мутантный пестивирус с мутациями в гене core и области ns3 и вакцина на его основе

Формула изобретения

1. Мутантный пестивирус для получения вакцины для защиты млекопитающих от инфекции, вызванной пестивирусом, отличающийся тем, что вирус имеет мутацию в гене, кодирующем белок Core, приводящую к тому, что вирус не может экспрессировать функциональный белок Core, вирус, дополнительно отличающийся тем, что содержит одну или более мутаций в аминокислотах 2160-2260 С-концевого домена хеликазного домена NS3 указанного пестивируса, если указанный пестивирус является CSFV (Classical Swine Fever Virus), или аминокислотах 2169-2269 С-концевого домена хеликазного домена NS3 указанного пестивируса, если указанный пестивирус является BVDV (Bovine Viral Diarrhea virus), что компенсирует отсутствие функционального белка Core у пестивируса.

2. Мутантный пестивирус по п.1, отличающийся тем, что пестивирус является вирусом классической чумы свиней (CSFV).

3. Мутантный CSFV по п.2, отличающийся тем, что мутация в С-концевом домене хеликазного домена NS3 выбрана из группы, состоящей из Asn₂₁₇₇Tyr, Glu₂₁₆₀ Gly, Pro₂₁₈₅Thr/Ala, Gln₁₈₉Lys, Pro ₂₂₀₀Thr и Asn₂₂₅₆Asp.

4. Мутантный CSFV по п.2 или 3, отличающийся тем, что мутация в С-концевом домене хеликазного домена NS3 содержит мутацию Asn₂₁₇₇Tyr.

5. Мутантный пестивирус по п.1, отличающийся тем, что пестивирус является вирусом бычьей вирусной диареи (BVDV).

6. Мутантный BVDV по п.5, отличающийся тем, что мутация в С-концевом домене хеликазного домена NS3 выбрана из группы, состоящей из Glu ₂₁₈₉Lys, Leu₂₁₉₀Pro, Thr₂₁₉₁Ala, Asp₂₁₉₄Glu, Pro₂₁₉₄Leu, Tyr₂₂₀₄ His, Asn₂₂₆₅Tyr, Asn₂₂₆₅Asp.

7. Мутантный BVDV по п.5 или 6, отличающийся тем, что мутация в С-концевом домене хеликазного домена NS3 содержит мутации Asp₂₁₉₂ Glu, Tyr₂₂₀₄His, Asn₂₂₆₅Tyr или Asn ₂₂₆₅Asp.

8. Вакцина для защиты млекопитающего от инфекции, вызванной пестивирусом, отличающаяся тем, что содержит мутантный пестивирус по любому из предшествующих пунктов и фармацевтически приемлемый носитель.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к мутантным пестивирусам и вакцинам, содержащим указанные вирусы.

Пестивирусы вызывают экономически важные заболевания у животных по всему миру. Род Pestivirus, в семействе Flaviviridae, включает по меньшей мере три вида: вирус бычьей вирусной диареи (bovine viral diarrhea virus, BVDV), вирус классической чумы свиней (classical swine fever virus (CSFV)) и вирус пограничной болезни овец (ovine border disease virus (BDV)). Было описано наличие четвертой отдельной группы пестивирусов, включающей изоляты из крупного рогатого скота и овец, и в настоящее время общепринято ссылаться на эти дополнительные виды как BVDV-2; соответственно, классические штаммы BVDV именуются BVDV-1.

CSFV вызывает у свиней классическую чуму свиней. Классическая чума свиней является чрезвычайно контагиозным и иногда смертельным заболеванием свиней и может вызывать значительные экономические потери.

Животные могут быть защищены от CSFV путем вакцинации, однако традиционные инактивированные или модифицированные живые вакцины имеют недостатки, касающиеся как безопасности, так и эффективности. Таким образом, должны быть разработаны новые, улучшенные типы вакцин.

Вирус бычьей вирусной диареи (BVDV) является причиной врожденного и энтерального заболевания с широким спектром клинических проявлений. Болезнь впервые была описана как передающаяся болезнь рогатого скота с высокой заболеваемостью и низкой смертностью. Пораженный болезнью рогатый скот имел повышенную температуру, диарею и кашель. Это состояние назвали бычьей вирусной диареей. Сегодня BVDV, как полагают, является главным болезнетворным микроорганизмом рогатого скота со всемирным экономическим воздействием. Клинический паттерн инфекции BVDV в пределах стада и, следовательно, его воздействия на производство зависит от взаимодействия нескольких факторов, включая штамм вируса, возраст рогатого скота, иммунитета в стаде, и взаимодействия факторов, вызывающих стресс. BVDV-1 и BVDV-2 оба вызывают острые инфекции у рогатого скота (диарея, лихорадка, геморрагический синдром), так же как и (если инфицирование происходит во время беременности) аборт, порок развития зародыша и хроническую инфекцию телят.

Геном пестивирусов состоит из одноцепочечной (+)РНК и содержит единственную большую открытую рамку считывания (ORF), фланкированную 5'-нетранслируемой областью и 3'-нетранслируемой областью. ORF кодирует большой полипротеин-предшественник, который приводит к образованию 11-12 продуктов расщепления. ORF процессируется в различные вирусные белки как клеточными, так и вирусными протеазами. Вирусные белки в ORF размещены в следующем порядке: NH₂-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. Вирионы пестивируса состоят из четырех структурных белков, маленького положительно заряженного Core (C) белка (Core (C) protein), который предназначен для формирования структуры нуклеокапсида вместе с геномной РНК, и трех гликозилированных белков оболочки (Erns, E1, E2). Нейтрализующая активность была главным образом продемонстрирована для Е2-специфических антител.

Были исследованы минимальные требования для репликации пестивирусов, например, путем создания дефектных геномов пестивируса, не содержащих генные последовательности для структурных белков. Было обнаружено, что дефектные CSFV геномы все еще реплицируются и могут быть упакованы в вирусные частицы при внесении в клетки SK-6 вместе с РНК A187-CAT хелпера (Moser et al., J.Virol., 7787-7794, 1999). Был описан автономно реплицирующийся, но дефектный BVDV геном, который не содержит гены, кодирующие C, Erns, E1, E2, p7 и NS2 (Behrens et al., J.Virol., 72, 2364-2372, 1998). Транс-комплементарные С и Е1 делеционные мутанты другого пестивируса, BVDV, были описаны Beer et al., в WO 04/016794.

Для CSFV были открыты мутанты, которые демонстрируют ослабленную вирусную вирулентность. Например, Risatti et al., Virology 364, 371-382, 2007, описывает CSFV мутантов с заменой в области Е2, которые демонстрируют ослабленный фенотип. Maurer et al., Vaccine, 23(25), 3318-28, 2005, также описывает CSFV Е2 мутантов, не содержащих весь ген Е2 или его часть, которые демонстрируют частичную защиту от летального инфицирования высоковирулентным CSFV. Meyers et al., Journal of Virology, 73(12), 10224-10235, 1999, описывает CSFV мутантов с мутациями в гене, кодирующем белок Erns, которые приводят к мутациям. Транс-комплементированные Erns делеционные мутанты CSFV были описаны в Wildjojoatmodjo et al., J. Virol., 74(7), 2973-80, 2000.

Настоящее изобретение предоставляет мутантные пестивирусы, которые имеют делецию в гене, кодирующем белок Core, где вирус дополнительно характеризуется тем, что содержит одну или более мутаций в С-концевом домене хеликазного домена NS3.

Предпочтительно мутантный пестивирус по настоящему изобретению является вирусом классической чумы свиней (Classical Swine Fever virus, CSFV) или вирусом бычьей вирусной диареи (Bovine Viral Diarrhea virus, BVDV).

Мутации в генной области, кодирующей белок Core должны быть такими, чтобы приводить к невозможности экспрессировать функциональный белок Core. Это может быть достигнуто путем удаления гена, кодирующего белок Core, целиком или частично. Сигнальная последовательность С-конца белка Core является необходимой для дальнейшего процессинга полипротеина ниже. Таким образом, удаление гена Core (части его) должно быть проведено таким образом, чтобы транслокационные сигнальные последовательности для Erns остались сохранены.

Транслокационная последовательность является последовательностью 18 аминокислот, расположенной между аминокислотами 250 и 267, предшествующей сайту расщепления перед N-концом белка Erns CSFV (Ala-267/Glu-268). (Rümenapf et al., J. Virol., 65(2), 589-597, 1991; Rümenapf et al., J. Virol., 67(6), 3288-3294, 1993). Для BVDV сайт расщепления перед N-концом белка является Gly-270/Glu-271.

Точная длина последовательностей, необходимых для последовательного процессинга, может изменяться в зависимости от штамма или типа клеток. Например, для CSFV последовательность, кодирующая Core, может быть удалена от аминокислоты 169-248 (p619), таким образом соединяя С-конец Npro с С-концевыми аминокислотами белка Core, которые содержат транслокационный сигнал для Erns (CPLWVTSC ₁₆₈/LEKALLAWAVITILLYQPVAA₂₆₇/ENIT).

Для BVDV последовательность, кодирующая Core, может быть удалена от аминокислоты 169-251, таким образом соединяя С-конец Npro с С-концевыми аминокислотами белка Core, которые содержат транслокационный сигнал для BVDV Erns (CPLWVSSC₁₆₈/LEKALLAWAIIALVFFQVTMG ₂₇₀/ENIT).

Делеция большей части гена Core делает возможной репликацию РНК после трансфекции, но не продукцию инфекционного вирусного потомства.

Настоящим изобретением было найдено, что отсутствие гена, кодирующего функциональный белок Core, может быть компенсировано мутациями в области NS3 вирусного генома.

Введение этих мутаций в кДНК копию пестивирусов, в которых был удален ген Core (как описано выше), делает возможным высвобождение инфекционных вирусов.

Мутации в NS3 области кластеризуются в С-концевом домене хеликазного домена NS3, более точно, на протяжении 100 аминокислот в С-концевом домене.

Для CSFV были определены семь независимых мутаций С-концевого домена хеликазного домена NS3 области (аминокислоты 2160-2260). Предпочтительные мутантные CSF вирусы по изобретению имеют одну или более мутаций в С-концевом домене хеликазного домена NS3, выбранные из группы, состоящей из Asn₂₁₇₇Tyr, Glu₂₁₆₀Gly, Pro ₂₁₈₅Thr/Ala, Gln₂₁₈₉Lys, Pro₂₂₀₀Thr и Asn₂₂₅₆Asp.

Введение мутации Asn ₂₁₇₇Tyr в CSFV Core (p619) и электропорация с кРНК приводит к неожиданному высвобождению жизнеспособных инфекционных вирусных частиц. На Нозерн, блот анализе геномная РНК видна, как немного уменьшенная в размере, и концентрированные вирусные частицы не содержат белка Core. Вирусные титры достигают 5×10⁵ ffu/мл в SK6 клетках и, таким образом, являются ниже примерно в 10 раз, чем титры p447 wt.

Далее другие мутации Glu ₂₁₆₀Gly, Pro₂₁₈₅Ala, Gln₂₁₈₉Lys, Pro₂₂₀₀Thr и Asn₂₂₅₆Asp были введены в CSFV Core (p619), что привело к получению p1033 (Ala₂₁₈₅ ), p1034 (Thr₂₂₀₀), p1035 (Lys₂₁₈₉), p1036 (Asp₂₂₅₆), p1037 (Gly₂₁₆₀) и p1038 (Asp ₂₂₅₆). Во всех случаях вирус был восстановлен после электропорации с соответственными SP6 транскриптами, но его жизнеспособность значительно отличалась (анализ кривой роста). Наиболее жизнеспособным был геном, содержащий замену Asn₂₁₇₇Tyr.

Так, наиболее предпочтительным является мутантный CSFV по изобретению, где мутация в С-концевом домене хеликазного домена NS3 содержит мутацию Asn₂₁₇₇Tyr.

Для исследования, имеют ли эти мутации аддитивный эффект, были получены более сильные компенсирующие мутанты. Для двойных мутаций Asn₂₁₇₇ Tyr был комбинирован с Glu₂₁₆₀Gly, Pro₂₁₈₅ Ala, Gln₂₁₈₉Lys, Pro₂₂₀₀Thr и Asn₂₂₅₆ Asp. Тройные мутации содержали Asn₂₁₇₇Tyr вместе с Pro₂₁₈₅Ala и Pro₂₂₀₀Thr, Pro₂₁₈₅ Ala и Gln₂₁₈₉Lys, Gln₂₁₈₉Lys и Pro ₂₂₀₀Thr и Glu₂₁₆₀Gly и Gln₂₁₈₉Lys. Для всех тестированных комбинаций была показана пониженная жизнеспособность по сравнению с единичными мутациями, указывающая на то, что добавление разрешающих мутаций улучшает NS3 в компенсировании Core.

Тогда как никаких физических или фенотипических отличий от родительского CSFV wt не было заметно, в природном хозяине CSFV Core был сильно ослаблен. Мутантные вирусы по изобретению являются, таким образом, подходящими для использования в вакцинах для защиты свиней против инфицирования CSFV.

Для BVDV были определены восемь независимых мутаций в С-концевом домене хеликазного домена NS3 области (аминокислоты 2169-2269).

Предпочтительные мутантные BVD вирусы по изобретению имеют одну или более мутаций в С-концевом домене хеликазного домена NS3, выбранные из группы, состоящей из Glu₂₁₈₉Lys, Leu₂₁₉₀Pro, Thr ₂₁₉₁Ala, Asp₂₁₉₂Glu, Pro₂₁₉₄Leu, Tyr₂₂₀₄His, Asn₂₂₆₅Tyr, Asn₂₂₆₅ Asp.

Наиболее предпочтительным является мутантный BVDV по изобретению, в котором мутация в С-концевом домене хеликазного домена NS3 включает Asp₂₁₉₂Glu, Tyr₂₂₀₄ His, Asn₂₂₆₅Tyr или Asn₂₂₆₅Asp мутации.

Белок Core, видимо, не является необходимым для формирования инфекционных частиц. Видимо, С не является необходимым для сборки пестивируса, но имеет другие функции. Его функция компенсируется мутациями в хеликазном домене NS3. Точная последовательность остаточных аминокислот белка Core, перекрывающая сигнал транслокации (LEKALLAWAVITILLYQPVAA₂₆₈) для CSFV Erns или (LEKALLAWAIIALVFFQVTMG ₂₇₀) для BVDV Erns (последовательность, покрывающая промежуток между С-концом Npro и N-концом Erns), не требуется для формирования инфекционных вирусных частиц при условии сохранения транслокации Erns. Сигнальная последовательность постороннего гликопротеина может функционально заменить аутентичную последовательность. Конструкт, в котором остаточные аминокислоты Core были полностью замещены N-концевым сигналом транслокации CD46, является жизнеспособным (CD46 служит всего лишь примером транслоцируемого клеточного белка). Когда был введен трансмембранный домен бычьего CD46 (SSGRSPGWLLLAPLLLLPTSSDA), был восстановлен жизнеспособный вирус, достигающий титров 2×10 ⁴ ffu/мл.

Размножение пестивирусов в отсутствие Core открывает возможность для пестивирусной маркерной вакцины. Может ожидаться, что антитела, направленные против белка Core, присутствуют в сыворотке животных, которые преодолели инфекцию пестивирусом. Core является иммуногенным и экспрессируется в достаточном количестве.

Вакцина, содержащая инфекционные вирусные частицы по изобретению, вместе с фармацевтически допустимым носителем является также частью настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Конструкты с делецией Core

Для проверки гипотезы, что замены в NS3 компенсируют недостаток поврежденного белка Core, были введены нуклеотидные замены в кДНК инфекционного CSFV, в которой Core кодирующая последовательность (aa169-248 (SDDGASG-KPPESRKKL)) была удалена (p619). Так, С-конец Npro был соединен с С-концевыми аминокислотами Core, которые образовывают транслокационный сигнал для Erns (CPLWVTSC₁₆₈ /LEKALLAWAVITILLYQPVAA₂₆₇/ENIT). Делеция большей части гена Core позволяет репликацию РНК после трансфекции, но не продукцию инфекционного вирусного потомства. Введение мутации Asn₂₁₇₇ Tyr в CSFV Core и электропорация кРНК приводят к неожиданному высвобождению инфекционных вирусных частиц. На Нозерн - блот анализе геномная РНК видна как немного уменьшенная в размере, и концентрированные вирусные частицы не содержат белка Core. Вирусные титры достигают 5×10⁵ ffu/мл в SK6 клетках и, таким образом, являются ниже примерно в 10 раз, чем титры p447 wt.

Далее другие мутации Glu₂₁₆₀Gly, Pro₂₁₈₅ Ala, Gln₂₁₈₉Lys, Pro₂₂₀₀Thr и Asn₂₂₅₆ Asp были введены в CSFV Core (p619), что привело к получению p1033 (Ala₂₁₈₅ ), p1034 (Thr₂₂₀₀), p1035 (Lys₂₁₈₉), p1036 (Asp₂₂₅₆), p1037 (Gly₂₁₆₀) и p1038 (Asp ₂₂₅₆). Во всех случаях вирус был восстановлен после электропорации с соответственными SP6 транскриптами, но его жизнеспособность значительно отличалась. Наиболее жизнеспособным был геном, содержащий замену Asn₂₁₇₇Tyr (мутант «CSFV1017 Core »). Белок Core, видимо, не является необходимым для формирования инфекционных частиц. Его функция компенсируется мутациями в хеликазном домене NS3.

Для определения, является ли компенсация отсутствующего Core мутациями в NS3 также применимой для BVDV, была удалена Core кодирующая последовательность кДНК BVDV клона NCP7 (GeneBank accession number AF220247) путем ПЦР на субклоне, содержащем фрагмент XhoI/BglII fragment (нп 222-2335) с использованием праймеров BVT86 (GCAGCTTGAAACCCATAGGGGGCAG) и Core268 (CTAGAGAAAGCCCTATTGGCCTG). Делеция была подтверждена путем секвенирования и введена в полноразмерный кДНК клон лигированием XhoI/NcoI фрагмента (нп 222-4671). Полученная полноразмерная плазмида, не имеющая Core (p1026), кодировала N^pro , предшествующий сигнальной последовательности E^rns , аналогичной CSFV Core (p619). Транскрипты р1026 являлись репликационными в клетках MDBK, но инфекционных вирусов не наблюдалось. Введение замен Pro₂₁₉₄Ala, Pro₂₂₀₉Tyr и Asn₂₂₆₅ Asp в NCP7 C делало возможным восстановление титров инфекционного вируса до примерно 10³ ffu/мл при титровании на MDBK клетках. Модифицированный NCP7 C, который был сконструирован для размножения в клетках SK6 свиньи, выявил компенсирование Core при заменах Tyr₂₂₀₄ His, Asn₂₂₆₅Tyr, Asn₂₂₆₅Asp, Pro₂₁₉₄ Leu, Gln₂₁₉₈Lys и Leu₂₁₉₉Pro. Вирус NCP7, не имеющий Core, был высвобожден из клеток SK6 со значительными титрами (Asn₂₂₆₅Tyr: 3,3×10⁵, Tyr ₂₂₀₄His: 2×10⁴ и Asp₂₁₉₂Glu: 1,5×10⁴ ffu/мл).

На основе инфекционной копии BVDV C86, обычного вируса BVDV типа 1, который хорошо растет на клетках MDBK, был получен, как описано выше, мутант с делецией Core и была введена мутация, аналогичная Asn₂₂₆₅Asp (Asn₂₄₃₃Asp). После трансфекции в клетки SK6 получили вирус с титром 5×10⁴ ffu.

Трансмембранный домен из белка Core может быть функционально замещен последовательностью из клетки-хозяина

Для исключения функциональной важности остаточных аминокислот, перекрывающих сигнал транслокации (LEKALLAWAVITILLYQPVAA₂₆₈) для Erns, последовательность, покрывающая промежуток между С-концом Npro и N-концом Erns, была замещена в CSFV Core _N2177Y (p1017) трансмембранным доменом бычьего CD46 (SSGRSPGWLLLAPLLLLPTSSDA). SP6 транскрипты соответствующей кДНК (р1246) были трансфецированы в клетки SP6. Жизнеспособный вирус был высвобожден, достигая титров 2×10⁴ ffu/мл.

Материалы и методы

Клетки и вирусы

SK6 клетки культивировали в пластиковых флаконах в DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и заменимые аминокислоты, в инкубаторе с 5% CO₂. Клетки пересевали через каждые три дня. Все CSFV были получены из штамма non-cp CSFV strain Alfort-p447 (Gallei et al., J. Virol., 79(4), 2440-2448, 2005).

Электропорация:

2 мкг транскрипта SP6 вводили в 5×10⁶ SK6 клеток путем электропорации. Для этой цели клетки SK6 трипсинизировали (при 90% конфлюентности), промывали дважды в PBS (Ca++ и Mg++), смешивали с транскриптом в конечном объеме 310 мкл и подвергали электропорации (Biorad Genepulser, 0,18 кВ и 0,95 мкФ) в кюветах с 2 мм отверстием. Клетки собирали из кюветы и высевали на 35 мм пластиковые чашки с DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки.

Выделение РНК и синтез кДНК:

Клетки SK6, инфицированные восстановленным вирусом, были промыты, и РНК была выделена с применением набора Rneasy Kit (Quiagen) по протоколу, рекомендованному производителем. 2 мкг РНК использовали для обратной транскрипции с использованием различных праймеров в зависимости от фактического расположения области, представляющей интерес. ПЦР проводили с соответствующими праймерами, и продукт суб-клонировали в вектор pGEM-T (Promega).

Пример 2: Эксперимент с животными.

Эксперимент с животными проводили с целью характеризации вирулентности мутанта «CSFV 1017 Core » вируса классической чумы свиней (Classical Swine Fever Virus, CSFV) в экспериментальных условиях.

Цель:

Главной целью этого эксперимента было исследование, продемонстрирует ли CSFV мутант «CSFV 1017 Core » ослабление в сравнении с родительским штаммом «CSFV Alfort p447». Использование индикаторных свиней позволило приблизительно изучить распространение и передачу вируса. Поскольку ослабление было подтверждено, оставшиеся свиньи были инфицированы 2 января высокопатогенным штаммом CSFV Koslov.

Эксперимент с животными:

Часть I - инфицирование

Шесть молодых свиней были куплены на коммерческой свиноводческой ферме 16 октября 2006 года и помещены в лабораторию с высоким уровнем защиты в Институте Вирусологии. Животные были разделены случайным образом на две группы про три свиньи в каждой. Всех животных индивидуально промаркировали номерами и ушными бирками.

Две группы (группа 1: животные с номерами 75-77; группа 2: животные с номерами 78-80) содержали в условиях высокой защиты (отрицательное давление воздуха 100 Па) в отдельных загонах без какого-либо контакта друг с другом в течение эксперимента. Животных кормили один раз в день. Воды было поставлено без ограничений. Животные были клинически здоровы на момент начала испытания.

У всех животных перед началом эксперимента собрали образцы крови и исследовали их на присутствие нейтрализующих антител к пестивирусам (CSFV, вирус пограничной болезни (BDV) и вирус бычьей вирусной диареи (BVDV),в нейтрализационном анализе. После периода адаптации к новому окружению две свиньи из каждой группы были инфицированы внутримышечно примерно 10⁷ TCID₅₀ CSFV₁₀₁₇ (группа 1) и CSFV Alfort p447 (группа 2) соответственно. Индикаторные свиньи (одна на каждую группу) были убраны из групп на по крайней мере 12 часов после инфицирования. После этого периода времени они были снова помещены в соответственные группы.

Животные в двух группах каждый день осматривали на наличие клинических симптомов и повышенной температуры тела. Температура тела, превышающая 40°С, регистрировалась как лихорадка. В течение эксперимента животные, показывающие клинические симптомы, которые не были больше терпимыми, были умерщвлены по гуманным соображениям. Постсмертные исследования всех животных проводилось и регистрировалось.

Образцы крови (цельная кровь и EDTA антикоагулированная кровь) забирали у животных на день 0, 2, 4, 7, 10, 14, 21 и 28 после инфицирования. Дополнительные образцы забирали в день умерщвления. Образцы цельной крови центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре (Labofuge 400R, Heraeus, Germany) для получения сыворотки. Затем сыворотку разделили на подходящие аликвоты объемом 0,5-2,0 мл и хранили при -80° С до дальнейшего тестирования.

Часть II - Провокационная проба

Свиньям, оставшимся после инфицирования (часть I), была введена интраназально провокационная проба (71-й день после инфицирования) в количестве 10⁷ TCID₅₀ высокопатогенного штамма CSFV Koslov. Образцы крови забирали на 0, 3, 6 день после провокационной пробы и в день умерщвления соответствующих животных.

Лабораторные исследования

Подсчет лейкоцитов

Лейкоциты в образцах EDTA крови подсчитывали вручную с использованием камеры для подсчета по Neubauer (улучшенной) после лизиса эритроцитов в уксусной кислоте (2%). EDTA кровь набирали в меланжер Thoma (blood diluting pipette according to Thoma) до отметки 0,5. Затем добавляли уксусную кислоту (2%) до отметки 11 и слегка встряхивали разведение образца в течение 60 секунд. После заполнения приготовленной счетной камеры разведением лейкоциты подсчитывали в полях для счета лейкоцитов под световым микроскопом. Точное значение подсчитывали в соответствии с инструкцией к камере. Значения ниже 10 Г/л были зарегистрированы как лейкопения.

Подсчет лейкоцитов выполняли на 0, 2, 4, 7, 10, 14, 21 и 28 день после инфицирования.

Нейтрализационный анализ с пероксидаза-связанными антителами

Нейтрализационные анализы с пероксидаза-связанными антителами (NPLA) проводили в соответствии с «Руководством по диагностике» Европейской комиссии (решение комиссии 2002/106 от 1 февраля 2002) и его Технической Частью, используя следующие вирусы для детекции антител против CSFV и BVDV/пестивирусов соответственно:

- BVDV NADL

- CSFV референсный штамм «Alfort 187» (CSF 902)

- CSFV Alfort p447 (родительский штамм)

- CSFV Koslov (штамм для провокационной пробы)

- CSFV Diepholz (CSF0104)

Анализы NPLA для детекции антител против BVDV проводили на первичных клетках почки телячьего эмбриона, тогда как анализы NPLA для детекции антител против CSFV проводили на постоянных клетках почки свиньи (SK6). Титры антител выражали как величины, обратные наибольшему разведению исходной сыворотки, которое предотвращает репликацию вируса в 50% из 2 повторяющихся лунок. Эти нейтрализующие разведения 50% (ND₅₀) были подсчитаны с использованием способа по KARBER.

Анализы NPLA для детекции антител против CSFV проводили на 0, 10, 14, 21 и 28 день после инфицирования (CSFV Alfort p447 и CSF0902). Дополнительно исследовали образцы, взятые на 0, 3 и 6 день после провокационной пробы и в день умерщвления (CSFV Alfort p447 и CSF0902).

Образцы, взятые после провокационной пробы, были подвергнуты NPLA с использованием также штаммов CSFV Koslov и CSF0104.

Анализы NPLA для детекции нейтрализующих антител против BVDV проводили перед началом эксперимента.

Определение антител иммуноферментным анализом (ELISA)

В дополнение к анализам NPLA образцы сыворотки, полученные на день 0, 14, 21 и 28 после инфицирования и в день умерщвления, были проанализированы коммерчески доступным иммуноферментным анализом (ELISA) для детекции антител, направленных против CSFV. Все тесты проводили в точности, как описано в инструкции производителя. Был использован следующий ELISA тест-набор:

- HerdChek CSFV, Idexx Laboratories, Worrstadt, Germany

Выделение вируса

Выделение вируса из препаратов лейкоцитов проводили на протяжении двух пассажей постоянных клеточных линий клеток почки SK6 свиньи и Rie 5-1 в соответствии с Европейским руководством по диагностики (решение комиссии 2002/106/EC). Непрямое иммуномечение проводили специфичными к пестивирусу моноклональными антителами BVD/C16 (Peters et al., 1986) и коммерчески доступным специфическим пероксидаза-связанным коньюгатом (RAMPO, Dako).

Определение антигена иммуноферментным анализом (ELISA)

В дополнение к выделению вируса проводили коммерчески доступный иммуноферментный анализ (ELISA) для детекции антигена в точности с инструкциями производителя. Анализировали образцы, взятые на 0, 4, 7 и 10 день.

Был использован следующий ELISA тест-набор:

- CHEKIT HCV-Antigen, бывший Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, Switzerland

Результаты

Часть I - инфицирование

Клинические симптомы и температура (см. Фиг.1)

В течение инфекционной части эксперимента только животное 76 показало легкую лихорадку на 8 день после инфицирования (40,1°C). Субфебрильные температуры 40,0°C были зарегистрированы для животных 75 и 76 на 14 день после инфицирования.

В отличие от этого у всех животных группы 2 поднялась температура. Животное 78 показало фебрильную температуру на восьмой и девятый день после инфицирования и с 13 дня после инфицирования до конца эксперимента на день 28.

Животное 79 показало температуру на день 9 после инфицирования и с 14 дня после инфицирования до конца эксперимента. Фебрильные температуры были зарегистрированы для животного 80 на седьмой, девятый, десятый день и с 13 дня до 20 дня после инфицирования. На день 21 животное 80 показало температуру тела 35,6°C.

Тогда как у животных группы 1 (75-77) в течение первой части эксперимента не развились какие-либо клинические симптомы, характерные для CSFV инфекции, у всех животных группы 2 (78-80) развились четко выраженные клинические симптомы. Острота клинических симптомов изменялась от животного к животному. Животное 76 было умерщвлено независимо от CSF инфекции на 44 день после инфицирования вследствие сильной хромоты. На протяжении эксперимента у животного 78 развились острая диарея, конъюктивит, анорексия, кожные повреждения и атаксия. Животное было умерщвлено на 28 день после инфицирования. У животного 79 возникли только легкие, нехарактерные симптомы, включая сниженный аппетит и легкую диарею. Животное было умерщвлено на 28 день после инфицирования. У животного 80 возникли острые симптомы, включая желудочно-кишечные и респираторные симптомы, анорексию, вялость и кожные повреждения. Животное было умерщвлено умирающим на 21 день после инфицирования.

Количество лейкоцитов (Фиг.2)

В большинстве случаев животные группы 1 не показали лейкопении. Однако животные 75 и 77 показали уровни ниже 10 G/l на 20 день после инфицирования. В тот же день животное 76 показало только 10,3 G/l. У всех животных из группы 2 развилась острая лейкопения из-за инфекции CSFV Alfort p447. У животного 78 лейкопения началась на 4 день после инфицирования, и всего лишь 0,45 G/l было детектировано в день умерщвления. Индикаторная свинья 79 показала лейкопенические уровни на 21 и 28 после инфицирования и граничное значение 10,6 G/l уже на 14 день после инфицирования. Животное 80 показало острую лейкопению, начиная с 4 дня после инфицирования. Окончательное значение было 1,4 G/l на 21 день после инфицирования.

Патология

Животных из группы 1 не умерщвляли в течение инфекционной части эксперимента.

Животные из группы 2 продемонстрировали различные патологические симптомы. У животного 78 обнаружили диффузный дерматит, увеличенные и геморрагические лимфатические узлы в пищеварительном канале и дыхательном тракте, атрофию тимуса, бронхопневмонию, язвенный гастрит, катаральный энтерит, пиелонефрит и петехиальные кровотечения в коре почек. У животного 79 обнаружили легкую атрофию тимуса, слегка увеличенные лимфатические узлы в пищеварительном канале и дыхательном тракте, пневмонию (краниальные доли), язвенный гастрит, острый катаральный энтерит и цистит. У животного 80 обнаружили петехиальные кровотечения в коже и подкожном слое (acra, абдоменальный отдел), серьезно увеличенные, отечные и геморрагические лимфатические узлы (системно), сильную атрофию тимуса, петехиальные кровотечения в мягких мозговых оболочках, селезенке, надгортаннике, трахее, желудке, стенке пищеварительного канала, илеоцекальном клапане, мочевом пузыре, печени, желчном пузыре и почках. Также у животного 80 обнаружили катарально-гнойную пневмонию, обширные кровоизлияния под эндокардом и внутри сердечной мышцы, тяжелый геморрагический гастрит, запор и серьезный интерстинальный нефрит.

Детекция антител

Нейтрализационный анализ с пероксидаза-связанными антителами (NPLA)

Всех животных протестировали как отрицательных на BVDV/пестивирус антитела перед началом эксперимента. Все образцы, взятые на 0 день, показали отрицательные (<5 ND₅₀) результаты с обоими штаммами CSFV, использованными в NPLA (CSF0902 и Alfort p447).

При использовании штамма CSFV Alfort p447 животные из группы 1 показали положительные результаты, начиная с 14 дня после инфицирования (животное 75). Более детально, животное 75 показало положительные результаты на 21 и 28 день после инфицирования, достигнут титр антител 158,5 ND₅₀. Индикатор, животное 77, не выработало какого-либо титра антител.

При использовании CSF0902 только животное 76 показало низкий титр антител 7,5 ND₅₀ на 28 день после инфицирования. Животные группы 2 остались отрицательными (<5 ND₅₀ ) на CSFV антитела во всех анализах NPLA, проведенных на протяжении эксперимента.

Определение антител иммуноферментным анализом (Ab-ELISA)

Тогда как животное 75 показало первый сомнительный результат на 21 день после инфицирования и было положительным на 28 день после инфицирования, животное 76 показало сомнительный результат на 14 день после инфицирования и положительные результаты на 21 и 28 день после инфицирования. Животное 77 осталось отрицательным.

Животные 78 и 79 показали отрицательные результаты на протяжении исследования, тогда как животное 80 показало сомнительный результат в день умерщвления (21 день после инфицирования).

Выделение вируса

Животные группы 1 продемонстрировали отрицательные результаты на протяжении инфекционной части исследования как на SK6, так и на Rie 5-1 клетках.

Животное 78 показало положительные результаты на четвертый, седьмой, десятый (исследование только на SK6 клетках) и четырнадцатый день после инфицирования на SK6 и Rie 5-1 клетках соответственно. Кроме того, положительный результат был получен для этой свиньи на второй день после инфицирования на Rie 5-1 клетках. Индикаторная свинья, животное 79, оставалась отрицательной на обеих клеточных линиях. На SK6 клетках животное 80 показало положительные результаты на седьмой, десятый и четырнадцатый день после инфицирования. Положительные результаты также были получены на клетках Rie 5-1 на день семь и четырнадцать (десятый день не был протестирован из-за отсутствия материала в образце).

Определение антигена иммуноферментным анализом (Ag-ELISA)

Ag-ELISA оставался отрицательным для всех животных из группы 1 и для животных 78 и 79 из группы 2. Только животное 80 показало положительный результат на 10 день после инфицирования.

Часть II - провокационная проба

Клинические симптомы и температура тела

Свиньи, оставшиеся после инфекционной части, животные 75 и 77, были подвергнуты провокационной пробе с высокопатогенным CSFV штаммом Koslov на день 71 после инфицирования.

Животное 75 не обнаружило фебрильной температуры или каких-либо клинических симптомов после провокационного инфицирования, и оно было умерщвлено на 16 день после провокационной пробы.

У животного 77 развилась лихорадка на 3 день после провокационного инфицирования и сохранялась до умерщвления. Животное было умерщвлено умирающим на восьмой день после провокационного инфицирования с острыми неврологическими симптомами.

Патология

Перед провокационной пробой животное 76 было умерщвлено из-за сильной хромоты. У этого животного не обнаружили каких-либо патологических нарушений, характерных для CSF. Была обнаружена лишь слабая пневмония в краниальных долях.

Кроме слабой пневмонии в краниальных долях и легкого язвенного гастрита у животного 75 не обнаружили каких-либо патологических симптомов. Животное 77 имело увеличенные, частично геморрагические лимфатические узлы, катаральную пневмонию, асцит, легкий язвенный гастрит, печеночную конгестию, отек желчного пузыря и интерстинальный нефрит.

Детекция антител

После провокационного инфицирования животное 75 показало титр антител против провоцирующего вируса 160 ND₅₀ (день 16 после провокационной пробы) и титр >640 против CSF0104. Животное 77 осталось отрицательным.

Заключение и выводы

- CSFV мутант «CSFV 1017 Core » продемонстрировал фактически полную аттеньюацию по сравнению с родительским штаммом «CSFV Alfort p447».

- В отличие от животных из группы 2 для животных из группы 1 не смогли детектировать вирус в вирусных выделениях на различных клеточных линиях.

- За исключением индикаторной свиньи, животные из группы 1 выработали нейтрализующие антитела после инфицирования CSFV 1017 Core .

- Индикаторная свинья в группе 1 не показала каких-либо положительных результатов как при определении антител, так и при определение антигена. Так, распространение и передача мутантного вируса являются весьма маловероятными.

- Отсутствие клинических признаков после провокационного инфицирования высокопатогенным штаммом CSFV доказало полную защиту животных, ранее инфицированных CSFV 1017 Core .

- Индикаторная свинья показала остролетальное течение CSF после провокационного инфицирования штаммом CSFV Koslov.