл, и анализировали их в концентрированном виде путем введения образца объемом 25 мкл (что соответствует объему образца 0,2% по отношению к объему колонки).

Образец отслеживали в ходе элюирования объемом 1,5 CV.

Типичная хроматограмма состоит из двух мажорных пиков и двух минорных пиков, что отображено на Фиг.3. Как показано в левой части, наблюдаются два минорных пика, представляющие собой HMWP (пики полимеров и димеров/олигомеров). Первый мажорный пик соответствует мономеру FVIIa, a второй мажорный пик соответствует пику его соли.

Пример 1 - Тепловая обработка варианта Фактора VIIa при 37°С

Раствор, содержащий 1,5 мг/мл варианта FVIIa в 15 мМ CaCl ₂, 30 мМ NaCl, 10 мМ гистидине, рН 6,0 (при 5°С), фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 микрон в бутылку из HDPE на 700 мл. Доводили рН до 5,8 (при 5°С) с помощью 1М HCl или 1М NaOH. Бутылку помещали на водяную баню с температурой 37°С. Повышение температуры в бутылке HDPE до 37°С занимало приблизительно 20 минут. Через 45 минут после того, как раствор достиг 37°С, реакцию останавливали помещением бутылки на лед.

Исходное содержание димера было определено как 7,3% с помощью GPC и было снижено до 2,8% после тепловой обработки. Таким образом, тепловая обработка при 37°С в течение 45 минут представляется достаточной для того, чтобы снизить содержание димеров более чем в 2 раза.

Протекание снижения содержания димеров в таком же эксперименте, проводившемся суммарно в течение 120 минут, представлено на Фиг.1. Ход эксперимента отслеживали, осуществляя частый отбор проб, быструю заморозку образцов до -80°С и последующий анализ (см. далее).

Сравнительный Пример 1 - выдерживание варианта Фактора VIIa при 5-8°С

Раствор, содержащий 1,5 мг/мл варианта FVIIa в 15 мМ CaCl₂, 30 мМ NaCl, 10 мМ гистидине, рН 6,0 (при 5°С) фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 микрон в бутылку из HDPE на 700 мл. Доводили рН до 5,8 (при 5°С) с помощью 1М HCl или 1М NaOH. Бутылку помещали на водяную баню с температурой 5-8°С. Через 60 минут реакцию останавливали помещением бутылки на лед.

Исходное содержание димеров составляло 7,7%; после обработки оно составило 7,9%.

Пример 2 - длительная тепловая обработка варианта Фактора VIIa при 23°С и 37°С

Эксперимент по тепловой обработке при 37°С, в основном, как описано в Примере 1 (рН 5,7), проводили суммарно в течение 48 часов и аналогичный эксперимент при 23°С проводили суммарно в течение 48 часов. Ход обоих экспериментов отслеживали путем частого забора проб, быстрой заморозки образцов до -80°С и последующего анализа (см. ниже). Протекание снижения содержания димеров, где используются две разные температуры, отображено на Фиг.2. При 37°С наблюдалось быстрое падение содержания димеров, в то время как снижение содержания димеров в образце при 23°С было более медленным, и содержание димеров, возможно, не достигало своего минимума через 48 часов. Эксперименты такого типа могут быть применены для определения оптимальных условий (период времени, достаточный для тепловой обработки) для других полипептидов Фактора VII и для других выбранных температур.

Для сравнения, образец (такой же, как в Сравнительном примере 1; рН 5,7) оставляли суммарно на 48 часов при 5-8°С. В этом случае наблюдалось небольшое возрастание содержания димеров (см. Фиг.2, верхняя кривая).

Пример 3 - длительная тепловая обработка варианта Фактора VIIa при рН 9,5

Эксперимент по тепловой обработке проводили, в основном, как описано в Примере 1, в общей сложности в течение 168 часов; но значение, до которого доводили рН в начале, было увеличено с рН 5,8 до рН 9,5. Ход эксперимента отслеживали путем частого забора проб, быстрой заморозки образцов до -80°С и последующего анализа. Протекание снижения содержания димеров при повышенном рН представлено на Фиг.4. При рН 9,5 наблюдалось аналогичное быстрое падение содержания димеров с последующим медленным образованием димеров.