способ получения аллантоина

Формула изобретения

Способ получения аллантоина из клеточной культуры растения, включающий экстракцию органическим растворителем и хроматографическое выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве клеточной культуры растения используют клеточную культуру Mertensia maritima (L.) S.F.Gray, которую экстрагируют смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 3:1 в течение 4-6 ч при температуре 50°С, затем экстракт упаривают и хроматографируют на сорбенте с обращенной фазой.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения аллантоина - ценного биологически активного вещества для медицины и косметологии.

Аллантоин относится к категории безопасных и эффективных защитных средств для кожи и входит в состав более чем 1300 различных косметических продуктов [1], a также входит в состав композиций, предназначенных для лечения заболеваний кожи, и в рецептуру косметических средств по уходу за кожей лица и тела. Аллантоин способствует заживлению язв и гнойных ран, обладает успокаивающим кожу действием, стимулирует регенерацию тканей, удаляет отмершие клетки эпителия и мозолистые образования, является противовоспалительным, антиоксидантным средством. Обладая регенерирующим действием, аллантоин способствует удалению рубцов, шрамов и келоидов [2]. В составе защитных кремов защищает кожу от солнечных ожогов, обветривания и растрескивания [3], обладает геронтологическим действием [4] и восстанавливает нормальную влажность и эластичность кожи [5]. При пероральном применении увеличивает содержание лейкоцитов и улучшает ток лимфы, защищает ткани желудка и кишечника, способствует репарации желудочно-кишечного тракта [3].

Аллантоин C₄H₆ N₄O₃ является конечным продуктом катаболизма пуринов. Большинство организмов, включая бактерии, растения и животные используют обычный путь метаболизма мочевой кислоты: в результате ее деградации в большинстве случаев образуется (+)-S-аллантоин. Далее аллантоин подвергается дальнейшему ферментативному расщеплению, являясь источником азота [6].

Впервые аллантоин был выделен из корней растения окопника лекарственного Symphytum officinale семейства бурачниковых, обнаружен в Dioscorea spp.семейства диоскорейных и Coffea spp. семейства мареновых. Также он был обнаружен в биотехнологическом источнике - в каллусах растения кофе Coffea arabica [7]. Однако как растения, так и каллусы продуцируют незначительные количества аллантоина. Так, виды Coffea arabica и Coffea dewevrei накапливают аллантоин в количестве 0,03-0,09% от сухого веса ткани [8], в бобах сои обнаружено до 0,03% аллантоина [9], в корнях диоскореи Dioscorea spp. - 0,41-0,71% [10]. Среди растительных источников максимальное количество аллантоина (0,7-2,6%) накапливают корни окопника лекарственного Symphytum officinale [7], однако и этого количества недостаточно для промышленного получения целевого продукта. В настоящее время как растения, так и каллусы не являются сырьем для получения аллантоина. По причине отсутствия высокопродуктивного сырьевого источника получают аллантоин в промышленных масштабах только путем химического синтеза.

Известны методы синтетического получения аллантоина, наиболее распространенный из них метод гидролитического расщепления мочевой кислоты [11]. Метод малозатратный и широко применяется для получения синтетического аллантоина. К недостаткам метода относится то, что при химическом синтезе конечным продуктом является рацемат - оптически неактивная смесь энантиомеров: (-)- и (+)-формы аллантоина. Известно, что биологическая активность оптических изомеров может различаться, также различия существуют между биологическим действием оптически активного вещества и рацемата [12].

Аллантоин, полученный из природных источников, в силу ферментативного синтеза, обладает более выраженным биологическим действием, поскольку представляет собой одну из оптически активных форм, а не смесь оптических изомеров [12]. Необходимо отметить, что в настоящее время растет спрос на лекарственные препараты природного происхождения. Известны научные данные, подтверждающие тот факт, что природные вещества узнаются рецепторными системами организма с большей эффективностью, чем их аналоги, полученные в результате химического синтеза. Кроме того, натуральные соединения обладают более выраженным фармакологическим действием в отношении биологических мишеней [3, 13].

Сегодня нет альтернативного способа получения аллантоина, поэтому поиск новых подходов является актуальной проблемой. Один из потенциальных путей ее решения - использование современных методов биотехнологии, например, культивирование клеток с целью получения биологически активных веществ. Клеточные культуры растений могут стать перспективным воспроизводимым источником аллантоина для медицины и фармакологии. До настоящего времени аллантоин не удавалось получить в культурах клеток в больших количествах.

Известен способ получения аллантоина в культуре клеток Coffea arabica, однако недостатком этого способа является низкая продуктивность аллантоина. Каллусы этого растения накаливают аллантоин в незначительных количествах, что недостаточно для его промышленного получения [7]. Заявителю не известны другие аналоги получения аллантоина с использованием клеточных культур растений, поэтому данный способ был взят, как наиболее близкий, в качестве прототипа.

Культуру клеток Coffea arabica выращивают в жидкой среде по прописи Мурасига и Скуга. Затем сухую биомассу экстрагируют водным раствором метилового спирта и хлороформа 24 часа при температуре 4°С. Экстракт упаривают под вакуумом и аллантоин выделяют методом ВЭЖХ. Количество аллантоина в каллусах составляет 0,008% от сухой биомассы. Недостатком этого способа является низкий выход целевого продукта. Кроме того, авторами не указано, какие оптические активные формы аллантоина ими были получены.

Задачей изобретения является поиск нового биотехнологического источника (-)-R-аллантоина и разработка способа, позволяющего получить его из этого источника с наибольшим выходом.

Поставленная задача решена тем, что в способе получения аллантоина из клеточной культуры растения, включающем экстракцию органическим растворителем и хроматографическое выделение целевого продукта, согласно изобретению, в качестве клеточной культуры растения используют клеточную культуру Mertensia maritima (L.) S.F.Gray, которую экстрагируют смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 3:1 в течение 4-6 ч при температуре 50°С, далее экстракт упаривают, затем хроматографируют на сорбенте с обращенной фазой.

Способ получения аллантоина предусматривает использование клеточной культуры мертензии Mertensia maritima (L.) S.F.Gray, полученной авторами заявляемого способа. Каллусы растения Mertensia maritima (L.) S.F.Gray получают следующим образом. Экспланты листьев и апекальных побегов растения Mertensia maritima стерилизуют в растворе диоцида (этанолмеркурия хлорид и цитилпиридиния хлорид) в течение 5-8 мин и помещают в колбы Эрленмейера объемом 100 мл, содержащие 30 мл агаризованной питательной среды W_B/А известного состава [14].

Затем экспланты культивируют в темноте при относительной влажности воздуха 50-70% и температуре 18-28°С. После образования на эксплантах первичных каллусов их пассируют на свежие питательные среды такого же состава и инкубируют не менее 10 пассажей при тех же условиях с циклом выращивания 25-35 суток для стабилизации ростовой и биосинтетической активности каллусов. После указанного периода каллусы извлекают из культуральных сосудов и высушивают.

Далее для получения аллантоина сухую каллусную ткань экстрагируют смесью хлороформа и этилового спирта и выделяют (-)-R-аллантоин методом хроматографии низкого давления, например, на колонке с сорбентом Toyopearl HW-50 или Toyopearl HW-40, или на колонке, заполненной силикагелем-C₁₈ (30-70 мк) в системе растворителей вода:этиловый спирт с градиентным увеличением содержания этилового спирта до 60%. Содержание аллантоина в каллусах растения Mertensia maritima (L.) S.F.Gray линия Mm-S1 составляет 3,5-3,9% от сухой массы клеток.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение культуры каллусов растения Mertensia maritima (L.) S.F.Gray линия Mm-S1.

Экспланты листьев и апекальных побегов растения стерилизуют в 0,2% растворе диоцида в течение 5-8 мин и помещают в колбы Эрленмейера объемом 100 мл, содержащие 30 мл агаризованной питательной среды следующего состава, мг/л воды:

NH₄NO ₃ - 400

KNO₃ - 1900

K₂HPO₄ - 170

CaCl₂ ×6H₂O - 440

MgSO₄×7H ₂O - 370

H₃BO₄ - 6,2

MnSO₄×4H₂O - 16,9

CuSO₄×5H₂O - 0,025

CoCl₂×2H₂O - 0,025

ZnSO₄×7H₂O - 8,6

Na ₂MoO₄×2H₂O - 0,25

KJ - 0,83

FeSO₄×7H₂ O - 27,8

Na₂EDTA×2H₂ O - 37,3

Мезоинозит - 100

Тиамина гидрохлорид - 0,2

Никотиновая кислота - 0,5

Пиридоксина гидрохлорид - 0,5

Казеина гидролизат - 100

6-бензиламинопурин - 0,5

-нафтилуксусная кислота - 2

Сахароза - 25000

Агар - 7000

Вода - до 1 л

рН среды 5,6-5,8 до автоклавирования.

Экспланты инкубируют в течение 30 суток в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 50-70%. Образующиеся на эксплантах каллусы отделяют и культивируют на питательной среде такого же состава в течение десяти пассажей с 30-суточным интервалами для стабилизации ростовой и биосинтетической активности каллусов. Затем каллусы извлекают из культуральных сосудов и высушивают в токе горячего воздуха при температуре 50-55°С.

Пример 2. Получение аллантоина.

100 г сухой биомассы каллусов экстрагируют смесью хлороформа и этилового спирта (300 мл) в соотношении 3:1 в течение 4 ч при температуре 50°С в экстракторе Сокслета. Полученный экстракт упаривают под вакуумом до объема 3 мл и хроматографируют на колонке с сорбентом Toyopearl HW-50, в системе растворителей вода:этиловый спирт с градиентным увеличением содержания этилового спирта от 0 до 60%. Хроматографическую фракцию, содержащую от 10 до 15% этилового спирта в воде, упаривают и перекристаллизовывают из этилового спирта. Выход (-)-R-аллантоина составляет 3,6 г.

Пример 3. Способ осуществляется, как описано в примере 2, но выделение целевого продукта в течение 6 ч при температуре 50°С осуществляют на колонке (3×40 см), заполненной силикагелем-C₁₈ (30-70 мк) в системе растворителей вода:этиловый спирт с градиентным увеличением содержания этилового спирта от 0 до 60%. Хроматографическую фракцию, содержащую от 10 до 15% этилового спирта в воде, упаривают и перекристаллизовывают из этилового спирта. Выход (-)-R-аллантоина составляет 3,8 г.

Полученный кристаллический порошок белого цвета представляет собой целевой продукт - оптически активный (-)-R-аллантоин следующей структуры:

Установлено, что культура каллусов мертензии продуцирует только оптически активную форму (-)-R-аллантоина и не синтезирует другие формы изомеров аллантоина. Структуру (-)-R-аллантоина определяют стандартными методами ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, рентгеноструктурного анализа и спектрами кругового дихроизма.

Количественное содержание (-)-R-аллантоина определяют методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent Technologies (серия 1100), снабженного системой насосов высокого давления QuatPump G 1311 А, дегазатором DEGASSER G1322A, инжектором G1328B и детектором VWD G1314A. Результаты анализов обрабатывались программой ChemStation® program var. 09.

Условия хроматографирования: колонка ZORBAX Eclipse XDB-C18 3.5 мкм (75×4,6 mm), градиентное элюирование: раствор 1% уксусной кислоты (А) и ацетонитрил, содержащий 1% уксусную кислоту (В): 0-12 мин (5-50% В), 12-15 мин (50-90% В), и 15-17 мин (90-95% В), скорость потока 1 мл/мин при -254 нм.

К образцу (100 мг) сухих каллусов добавляют 200 мкл 2/HCl в этиловом спирте и оставляют при комнатной температуре на 15 ч, затем экстрагируют 96% этанолом (3 мл) при нагревании (55°С) в течение 2 ч. Экстракт (450 мкл) смешивают с 50 мкл спиртового раствора кофейной кислоты (1 мг/мл), используемого в качестве внутреннего стандарта. В хроматограф вводят аликвоту 5 мкл испытуемого раствора. Содержание аллантоина в образцах определяют по соотношению площадей пиков аллантоина и стандартного образца кофейной кислоты.

Полученная культура каллусов растения Mertensia maritima (L.) S.F.Gray, обладающая повышенной продуктивностью, является воспроизводимым биотехнологическим источником природного оптически активного (-)-R-аллантоина. Это отличает используемую в заявляемом способе культуру каллусов растения Mertensia maritima (L.) S.F.Gray от большинства известных биологических объектов, синтезирующих в незначительных количествах, в основном, другой энантиомер аллантоина - (+)-S-аллантоин.

Заявляемым способом из каллусов растения Mertensia maritima (L.) S.F.Gray получают аллантоина в 10 раз больше, чем его содержится в природном растении, и в 400 раз больше, чем его получают из культуры клеток С.arabica (прототип). В таблице представлено содержание аллантоина в природном растении Mertensia maritima (L.) S.F.Gray и биотехнологическом источнике - каллусах (линия Mm-S1).

Таблица
Содержание аллантоина в природном растении Mertensia maritima (L.) S.F.Gray и биотехнологическом источнике - каллусах (линия Mm-S1)
Ткань	(-)-R-аллантоин, % от сухой массы
Стебли М.maritima	0.30±0.06
Листья М.maritima	0.48±0.09
Корни М.maritima	0.50±0.11
Каллусы М.maritima (линия Mm-S1)	3.74±0.24

Список литературы

1. Becker L.C, Bergfeld WF, Belsito DV, Klaassen CD, Marks JG Jr, Shank RC, Slaga TJ, Snyder PW, Alan Andersen F (2010) Final report of the safety assessment of allantoin and its related complexes. Int J Toxicol 29:84S-97S.

2. Thornfeldt C. (2005) Cosmeceuticals containing herbs: fact, fiction, and future. Dermatol Surg 31:873-880.

3. Xu В, Sung С, Han В (2011) Crystal structure characterization of natural allantoin from edible lichen Umbilicaria esculenta. Crystals 1:128-135.

4. Патент 2162318 РФ, МПК А61К 7/00, А61К 7/48. Крем косметический / Чигарина К.М. и др. - № 2000107064/14; заявлено 23.03.2000; опубл. 27.01.2001.

5. Патент 2178290 РФ, МПК А61К 7/40, А61К 7/48. Защитно-профилактический крем / Перламутров Ю.Н. - № 2000129008/14; заявлено 22.11.2000; опубл. 20.01.2002.

6. Kim К, Park J, Rhee S (2007) Structural and functional basis for (S)-allantoin formation in in the ureide pathway. J Biol Chem 282(32):23457-23464.

7. Filippi SB, Azevedo RA, Sodek L, Mazzafera P (2007) Allantoin has a limited role as nitrogen source in cultured coffee cells. J Plant Physiol 164:544-552.

8. Vitória АР, Mazzafera P (1999) Xanthine degradation and related enzymes activities in leaves and fruits of two coffea species differing in caffeine catabolism. J Agric Food Chem 47:1851-1855.

9. Mosquim PR, Sodek L (1992) Partitioning of nitrogen in soybean fruit explants cultured with glutamine, asparagine or allantoin. Plant Physiol Biochem 30:451-457. the ureide pathway. J.Biol. Chem. 282 (32): 23457-23464.

10. Yoon KD, Yang M-H, Chin Y-W, Park JH, Kim J (2008) Determination of allantoin in Dioscorea Rhizoma by high performance liquid chromatography using cyano columns. Natur Prod Sci 14:254-259.

11. Патент 101328149 Китай, МПК C07D 233/76. Novel allantoin synthesis process / WENQIANG SANG. - № 20081138689; заявлено 29.07.2008.

12. A.M.Posner (1958) Allantoin - its properties and uses. Journal of the Society of Cosmetic Chemists 9 (1):58-61.

13. Feher, M. and Schmidt, J.M. (2003) Property distributions: differences between drugs, natural products and molecules from combinatorial chemistry. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 43:218-227.

14. Bulgakov V.P., Tchemoded G.K., et.al. (2002). Effect of salicylic acid, methyl jasmonate, ethephon and cantharidin on anthraquinone production by Rubia cordifolia callus cultures transformed with the rolB and rolC genes. J. Biotechnol. V.97. P.213-221.