способ получения вируса гриппа

Формула изобретения

1. Способ получения вируса гриппа, согласно которому:

a. курам вводят вакцину против гриппа,

b. от вакцинированных кур забирают яйца,

c. инициируют процесс эмбриогенеза,

d. яйца с развивающимся эмбрионом инфицируют, вводя вирус гриппа в аллантоисную полость,

e. инфицированные яйца с развивающимся эмбрионом инкубируют в условиях температуры и влажности, которые обеспечивают репликацию вируса, и

f. собирают аллантоисную жидкость, содержащую вирус.

2. Способ по п.1, согласно которому вакцина против гриппа, которую вводят курам на стадии a) способа, защищает кур против птичьего гриппа.

3. Способ по п.1, согласно которому вакцина против гриппа, которую вводят курам на стадии a) способа, включает, в своей композиции, гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок.

4. Способ по п.1, согласно которому вакцина против гриппа, которую вводят курам на стадии a) способа, включает, в своей композиции, цельный инактивированный вирус гриппа.

5. Способ по п.1, согласно которому вакцина против гриппа, которую вводят курам на стадии a) способа, включает, в своей композиции, продукт, полученный из цельного вируса гриппа.

6. Способ по п.1, согласно которому вакцина против гриппа, которую вводят курам на стадии a) способа, включает, в своей композиции адъювант.

7. Способ по п.1, согласно которому вакцина против гриппа, которую вводят курам на стадии a) способа, включает, в своей композиции, аттенуированный вирус гриппа.

8. Способ по п.1, согласно которому вакцина против гриппа, которую вводят курам на стадии a) способа, включает, в своей композиции, вектор, включающий ген, кодирующий гемагглютинин вируса гриппа.

9. Способ по п.8, согласно которому этот вектор представляет собой поксвирус.

10. Способ по п.8, согласно которому вектор также включает ген, кодирующий нейраминидазу вируса гриппа.

11. Способ по п.8, согласно которому композиция вакцины дополнительно содержит адъювант.

12. Способ по п.3, согласно которому гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфицирования аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур, имеют разные подтипы.

13. Способ по п.3, согласно которому гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфицирования аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур, имеют один и тот же подтип.

14. Способ по п.3, согласно которому гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфицирования аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур, являются идентичными.

15. Способ по п.1, согласно которому вирус гриппа, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, идентичен вирусу гриппа, который используется для инфицирования аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур.

16. Способ по п.13, согласно которому гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфицирования аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур, имеет подтип Н5.

17. Способ по п.1, включающий дополнительную стадию, согласно которой очищают вирус гриппа, содержащийся в аллантоисной жидкости.

18. Способ по п.1, включающий дополнительную стадию, согласно которой инактивируют вирус гриппа, содержащийся в аллантоисной жидкости.

19. Применение вируса гриппа, полученного по п.1, для получения вакцины, предназначенной для профилактики гриппа.

20. Применение вируса гриппа, полученного по п.1, для получения вакцины, предназначенной для профилактики пандемического человеческого гриппа.

21. Применение вируса гриппа, полученного по п.1, для получения вакцины, предназначенной для профилактики эпидемического человеческого гриппа.

22. Применение вируса гриппа, полученного по п.1, для получения вакцины, предназначенной для профилактики гриппа у лошадиных, свиней, псовых, кошачьих, куньих и у птичьих видов.

23. Применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, для получения вируса гриппа.

24. Применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, для получения вакцины против гриппа.

25. Применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, по п.23 или 24, согласно которому яйца содержат антитела, направленные к гемагглютинину вируса гриппа.

26. Применение по п.25, согласно которому антитела направлены к гемагглютинину вируса гриппа, имеющему подтип Н5.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу получения вируса гриппа с использованием яиц, происходящих от кур, вакцинированных против гриппа, а также к применению такого способа для получения вакцины против гриппа.

В настоящее время известны три типа вируса гриппа (A, B и C), при этом вирус типа А является ответственным за расстройства у животных и человека, в то время как вирусы типа B и типа C являются особенно патогенными для человека. Вирусы типа А делятся на подтипы согласно антигенной структуре гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), которые являются основными гликопротеидами оболочки вируса. Выделяют шестнадцать подтипов НА (от H1 до H16) и 9 подтипов NA (от N1 до N9). Подтип вируса типа А определяют, таким образом, по подтипу НА и подтипу NA, которые присутствуют в оболочке вируса. Дикие птицы составляют резервуар всех подтипов гриппа А. Некоторые подтипы вируса гриппа типа А эндемически или эпидемически (ежегодные эпидемии) заражают домашних птиц (различные подтипы, включая H5N1 и H9N2), лошадей (преимущественно H3N8), свиней (преимущественно H1N1, H3N2 и H1N2), а также человека (преимущественно H1N1 и H3N2). Собаки, кошки и другие дикие виды могут также иногда инфицироваться некоторыми подтипами (H3N8 и H5N1 у собак; H5N1 у кошек).

В ветеринарной области птицефермы, и более конкретно, занимающиеся разведением цыплят, кур и петухов, представляют в количественном отношении наибольшую популяцию, которая может быть поражена вирусом гриппа. Штаммы птичьего гриппа подтипов H5 и H7 могут иметь два патотипа: патотип низкой патогенности (или LP) и патотип высокой патогенности (или HP). Штаммы HP ответственны за птичий грипп и происходят от штаммов LP H5 и H7 после мутаций/вставок в особенности в сайте расщепления гемагглютинина (наличие множества основных аминокислот). Вплоть до настоящего времени на птицефермах настоятельно рекомендуются строгие меры гигиены и регулярный контроль, чтобы предотвратить птичий грипп, в частности, инфекции подтипами H5 и H7.

У человека иммунизация рекомендуется против сезонных циркулирующих вирусных штаммов, ответственных за эпидемии, которые являются более или менее сильными в зависимости от года. Большинство имеющихся в настоящее время вакцин получают, используя куриные яйца с эмбрионами, причем эти яйца инфицируют тремя различными штаммами вируса гриппа (два штамма вируса гриппа типа А, имеющие подтип H3N2 и H1N1 и один штамм вируса типа B). Яйца с развивающимся куриным эмбрионом от кур, которые не были иммунизированы против гриппа, используют, чтобы предотвратить явление интерференции, которая может нарушать репликацию вируса. Действительно, известно, что материнские антитела передаются цыплятам после присутствия в яйце и защищают их против микробных инфекций в течение первых дней жизни, но зато при этом они ответственны за дефицит иммунитета, если цыплят преждевременно вакцинируют против микробного агента, пока сохраняются защитные материнские антитела против этого агента. H. Stone et al. (1992, Avian Dis. 36: 1048-1051) показали, что новорожденные цыплята могут быть пассивно иммунизированы против болезни Ньюкасла путем введения желтка от яиц, происходящих от кур, иммунизированных против вируса болезни Ньюкасла (NDV). Однако, если после введения яичных желтков, цыплят вакцинируют вирусом NDV, наблюдается уменьшение иммунного ответа на вакцину. Также из исследований Hamal et al. (2006, Poultry Science 65: 1364-1372) известно, что степень передачи защитных антител от матери к новорожденным цыплятам, в частности передачи антител, направленных к вирусу NDV или к вирусу инфекционного бронхита (IBV), составляет от 30% до 40% (процент от числа антител в плазме курицы, циркулирующий в крови трехдневного цыпленка), что указывает, что большое число материнских антител блокируются в яйце. Это подтверждено исследованиями J.R. Beck et al. (2003, Avian Dis. 47:1196-1199), которые показывают, что все яйца содержат антитела к НА спустя приблизительно 3 недели после вакцинации курицы штаммом инактивированного вируса гриппа. Наконец, из исследований Fontaine et al. (1963, Pathobiologie, 11/9: 611-613) известно, что, если яйца с развивающимся эмбрионом инокулируют сывороткой против гриппа, яйца оказываются защищены против инфекции вирусом гриппа. Все эти причины дают специалисту основание полагать, что, если используют яйца от кур, иммунизированных против гриппа, эти яйца, вследствие переноса в яйцо материнских антител, направленных к гриппу, становятся непригодны для получения вирусов гриппа.

С начала 2000-х, экономическое последствие птичьего гриппа в хозяйствах по разведению домашней птицы не перестает увеличиваться с появлением очень инфекционных и патогенных птичьих вирусных штаммов, которые опустошают все птицефермы или, в менее драматических случаях, приводят к тому, что инфицированные куры перестают нестись. Типирование НА высокопатогенного вируса показывает, что почти все они имеют подтип H5 или H7. В настоящее время имеется опасение, что вирусные штаммы, имеющие подтип H5 или H7, адаптируются к человеку и могут приводить к настоящим пандемиям человеческого гриппа; о серьезных случаях человеческого гриппа, конечно, изолированных, в которых были вовлечены эти подтипы, уже сообщалось.

Ввиду риска того, что использование яиц больше не может всегда гарантировать возможность получения вакцины против гриппа, новые способы создания вакцин против гриппа в настоящее время направлены на использование систем клеточных культур.

Сущность изобретения

Несмотря на новые способы получения вакцин против гриппа, однако все еще существует потребность в возможности получения, при любых обстоятельствах, за короткий промежуток времени и в очень большом количестве, вируса гриппа для того, чтобы получить вакцину против гриппа. Настоящее изобретение отвечает этой потребности, описывая способ получения вируса гриппа, основанный, вопреки всем ожиданиям, на использовании яиц, происходящих от кур, заранее иммунизированных против гриппа.

Объект изобретения фактически относится к:

Способу получения вируса гриппа, согласно которому:

a. курам вводят вакцину против гриппа,

b. от вакцинированных кур забирают яйца,

c. инициируют процесс эмбриогенеза,

d. яйца с развивающимся эмбрионом инфицируют, вводя вирус гриппа в аллантоисную полость,

e. инфицированные яйца с развивающимся эмбрионом инкубируют в условиях температуры и влажности, которые обеспечивают репликацию вируса, и

f. собирают аллантоисную жидкость, содержащую вирус.

Предпочтительно, вакцина защищает кур против птичьего гриппа.

Как правило, вакцина против гриппа включает, в своей композиции, гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок.

Согласно одному аспекту композиция вакцины против гриппа содержит цельный инактивированный вирус гриппа.

Согласно другому аспекту композиция вакцины против гриппа содержит продукт, полученный из цельного вируса гриппа.

Согласно еще одному аспекту композиция вакцины также содержит адъювант.

В другом аспекте композиция вакцины против гриппа содержит аттенуированный вирус гриппа.

Согласно другому способу вакцина против гриппа включает вектор, включающий ген, кодирующий гемагглютинин вируса гриппа.

Предпочтительно вектор представляет собой поксвирус.

В частном аспекте вектор также включает ген, кодирующий нейраминидазу вируса гриппа.

Согласно другому аспекту композиция вакцины также содержит адъювант.

Согласно одному варианту осуществления способа согласно изобретению гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, имеют разные подтипы.

Согласно другому варианту осуществления гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, имеют один и тот же подтип.

Согласно еще одному варианту осуществления гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, является идентичным.

Согласно еще одному варианту осуществления вирус гриппа, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, идентичен вирусу гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур.

В особенно предпочтительном варианте осуществления гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, имеет подтип H5, H6, H7 или H9.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, имеет подтип H5 или H7.

В частном аспекте способ согласно изобретению включает дополнительную стадию очистки вируса.

В другом частном аспекте способ согласно изобретению включает дополнительную стадию инактивации вируса.

Изобретение также относится к вакцине против гриппа, полученной с использованием способа согласно изобретению.

Объектом изобретения также является применение способа согласно изобретению для получения вакцины для использования в профилактике гриппа.

В частном аспекте применение способа согласно изобретению служит для получения вакцины для использования в профилактике пандемий человеческого гриппа.

В другом частном аспекте применение способа согласно изобретению служит для получения вакцины для использования в профилактике эпидемий человеческого гриппа.

Оно также относится к способу профилактики инфекции эпидемическим штаммом вируса гриппа или пандемическим штаммом вируса гриппа у человека, причем указанный способ включает введение человеку эффективного количества вакцины против гриппа, полученной с использованием способа согласно изобретению.

В еще одном аспекте применение способа согласно изобретению служит для получения вакцины для использования в профилактике гриппа у лошадей, свиней, собачьих, кошачьих, куньих и птичьих видов.

Изобретение также относится к способу профилактики гриппа у животного, выбранного из группы лошадей, свиней, собачьих, кошачьих, куньих и птичьих видов, причем указанный способ включает введение животному эффективного количества вакцины против гриппа, полученной с использованием способа согласно изобретению.

Объектом изобретения также является применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, для получения вируса гриппа.

Согласно предпочтительному аспекту применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, служит для получения вакцины против гриппа.

Наконец, согласно последнему аспекту применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, служит для получения вируса гриппа или получения вакцины против гриппа, согласно которому яйца содержат антитела, направленные к гемагглютинину вируса гриппа, и в частности, яйца содержат антитела, направленные к гемагглютинину вируса гриппа, имеющему подтип H5, H6, H7 или H9.

Подробное описание изобретения

Под вирусом гриппа понимают как вирус гриппа, происходящий от штамма дикого типа, так и вирус гриппа, происходящий от штамма-реассортанта, который является результатом перегруппировки геномных сегментов одного или более штаммов дикого типа с «мастер»-штаммом, выбранным на основании его высокой способности к росту в яйце. Штамм-реассортант приобретает характеристики «мастер»-штамма, но сохраняет по меньшей мере характеристики HA и NA штамма дикого типа, что означает, что идентичность между последовательностью белка HA и NA штамма-реассортанта и последовательностью белка HA и NA штамма дикого типа, определенная посредством программы полного выравнивания, составляет по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% и еще более предпочтительно 100%. Штамм-реассортант может быть получен совместной инфекцией чувствительной клетки штаммом дикого типа и «мастер»-штаммом с последующими подходящими средствами селекции желаемого штамма-реассортанта. Он может также быть получен обратной генетикой из нуклеиновых кислот штамма дикого типа и «мастер»-штамма и экспрессией в мультиплазмидных системах экспрессии, как описано в WO 01/83794 и WO 03/091401 и в Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96:9345-9350 (1999). В случае высокопатогенных штаммов, таких как штаммы H5 и H7, модификация сайта расщепления, включающего множество основных аминокислот, может быть осуществлена таким образом, чтобы сделать штамм-реассортант низкопатогенным.

Для простоты языка, термин вакцинный штамм или вакцинный вирус используется без различия для обозначения вируса гриппа, используемого для получения вакцины против гриппа; точно так же термин инфицирующий штамм или инфицирующий вирус используется для обозначения вируса гриппа, служащего для инфекции биологического материала (яиц, животных).

Кроме того, термин яйца от вакцинированных кур используется для обозначения оплодотворенных кур, происходящих от кур, которые были предварительно вакцинированы и сведены с петухами.

В общем, вакцина против гриппа, используемая для вакцинации кур, может быть получена из любого штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм может быть вирусом типа А, но также и вирусом типа B или C. Когда он является штаммом вируса типа А, вирус может иметь любой подтип НА и/или любой подтип NA. Это могут, например, быть вирусные штаммы, имеющие подтип H1N1 или H3N2, в настоящее время ответственный за эпидемии человеческого гриппа типа А.

Вакцинация кур вирусом гриппа представляет большой интерес при условии, что вакцинация придает защиту против птичьего гриппа.

Птичий грипп может протекать незаметно или может быть характеризован рядом проявлений, часто респираторной и/или кишечной природы, большей или меньшей интенсивности, которые более или менее ослабляют общее состояние кур и которые могут привести к гибели животного, когда вирусный штамм является высокопатогенным. Птичий грипп обычно приводит к снижению или даже исчезновению яйцекладущей яйцо активности. Низкопатогенные штаммы вируса, принадлежащие к подтипам H6N2 или H9N2, или даже H5 или H7, обычно ответственны за легкие формы птичьего гриппа, обычно приводящие к снижению или исчезновению яйценоскости, но не к значительной летальности. С другой стороны, высокопатогенные штаммы вируса, принадлежащие к подтипам H5 и H7 (в особенности H5N1, H5N2, H5N9, H7N1, H7N4 или H7N7), являются очень вирулентными и вызывают очень высокую летальность в хозяйствах по разведению кур.

НА представляет собой антиген, который является существенным в развитии защитного иммунитета против гриппа. Вакцина, используемая в способе согласно изобретению, включает в своей композиции по меньшей мере НА одного из вирусов гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок.

Термин "ген" означает нуклеотидную последовательность, соответствующую открытой рамке считывания и кодирующую белок. Ген под контролем регуляторных последовательностей экспрессии (промотор, энхансер, сигнал полиаденилирования, сайт терминации транскрипции и т.д.) встроен в нуклеиновую кислоту вектора, в частности плазмиды или вируса, причем эти регуляторные последовательности могут быть такими, которые обычно ассоциированы с открытой рамкой считывания (эндогенные последовательности) или могут иметь другое происхождение (экзогенные последовательности).

НА может включать НА человеческого штамма вируса гриппа, но который не является патогенным для кур. Предпочтительно он содержит представляющий интерес НА, то есть НА, который имеет тот же самый подтип, как и НА вирусного штамма, который является ответственным за птичий грипп и против которого требуется иммунизация и защита кур. Предпочтительно степень идентичности между последовательностью белка НА, присутствующего в вакцине, и последовательностью белка НА, против которого требуется защита кур, составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, определенных посредством программы полного выравнивания (такой как программа Blast).

Вакцина, включающая НА, обычно находится в форме композиции, содержащей цельный инактивированный вирус гриппа или продукт, полученный из цельного инактивированного вируса гриппа.

Под продуктом, полученным из цельного инактивированного вируса , понимают инактивированную (то есть неинфекционную) вакцинную композицию, которая получена из штамма вируса и которая включает по меньшей мере НА указанного штамма вируса. Продукт, полученный из штамма цельного вируса, может представлять собой фрагментированный (или расщепленный) вирус и, в этом случае, говорят о «расщепленной» вакцине. Другой продукт, полученный из штамма цельного вируса, представляет собой НА этого штамма как таковой или связанный с NA, который был получен с использованием способов экстракции и очистки и, в этом случае, говорят о «субъединичной» вакцине. НА может также быть вторично встроен в виросому. Вакцинная композиция, содержащая цельный инактивированный вирус гриппа или продукт, полученный из цельного инактивированного вируса, может также содержать один или более адъювантов или составов адъюванта. В качестве неограничивающего примера составов адъюванта можно назвать эмульсии типа «вода-в-масле» или эмульсии типа «масло-в-воде», такие как эмульсия MF59® (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 183), составы на основе липосом и составы на основе MPL (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 pages 1186-187), авридина (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 148), диметилдиоктадециламмонийбромида (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 157), Corynebacterium parvum, сапонина, лизолецитина, плюрониловых производных (Hunter H. et al. 1991, vaccine, 9: 250-256) (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 200 and pages 297-311), солей алюминия или их комбинаций (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 pages 249-276). Предпочтительно эмульсии типа «вода-в-масле» состоят из парафинового масла, из гидрофильного поверхностно-активного вещества, такого как полисорбат 80 или полисорбат 85, и липофильного поверхностно-активного вещества, такого как сорбитан олеат или сорбитан триолеат. Примеры эмульсий, используемых в случае кур, описаны в Stone et al. (1983, Avian Dis., 27: 688-697; 1993; Avian Dis., 37: 399-405; 1991, Avian Dis., 35: 8-16); в M. Brugh et al. (1983, Am. J; Vet. Res., 44: 72-75); в Woodward L. et al. (1985, Vaccine, 3: 137-144); в (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 219). Вакцинный штамм обычно происходит от штамма дикого типа, который был выделен у кур, индеек, уток, гусей или других видов птиц, причем этот штамм обычно является низкопатогенным для кур. В качестве примера изолятов (штаммов дикого типа), используемых для получения вакцин для защиты кур против птичьего гриппа подтипа H5 или H7, можно назвать изоляты A/turkey/Wisconsin/68 или A/chicken/Italy/22A/98, которые являются вирусными штаммами, имеющими подтип H5N9, изоляты A/turkey/England/N-28/73, A/chicken/Mexico/238/94/CPA, A/chicken/Mexico/232/94/CPA или A/duck/Potsdam/1402/86, которые являются вирусными штаммами, имеющими подтип H5N2, изолят A/goose/Guandong/1/1996, который является вирусным штаммом HP, имеющим подтип H5N1, изоляты A/chicken/Italy/AG-473/1999 или A/chicken/Italy/1067/1999, которые являются вирусными штаммами, имеющими подтип H7N1, изолят A/chicken/Pakistan/95, который является штаммом HP, имеющим подтип H7N3, и изолят A/duck/Potsdam/15/80, который является вирусным штаммом, имеющим подтип H7N7. В качестве примера вирусных штаммов H9N2, используемых для защиты домашней птицы против птичьего гриппа подтипа H9, можно назвать изоляты A/chicken/Iran/AV12221/98 и A/chicken/UAE/415/99. В качестве примера вирусного штамма H6N2, используемого для защиты кур против птичьего гриппа подтипа H6, можно назвать изолят A/turkey/Italy/90. Вакцинные штаммы, используемые для получения вакцин, могут также быть реассортантами штаммов дикого типа, полученными, в частности, обратной генетикой. Можно, в частности, назвать вакцинный штамм Re-1, который является штаммом-реассортантом, полученным обратной рекомбинацией штамма дикого типа H5N1 A/goose/Guandong/1/96 с «мастер»-штаммом A/PR/8/34, который очень хорошо размножается в яйцах (Tian et al., 2005, Virology, 341: 153-162). Другим примером штамма-реассортанта, полученного обратной генетикой, является штамм H5N3, полученный генетической перегруппировкой и содержащий гемагглютинин H5 штамма H5N1 A/chicken/Vietnam/C58/04, нейраминидазу штамма H2N3 A/duck/Germany/1215/73 и внутренние гены «мастер»-штамма A/PR/8/34 (Webster et al., 2006, Virology, 351: 301-311).

Вакцины против птичьего гриппа обычно содержат вирус единственного инактивированного штамма вируса гриппа (моновалентные вакцины), но, в некоторых случаях, может быть выгодно использовать поливалентные вакцины, содержащие несколько инактивированных штаммов вируса гриппа. В частности, это может быть вакцина, основанная на штаммах H7N1 и H5N9, которая является эмульсией типа «вода-в-масле», содержащей инактивированные вакцинные штаммы A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9) и A/chicken/Italy/1067/1999 (H7N1). Инактивированные вакцины могут также содержать другие валентности, например, двухвалентная вакцина против птичьего гриппа H9N2 и болезни Ньюкасла. Инактивированные вакцины обычно вводят парентерально (внутримышечно или подкожно). Они могут также вводиться в форме спрея, как в случае вакцины Aerovac AI, выпускаемой Investigacion Aplicada, которая содержит инактивированный вакцинный штамм A/chicken/Mexico/232/94/CPA (H5N2). Схема иммунизации обычно включает одно или два введения с интервалом в 2-4 недели. Вводимая доза вакцины варьирует в зависимости от возраста животных, но обычно содержит эквивалент 10-200 мкл аллантоисной жидкости, имеющей титр 10⁸ -10¹⁰ EID₅₀/мл перед инактивацией. Дозу вакцины обычно вводят в объеме в пределах от 0,05 до 1 мл. Получение инактивированных вакцин против птичьего гриппа описана H. Stone (1987, Avian Dis. 31: 483-490). Поскольку подтип НА вакцинного штамма является тем же самым, как НА штамма, ответственного за патогенный птичий грипп, и на основе степени идентичности между последовательностями белка этих двух НА порядка от 80% до 90%, определяемой посредством программы полного выравнивания, степень защиты, полученная против клинических симптомов птичьего гриппа (осложненное течение и летальность), обычно составляет более 80%, и предпочтительно более 90%. Это подтверждено исследованиями M. Bublot et al., 2007, Avian Dis. 51: 332-337, которые показывают, что степень идентичности порядка от 80% до 90% между последовательностью белка НА вакцинного штамма и последовательностью белка НА патогенного инфекционного штамма достаточна, чтобы получить эту степень защиты. Кроме того, для того чтобы получить эту степень защиты, не является необходимым, чтобы подтип NA вакцинного штамма был тем же самым, что и подтип NA патогенного инфекционного штамма. Кроме того, птичьи вакцины против гриппа значительно уменьшают экскрецию вируса у вакцинированных животных, привитых инфекционным вирусом, что демонстрируется явным снижением вирусной нагрузки, наблюдаемой в оральных и клоакальных пробах (M. Bublot et al., 2007, Avian Dis. 51: 332-337). Другое благоприятное воздействие вакцин против птичьего гриппа заключается в уменьшении диффузии вируса в хозяйствах по разведению кур.

Согласно другому варианту осуществления способа согласно изобретению, вакцина, используемая для иммунизации кур, находится в форме композиции, включающей аттенуированный штамм вируса гриппа. Вакцинный штамм находится обычно в форме реассортанта, который был отобран в результате генетической перегруппировки между штаммом дикого типа, экспрессирующим представляющий интерес НА, и, возможно, представляющую интерес NA, и «мастер»-штаммом, который был адаптирован к холоду и/или который является чувствительным к температуре. Реассортант представляет собой вирусный штамм, который экспрессирует на своей поверхности представляющие интерес НА и, возможно, NA, в то же самое время сохраняя фенотипические характеристики «мастер»-штамма, которые касаются его способности к репликации только в узких пределах температур, ниже внутренней температуры птиц. В результате вакцинный штамм, после его введения курам, реплицируется ограниченным образом и локально. Способы получения этих штаммов-реассортантов известны специалисту и описаны, в частности, в WO 03/091401 и WO 2006/063053 и Wareing M.D. et al., 2002, Vaccine 20: 2082-2090. Введение вакцины обычно осуществляют распылением. Другое средство получения аттенуированного штамма состоит в усечении гена, кодирующего белок NS1 (Richt J.A. et al., Vaccination of pigs against swine influenza viruses by using an NS1-truncated modified live-virus vaccine, 2006, J. Virol., 80: 11009-18; Quinlivan M. et al., Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein, 2005, J. Virol., 79: 8431-9).

Вакцинные штаммы могут быть получены любым способом с использованием методик культуры на клетках, таких как клетки Vero, клетки MDCK, клетки PER.C6 или клетки куриного эмбриона (CEK, PCJ) и/или с использованием обычных способов получения на яйцах с развивающимся эмбрионом. Способы сбора, очистки и, в случае необходимости, инактивации вируса также известны специалисту.

Согласно другому варианту осуществления способа согласно изобретению вакцина находится в форме белков, полученных в системе экспрессии in vitro. Например, НА может быть получен в системе экспрессии с использованием рекомбинантного бакуловируса в клетках насекомого (Crawford J. et al., Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes, 1999, Vaccine, 17: 2265-74). Гемагглютинин может также экспрессироваться in vitro в форме вирусоподобных частиц (VLP) (Prel A. et al., Assessment of the protection afforded by triple baculovirus recombinant coexpressing H5, N3, M1 proteins against a homologous H5N3 low-pathogenicity avian influenza virus challenge in Muscovy ducks, 2007, Avian Dis., 51: 484-9; Pushko P. et al., Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, и M1 proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice, 2005, Vaccine, 23: 5751-9) или псевдотипа на основе ретровируса (Szecsi J. et al., 2006, Virol. J., 3: 70). Белки, полученныеin vitro, или полученные вирусные частицы более или менее очищают и затем объединяют с различными адъювантами, такими как используемые в инактивированных вакцинах.

Согласно другому варианту осуществления способа согласно изобретению вакцина против гриппа включает вектор, включающий фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий НА вируса гриппа.

Термин "вектор" относится к структурам нуклеиновой кислоты, которые могут быть распространены в и/или перенесены в организмы, клетки или компоненты клеток. Это включает, в частности, плазмиды, вирусы, бактериофаги, провирусы, фагмиды и искусственные хромосомы, которые являются способными к автономной репликации или которые могут интегрироваться в хромосому клетки-хозяина.

Под вектором, включающим ген, кодирующий НА вируса гриппа понимают вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющие интерес НА и/или NA, и который, после введения в птичью клетку, экспрессирует в этой клетке НА и/или NA. Это может быть плазмида, экспрессирующая представляющий интерес НА, но обычно вектор представляет собой вирусный вектор, содержащий в своем геноме нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес НА, и экспрессирующий представляющий интерес НА в инфицированных клетках. Интеграцию нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес НА, в геном вирусного вектора обычно осуществляют методиками молекулярной биологии, в частности, генетической рекомбинации, клонирования, обратной генетики и т.д. НА может экспрессироваться или не экспрессироваться на поверхности вирусного вектора. Предпочтительно, вирусный вектор аттенуируют обычным образом множественными пассажами in vitro или делецией некоторых генов таким образом, чтобы репликация векторного вируса в птичьих клетках была достаточно ограничена и не оказывала никакого эффекта на общее состояние кур, и таким образом, вирус считался бы непатогенным. В качестве примера вирусных векторов можно назвать птичьи парамиксовирусы (Ge J., et al., Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses, 2007, J Virol., 81: 150-8); вирус индюшачьего герпеса (HVT) или вирус болезни Марека (Sondermeijer et al., 1993, Vaccine, 11, 349-358); вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV) (Veits J., et al., Deletion of the non-essential UL0 gene of infectious laryngotracheitis (ILT) virus leads to attenuation in chickens, and UL0 mutants expressing influenza virus hemagglutinin (H7) protect against ILT and fowl plague, 2003, J Gen. Virol., 84: 3343-52; Luschow D. et al., Protection of chickens from lethal avian influenza A virus infection by live-virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the hemagglutinin (H5) gene, 2001, Vaccine, 19: 4249-59); аденовирусы (Francois A. et al., Avian adenovirus CELO recombinants expressing VP2 of infectious bursal disease virus induce protection against bursal disease in chickens, 2004, Vaccine, 22: 2351-60; Gao W. et al., Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization, 2006, J Virol., 80: 1959-64; Toro H. et al., Protective avian influenza in ovo vaccination with non-replicating human adenovirus vector, 2007, Vaccine, 25: 2886-91); коронавирусы (Cavanagh, 2007, Vet Res. 38: 281-97; Eriksson, 2006, Clin. Dev. Immunol. 13: 353-60), но предпочтительно для вакцинации кур используют поксвирусы, в частности вирус осповакцины, NYVAC (делетированный вирус осповакцины), штамм MVA вируса осповакцины, в частности вирус оспы птиц, особенно вирус оспы канареек, ALVAC (аттенуированный вирус оспы канареек), вирус оспы голубей, вирус оспы перепелов, вирус оспы индеек, вирус оспы воробьев и наиболее предпочтительно вирус оспы домашней птицы, TROVAC (аттенуированный вирус оспы кур), которые описаны, в частности, в AU 701599B и AU 701781B и в US 5 756 103. В зависимости от случая аттенуированные вирусные векторы экспрессируют только представляющий интерес НА: в частности, это относится к вакцине, содержащей вектор на основе вируса оспы кур TROVAC, экспрессирующий НА штамма вируса гриппа H5N8 (A/turkey/Ireland/1378/83). В других случаях аттенуированный вирусный вектор экспрессирует представляющий интерес НА в комбинации с представляющим интерес NA, как рекомбинантный поксвирус, описанный в 2003, Avian Pathology, 32: 25-32, который экспрессирует как HA, так и NA, происходящие от штамма вируса гриппа H5N1. Представляющей интерес NA является NA, которая обычно имеет тот же самый подтип, как NA вирусного штамма, против которого требуется иммунизация и защита кур. В других случаях аттенуированные векторы экспрессируют несколько представляющих интерес НА, принадлежащих к различным подтипам, как в случае рекомбинантного поксвируса, описанного MingXiao M. et al., 2006, Vaccine, 24: 4304-4311, который экспрессирует подтипы как H5, так и H7. Иммуногенная способность этих векторов может быть дополнительно усилена введением в них генов, кодирующих цитокины и/или хемокины, которые оказывают иммуностимулирующее действие, такие как IL-1, IFN, CSF, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-18 или TNF 5 (Vaccine, (2006), 24: 4304-4311). Вакцины на основе векторов, кодирующих НА вируса гриппа, могут также сочетаться с адъювантами для усиления их иммуногенности.

Вакцинные композиции, содержащие вирусные векторы, могут вводиться различными путями, которые зависят, в частности, от вектора: например, прокалыванием мембраны крыла (поксвирусный вектор), внутримышечным, подкожным или чрескожным путем с использованием или без использования иглы (любой вектор), путемin ovo (в 17-19-дневное яйцо с развивающимся эмбрионом; например, HVT/Marek и аденовирусный вектор), через глаз или носо-ротовым путем, в форме спрея или в питьевой воде (парамиксовирусный, коронавирусный, аденовирусный вектор), в одной или двух инъекциях с интервалом по меньшей мере в 15 дней. Вводимая доза вакцины составляет величину порядка от 1 до 7log₁₀ 50% инфекционной единицы, предпочтительно от 2 до 4log₁₀ для векторов на основе вируса оспы кур. Преимущество вакцинации, основанной на вирусном векторе, по сравнению с обычной вакцинацией с использованием инактивированного или аттенуированного цельного вируса гриппа заключается в том факте, что вакцинированных животных можно отличить от инфицированных животных. Кроме того, вакцинация вирусным вектором способствует развитию клеточного иммунитета, который может усилить защиту животных. Как показано в Avian Dis., (2007), 51: 325-331 and Avian Dis., (2007), 51: 498-500, степень защиты, полученной у кур, и уменьшение диффузии вируса на птицефермах имеет тот же самый порядок, как тот, который наблюдается с обычной вакциной, содержащей инактивированный вирус гриппа. Когда вакцинация кур включает несколько инъекций, вакцина, используемая в первом введении, может быть отличной от используемой во второй инъекции или последующих инъекциях. Могут использоваться два различных аттенуированных вирусных вектора, например рекомбинантный вектор ALVAC, экспрессирующий представляющий интерес НА, в первой иммунизации и рекомбинантный вектор TROVAC или NYVAC, экспрессирующий тот же самый представляющий интерес НА, в последующих иммунизациях, таким образом, что гуморальный иммунный ответ, направленный против вектора ALVAC, не препятствует инфекции клеток кур рекомбинантным вектором TROVAC или NYVAC и, следовательно, экспрессии НА в инфицированных клетках. Также возможно использовать так называемый способ prime boost , который состоит в использовании, в первой инъекции, аттенуированного вирусного вектора, экспрессирующего НА, и в использовании, в повторной(ых) инъекции(ях), вакцины, содержащей, например, один или более инактивированных вакцинных штаммов, принадлежащих тому же самому подтипу, что и НА, используемый в первой иммунизации, или, альтернативно, можно действовать в обратном порядке. Наконец, возможно осуществить вакцинацию ДНК в первой инъекции, используя плазмиду, экспрессирующую представляющий интерес НА, с последующими повторными инъекциями, используя вакцину, содержащую инактивированный вакцинный штамм и/или аттенуированный вирусный вектор, которые экспрессируют НА, принадлежащий к тому же самому подтипу, как и НА, используемый в первой иммунизации или который является идентичным НА, используемому в первой иммунизации.

Безотносительно типа вводимой вакцины или принятой схемы вакцинации, защита кур против птичьего гриппа обеспечивается весьма быстро, обычно в пределах периода от 7 до 18 дней после введения вакцинной дозы. Однако, чтобы гарантировать защиту кур против птичьего гриппа в течение их яйцекладущей активности, которая длится приблизительно один год, рекомендуются одна или две повторных вакцинации, которые выполняют в пределах периода от 3 до 16 недель после первого введения вакцины. Несколько схем вакцинации инактивированными вакцинами могут использоваться у кур-несушек: например, 2 инъекции, первая в возрасте от 3 до 6 недель и вторая в возрасте от 16 до 19 недель, как раз перед наступлением яйценосного возраста, или 3 инъекции, первая в возрасте приблизительно от 2 до 4 недель, вторая от 3 до 4 недель спустя и третья в возрасте от 16 до 19 недель, как раз перед наступлением яйценосного возраста. Повторная вакцинация может также осуществляться в течение яйценосного возраста. В схеме prime-boost с использованием 2 различных вакцин цыплята могут быть вакцинированы в возрасте 1 день вакциной на основе вектора, представляющего собой вирус оспы кур; они впоследствии получают одну (в возрасте от 16 до 19 недель, как раз перед наступлением яйценосного возраста) или две (в возрасте от 3 до 6 недель и в возрасте от 16 до 19 недель, как раз перед наступлением яйценосного возраста) иммунизации вакциной, содержащей инактивированный вирус гриппа.

В осуществлении способа согласно изобретению яйца предпочтительно забирают от кур, как только обеспечена защита кур против птичьего гриппа, что обычно происходит в пределах периода от 7 до 18 дней после введения вакцины (Bublot M. et al. (2006, Annals of the New York Academy of Sciences 1081: 193-201); Van der Goot et al. (2005, Proc. Natl. Acad. Sc., 102: 18141-6); Ellis et al. (Avian Pathol. 2004, 33, 405-412)).

Несмотря на наличие антител против гриппа в яйцах вакцинированных кур, особенно антител, направленных к НА, и в частности, антител, ингибирующих гемагглютинацию (IHA), которые блокируют проникновение вируса гриппа в чувствительные клетки, обычным является способ, используемый для получения вируса гриппа из яиц с развивающимся эмбрионом, происходящих от кур, вакцинированных против гриппа. Используют 9-14-дневные яйца с развивающимся эмбрионом, происходящие от вакцинированных кур, которые были выращены предпочтительно в контролируемой среде. Процесс эмбриогенеза контролируют следующим образом: используются яйца, которые были сохранены при температуре от 10 до 20°C, предпочтительно от 16 до 18°C, в течение периода, который обычно не превышает одну неделю после отложения. Процесс эмбриогенеза инициируют, инкубируя яйца при температуре 37,5°C±1°C во влажной камере, имеющей относительную влажность 70±10% сроком от 9 до 14 дней. Яйца с развивающимся эмбрионом отбирают проверкой сквозным просвечиванием, и их аллантоисные полости инфицируют дозой вируса обычно от 2 до 7log ₁₀ TCID₅₀ в небольшом объеме (приблизительно от 0,1 до 0,2 мл). Вирусу дают размножаться в течение периода обычно от 1 до 4 дней в зависимости от вирулентности вирусного штамма и при температуре, которая может также варьировать в зависимости от фенотипа вирусного штамма и его степени адаптации к холоду или к теплу. Температура для размножения вируса гриппа обычно находится в диапазоне от 28 до 39°C и обычно в диапазоне температур от 33 до 39°C. Инфекционные аллантоисные жидкости затем собирают и обрабатывают в зависимости от предполагаемого использования.

Этот способ может использоваться для получения вируса гриппа, чей подтип НА отличен от подтипа НА, содержащегося в вакцине, которая использовалась для вакцинации кур. Это, например, случай, когда кур вакцинируют инактивированным вирусом H5N9, чтобы защитить кур против птичьего гриппа H5, в то время как яйца от этих кур инфицируют вирусом гриппа H1N1 или H3N2, или даже вирусом гриппа типа B, чтобы получить вакцину против эпидемических форм циркулирующего человеческого гриппа. Согласно варианту способа согласно изобретению подтип НА вируса гриппа, который получен с использованием яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, имеет подтип, который является отличным от НА, который использовался для вакцинации кур, но, с другой стороны, NA полученного вируса гриппа имеет тот же самый подтип, как NA вируса, используемого в вакцине. Это, например, случай, когда кур вакцинировали инактивированным вирусным штаммом H5N1 или рекомбинантным поксвирусом, экспрессирующим H5 и N1, чтобы защитить кур против птичьего гриппа, в то время как яйца с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур инфицировали вирусным штаммом H1N1.

Согласно другому варианту способа согласно изобретению НА вируса гриппа, полученного на яйцах с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур, имеет тот же самый подтип, как НА, содержащийся в вакцине, которая использовалась, для вакцинации кур. Это, например, случай, где кур вакцинируют инактивированным вирусом H5N1 или рекомбинантным поксвирусом, экспрессирующим H5, в то время как яйца от вакцинированных кур инфицируют вирусом гриппа H5N1 или H5N9. Несмотря на присутствие "подтип"-специфических перекрестно-реактивных антител анти-НА в яйце (это случай, когда НА, содержащийся в вакцинной композиции, имеет тот же самый подтип, как и НА штамма вируса гриппа, инфицирующего яйца с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур), это не оказывает никакого негативного эффекта на репликацию вируса.

Кроме того, еще более удивительно, эта репликация не затрагивается также в случае, когда существует полная идентичность между вирусом гриппа, который использовался для инфицирования яиц с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур, и вирусом гриппа, который использовался для вакцинации этих кур. В этом случае это отражается присутствием в яйцах еще более обширной группы антител анти-НА, поскольку в ней обнаруживаются одновременно перекрестно-реактивные подтип-специфические антитела анти-НА, которые являются очень специфическими для штамма (также называемые штамм-специфическими антителами) (см. пример 3). Поэтому, вопреки широко распространенному мнению, присутствие в яйце антител против гриппа, и в особенности присутствие антител анти-НА, не воздействует на репликацию вируса гриппа. Количества вируса и/или гемагглютинирующего антигена, собранного в инфицированных аллантоисных жидкостях, происходящих из яиц от кур, вакцинированных против гриппа, имеют тот же самый порядок, как собранные в инфицированных аллантоисных жидкостях, происходящих из яиц от невакцинированных кур (см. примеры 1 и 2).

Способ согласно изобретению может также быть использован для получения вирусного штамма-реассортанта. В этом случае, на первой стадии, яйца с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур совместно инфицируют штаммом вируса дикого типа и «мастер»-штаммом вируса, который хорошо реплицируется в яйцах с развивающимся эмбрионом, например штамма A/PR/8/34. На второй стадии собирают инфицированные аллантоисные жидкости, содержащие по существу смесь реассортантов и «мастер»-штамма, в то время как штамм дикого типа, который не столь способен к размножению, находится обычно в очень малом количестве. Штамм-реассортант, экспрессирующий в то же самое время фенотипические характеристики штамма A/PR/8/34 (то есть его хорошую способность к репликации в яйцах с развивающимся эмбрионом), и НА, а также NA штамма дикого типа затем отбирают с последовательными стадиями клонирования, смешивая, на каждой стадии клонирования, собранную инфекционную аллантоисную жидкость с антителами анти-НА и анти-NA, специфическими для A/PR/8/34, согласно способам, известным специалисту. Также возможно получить адаптированный к холоду и чувствительный к высокой температуре штамм-реассортант в целях получения живой аттенуированной вирусной вакцины. В этом случае, на первой стадии, яйца с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур совместно инфицируют штаммом вируса дикого типа и «мастер»-штаммом, который имеет фенотипическую характеристику адаптации к холоду и чувствительности к высокой температуре. В этом случае температура для инкубации инфицированных яиц представляет собой температуру, которая ниже нормальной (эта температура часто бывает ниже 35°C или даже ниже 30°C). На второй стадии собирают инфицированные аллантоисные жидкости, содержащие по существу смесь реассортантов и «мастер»-штамма, поскольку чувствительный к холоду штамм дикого типа не реплицировался. Затем отбирают реассортант, экспрессирующий одновременно фенотипические характеристики «мастер»-штамма (в частности, адаптацию к холоду и/или термочувствительность) и НА, а также NA штамма дикого типа, с последовательными стадиями клонирования, смешивая, на каждой стадии клонирования, собранную инфекционную аллантоисную жидкость с антителами анти-НА и анти-NA, специфическими для «мастер»-штамма, согласно способам, известным специалисту.

Способ согласно изобретению осуществляют в первую очередь для получения вакцин, предназначенных для защиты хозяйств по разведению кур и в более общем смысле по разведению домашней птицы (уток, индеек, гусей и т.д.) против птичьего гриппа. Вирусные штаммы, вовлеченные в бессимптомные или умеренные формы птичьего гриппа, могут иметь любой подтип, и в особенности подтипы H9N2, H6N2, H7N2, H7N3 или H7N1. Они не вызывают никакой реальной летальности на птицефермах, но могут быть причиной временного снижения продукции яиц. Высокопатогенные вирусные штаммы, вовлеченные в серьезные формы птичьего гриппа, которые вызывают высокую летальность на птицефермах, принадлежат обычно к подтипам H5 и H7, и в особенности H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, H7N1, H7N3, H7N4 или H7N7.

Вообще, гемагглютинин вируса гриппа, содержащийся в вакцинной композиции, которая используется для вакцинации кур против птичьего гриппа на стадии a) способа согласно изобретению, и гемагглютинин вируса, который используется для инфицирования яиц с развивающимся эмбрионом на стадии c) способа, имеют один и тот же подтип и отобраны в особенности из подтипов H5, H6, H7 и H9, так как это подтипы, которые обнаруживаются преимущественно в вирусных штаммах, ответственных за птичий грипп.

В частном аспекте, гемагглютинин вируса гриппа, содержащийся в вакцинной композиции, которая используется для вакцинации кур против птичьего гриппа на стадии a) способа согласно изобретению, и гемагглютинин вируса, который используется для инфицирования яиц с развивающимся эмбрионом на стадии c) способа, имеют один и тот же подтип и отобраны из подтипов H5 и H7, так как это подтипы, которые обнаруживаются в вирусных штаммах, ответственных за серьезные формы птичьего гриппа и человеческого гриппа. Вирусные штаммы, ответственные за серьезные формы птичьего гриппа и/или человеческого гриппа, которые были охарактеризованы, обычно принадлежат к подтипам H5N1, H5N2, H7N1, H7N3 или H7N7.

Таким образом, в частности, объектом изобретения является:

Способ получения вируса гриппа, согласно которому:

a. кур вакцинируют цельным инактивированным вирусом гриппа, согласно которому гемагглютинин вируса имеет подтип H5 или H7,

b. от вакцинированных кур берут яйца,

c. инициируют процесс эмбриогенеза,

d. яйца с развивающимся эмбрионом инфицируют, вводя в аллантоисную полость яиц с развивающимся эмбрионом вирус гриппа, идентичный тому, который использовали для иммунизации,

e. инфицированные яйца с развивающимся эмбрионом инкубируют в условиях температуры и влажности, которые обеспечивают репликацию вируса,

f. собирают аллантоисную жидкость, содержащую вирус.

Когда схема вакцинации кур предполагает две инъекции, первая инъекция может быть выполнена с вакцинной композицией, которая содержит, вместо цельного инактивированного вируса гриппа, вектор, обычно поксвирусный, включающий ген, который кодирует гемагглютинин вируса гриппа подтипа H5 или H7.

Когда инфицированные аллантоисные жидкости предназначены для получения вакцины против гриппа, способ согласно изобретению обычно включает дополнительную стадию очистки вирусного штамма и, в случае необходимости, последующую или предшествующую стадию инактивации вируса с использованием способов, известных специалисту, таких как описанные в FR 2201079 или в FR 1538322.

Очистка может быть поверхностной и может быть ограничена стадией концентрации вируса центрифугированием, обычно после осветления инфицированных аллантоисных жидкостей. Очистка может быть дополнена стадией зонального центрифугирования, осуществляемой, например, посредством градиентов плотности сахарозы (ЕР 0 7760362). Для очистки вируса могут также быть осуществлены хроматографические способы. Таким образом получают суспензию очищенных цельных вирусов, которые идут на композицию инактивированных цельных вакцин или аттенуированных вакцин.

Инактивацию вирусной суспензии осуществляют обычными средствами, используя -пропиолактон (E. Budowsky et al. 1991, Vaccine, 9: 319-325; 1991, Vaccine, 9: 398-402; 1993, Vaccine, 11: 343-348), этиленимин или производные (D. King 1991, Avian Dis. 35: 505-514) или формальдегид (ЕР 0 776 0362).

Вакцинная композиция, основанная на цельных инактивированных вирусах, может быть составлена с одним или более адъювантами. Хотя обычно эти вакцины могут быть составлены с солями алюминия или в виде эмульсии типа "вода-в-масле" или эмульсии типа "масло-в-воде" (в случае вакцин против птичьего гриппа), обычно используется эмульсия типа "вода-в-масле", составленная из парафинового масла, из гидрофильного поверхностно-активного вещества, такого как полисорбат 80, полисорбат 83 или полисорбат 85, и липофильного поверхностно-активного вещества, такого как сорбитан олеат, сорбитан сесквиолеат или сорбитан триолеат. Может использоваться любой адъювант, способный усиливать гуморальный и/или клеточный ответ против гриппа. В качестве неограничивающих примеров составов адъюванта можно назвать эмульсии MF59®, составы на основе липосом и составы на основе MPL, Corynebacterium parvum, сапонина, лизолецитина, плюрониловых производных или их комбинаций.

Очищенная вирусная суспензия может быть также подвергнута последующим обработкам. Таким образом получают продукты, являющиеся производными вируса гриппа. Вирусная суспензия может быть фрагментирована с использованием детергентов или растворителей липидов согласно способам, известным в области получения, например вакцин, основанных на фрагментированных или расщепленных вирусах, виросом или субъединичных вакцин, содержащих гемагглютинин вируса гриппа. Фрагментированные или расщепленные вирусы, виросомы, содержащие гемагглютинин вируса гриппа, и субъединичные вакцины, содержащие гемагглютинин вируса гриппа, которые получены из очищенного вируса, считаются продуктами, являющимися производными вируса гриппа. Вакцины, содержащие эти производные продукты, могут аналогично быть составлены с одним или более адъювантами.

Вакцины, полученные посредством способа согласно изобретению, предназначены для использования в защите людей и животных против гриппа.

В ветеринарной области вакцина главным образом используется в области профилактики птичьего гриппа, но она может также использоваться для профилактики или уменьшения симптомов гриппа и/или экскреции вируса у представителей семейства лошадиных, в частности у лошадей, у представителей семейства псовых, в частности у собак, у представителей семейства кошачьих, в частности у кошек, у представителей семейства свиней, в частности у свиней, у представителей семейства куньих, в частности у норок и хорьков, и у птичьих видов, в частности, у кур, уток, индеек, перепелов, цесарок, гусей и страусов. Когда вакцинная композиция содержит цельный инактивированный вирусный штамм или продукт, являющийся его производным, ее обычно вводят подкожно или внутримышечно, или она может вводиться в форме распыленного материала на птицефермах. Когда вакцина находится в форме живого аттенуированного вируса, ее обычно вводят через нос и рот, распылителем, в питьевой воде или в форме глазных капель. Схема вакцинации обычно предусматривает инъекцию или инъекцию с последующим повтором. Вводимая доза вакцины зависит от размера и возраста животного. Она обычно содержит от 20 до 200 мкл аллантоисной жидкости, имеющей титр от 10⁸ до 10¹⁰ EID₅₀/мл перед инактивацией, введенной в объеме от 0,05 до 1 мл.

У человека вакцину используют в области профилактики эпидемического гриппа и пандемического гриппа. В то время как эпидемический грипп воздействует на человеческую популяцию, уже сенсибилизированную путем контакта (инфекции) или вакцинации одним (или более) штаммом (штаммами) вируса гриппа, для которого существует антигенное родство с НА вирусного штамма, ответственного за эпидемию, и у которой имеется определенный иммунитет, даже если он является только частично эффективным, пандемический грипп воздействует на человеческую популяцию, не сенсибилизированную к новому штамму вируса, потому что НА этого нового штамма не имеет или имеет слишком слабое антигенное родство с предшествующими циркулирующими вирусными штаммами.

Вакцина против эпидемического гриппа предназначена для защиты человеческой популяции против сезонных форм гриппа, вызванных сезонными циркулирующими штаммами вируса гриппа, которые имеют антигенное родство с предшествующими вирусными штаммами, которые уже циркулировали. В настоящее время штаммы вируса гриппа, ответственные за эпидемический грипп, которые являются эпидемическими штаммами вируса гриппа, имеют тип A и принадлежат к подтипам H1N1 или H3N2, или имеют тип B.

Вакцина против пандемического гриппа предназначена для защиты человеческой популяции против инфекции пандемическим штаммом вируса гриппа, который является новым штаммом вируса гриппа, который не имеет никакого антигенного родства в отношении НА с предшествующими циркулирующими вирусными штаммами.

Вакцина против эпидемического или пандемического гриппа может быть в форме живой аттенуированной вакцины или инактивированной вакцины, хотя инактивированная вакцина является предпочтительной для профилактики пандемического гриппа. Вакцина может быть в форме моновалентной вакцины (вакцина, полученная из единственного штамма вируса гриппа) или поливалентной вакцины (вакцина, полученная из нескольких штаммов вируса гриппа). Композиция вакцины против эпидемического гриппа находится в настоящее время в форме трехвалентной вакцины, полученной из штаммов H3N2 и H1N1 и из вирусного штамма типа B. Инактивированная вакцина находится обычно в форме цельного вируса, фрагментированного вируса (расщепленного вируса) или виросом, или в субъединичной форме, содержащей НА, и может содержать один или более адъювантов, таких как упомянутые выше. В то время как живую аттенуированную вакцину обычно вводят перорально или через нос, чтобы поддержать развитие иммунитета на уровне слизистой оболочки, инактивированная вакцина может вводиться парентерально (внутримышечно или подкожно), внутрикожно или даже через слизистую оболочку (внутриносовым путем), или даже комбинацией двух различных путей введения, как описано в WO 01/22992. Схема вакцинации обычно предусматривает инъекцию или инъекцию с последующим повтором. Вводимая доза вакцины зависит от возраста человека и от присутствия или отсутствия адъюванта. Обычно вакцинная доза содержит эквивалент 15 мкг НА каждого вакцинного штамма, содержавшегося в вакцине. Эта доза может быть уменьшена приблизительно до 1-2 мкг НА, когда вакцина содержит адъюванты, или увеличена до 30 мкг НА или даже больше в случае пожилых людей или людей, страдающих иммунодефицитом.

Наконец, объектом изобретения является: Применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, для получения вирусов гриппа или для получения вакцины против гриппа. Вопреки широко распространенному мнению, присутствие в яйцах от вакцинированных кур антител, направленных к гемагглютинину вируса гриппа, не воздействует на количество вируса гриппа, который получают после инфекции их аллантоисных полостей.

Следующие примеры иллюстрируют неограничивающим образом различные варианты осуществления изобретения.

Фигура 1 представляет полную нуклеотидную последовательность донорской плазмиды pJY1394.1.

Фигура 2 представляет нуклеотидную последовательность вставки в донорской плазмиде pJY1394.1, включающей фрагменты, примыкающие к локусу вставки F8, а также промотор вируса осповакцины H6 с последующим синтетическим геном, модифицированным на уровне сайта расщепления, кодирующим НА штамма A/chicken/Indonesia/7/03.

Происхождение этих различных последовательностей является следующим:

- От 1 до 53: частичная последовательность плазмиды клонирования, включающей последовательность праймера M13F (подчеркнуто).

- От 54 до 1483: последовательность левой руки , примыкающая к локусу вставки F8 в геноме вектора на основе вируса оспы кур TROVAC.

- От 1484 до 1568: последовательность линкера между левой рукой и промотором H6.

- От 1569 до 1692: последовательность промотора H6 вируса осповакцины.

- От 1693 до 3387: последовательность модифицированного синтетического гена НА штамма A/chicken/Indonesia/7/03; аминокислотная последовательность обозначена выше последовательности нуклеотида с использованием 1-буквенного кода для обозначения аминокислот.

- От 3388 до 3414: последовательность линкера между геном НА и правой рукой, включающая последовательность TTTTTAT терминации транскрипции ранних генов вируса оспы кур.

- От 3415 до 4790: последовательность правой руки , примыкающая к локусу вставки F8 в геноме вектора на основе вируса оспы кур TROVAC.

- От 4791 до 4885: частичная последовательность плазмиды клонирования, включающей последовательность праймера M13R (подчеркнуто).

Пример 1: Способ для получения двух вакцинных штаммов A/New Caledonia/20/99 (H1N1) и A/New York/55/04 (H3N2), служащих для получения вакцины против человеческого эпидемического гриппа, с использованием яиц с развивающимся эмбрионом от кур, которых вакцинировали либо двумя инъекциями инактивированной вакцины, содержащей вирус птичьего гриппа штамма A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9), либо инъекцией рекомбинантного поксвируса птиц, кодирующего НА штамма H5N1, с последующей второй инъекцией инактивированной вакцины, содержащей вирус птичьего гриппа штамма A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9)

1.1) Операционный протокол

1.1.1) Конструирование рекомбинантного вектора vFP2211

vFP2211 является рекомбинантным вирусом оспы кур, в геном которого был вставлен синтетический ген, кодирующий гемагглютинин (НА) штамма A/chicken/Indonesia/7/03 H5N1. Ген НА синтезировали, чтобы получить открытую рамку считывания, которая кодирует аминокислотную последовательность, идентичную нативной последовательности штамма A/chicken/Indonesia/7/03, описанного в базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank под ссылочным номером EF473080 (или в базе данных последовательности белка GenPept под ссылочным номером ABO30346), за исключением сайта расщепления. Аминокислотная последовательность RERRRKKRG, расположенная между положениями 339 и 347 (соответствующая сайту расщепления высокопатогенного штамма), была заменена последовательностью RE----TRG. Этот сайт расщепления, модифицированный таким образом, соответствует сайту расщепления низкопатогенных штаммов подтипа H5.

На первой стадии конструируют донорскую плазмиду pJY1394.1, включающую модифицированный синтетический ген НА под контролем промотора вируса осповакцины H6 (Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6: 504-508; Guo P. et al., J. Virol., 1989, 63: 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63: 3829-3836) и обрамленную фланкирующими последовательностями локуса вставки F8, что позволяет вставку гена НА в локус вставки F8 векторного генома вируса оспы кур. Локус вставки F8 соответствует гену вируса оспы кур, кодирующему фотолиазу, описанному Srinivasan и Tripathy (2005, Veterinary Microbiology 108: 215-223); этот ген также описан под названием FPV158 в полной последовательности генома вируса оспы кур (GenBank, ссылочный номер AF198100). Вставка гена НА и промотора H6 в локус F8 приводит к делеции гена FPV158 из генома рекомбинантного вируса оспы кур. Полная нуклеотидная последовательность плазмиды pJY1394.1, а также ряд нуклеотидных последовательностей, обрамляющих ген НА (которые также фигурируют в полной последовательности плазмиды), описана соответственно на фигурах 1 и 2.

Рекомбинантный вирус vFP2211 затем получают двойной рекомбинацией между фланкирующими последовательностями плазмиды pJY1394.1 и генома вируса оспы кур. Для этого первичные клетки куриного эмбриона трансфицировали плазмидой pJY1394.1, линеаризованной NotI, и инфицировали (множественность инфекции 10) родительским штаммом вируса оспы кур (вектор TROVAC). Вектор TROVAC происходит от вакцинного штамма вакцины Diftosec, используемой Merial против вируса оспы кур у цыплят. Рекомбинантные вирусы отбирали специфической гибридизацией на участках лизиса с зондом, детектирующим встроенный ген НА. Таким образом выделенную vFP2211 затем получали во флаконах на клетках куриного эмбриона.

1.1.2) Получение инактивированной вакцины H5N9

Инактивированная вакцина H5N9, состоящая из низкопатогенного штамма A/chicken/Italy/22A/98 H5N9 (предоставленного лабораторией Ilaria Capua (Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Virologia, Padua, Италия)), который был получен на яйцах с развивающимся эмбрионом и инактивирован бета-пропиолактоном (BPL), и эмульсии гипа "вода-в-масле", составленной из парафинового масла, из сорбитан олеата и полисорбата 80, была получена согласно способу, эквивалентному описанному H. Stone (1987, Avian Dis. 31: 483-490). HLB (липофильно-гидрофильный баланс) смеси поверхностно-активных веществ эмульсии имеет значение 5,3. Вакцинная доза эквивалентна 60 мкл аллантоисной жидкости, имеющей титр 10^8.9 EID₅₀/мл перед инактивацией.

1.1.3) Вакцинация кур-несушек

Формировали две группы (G1 и G2) 1-дневных (D0) цыплят породы Легорн, имеющих статус не содержащие специфических патогенных организмов (SPF). Следующую схему вакцинации использовали для группы G1: 1-дневные цыплята (J0) получали подкожно, в основание шеи с использованием шприца для инсулина, 0,2 мл вирусной суспензии vFP2211, имеющей титр 3,0log₁₀ DICC ₅₀/0,2 мл. В возрасте 8 недель (S8) цыплят разделяли по половому признаку. Приблизительно 25 молодок и 16 петушков сохраняли и объединяли. В возрасте 17 недель (S17) они получили повторную инъекцию дозы вакцины в объеме 0,5 мл моновалентной инактивированной вакцины H5N9.

Следующую схему вакцинации использовали для группы G2: цыплята SPF 3-недельного возраста получали внутримышечно, в гребень грудной кости с использованием шприца для инсулина, дозу вакцины в объеме 0,3 мл моновалентной инактивированной вакцины H5N9. В возрасте 8 недель (S8) цыплят разделяли по половому признаку. Приблизительно 25 молодок и 16 петушков сохраняли и объединяли. В возрасте 17 недель (S17) они получили повторную инъекцию дозы вакцины в объеме 0,5 мл моновалентной инактивированной вакцины H5N9.

1.1.4) Протокол инфекции яиц, происходящих от кур групп G1 и G2 и от неиммунизированных кур, с использованием вирусных штаммов A/New Caledonia/20/99 IVR-116 (H1N1) или A/New York/55/04 X-157 (H3N2)

Способность реассортантных вакцинных штаммов A/New Caledonia/20/99 (xPR8), названного A/New Caledonia/20/99 IVR-116 (H1N1), и A/New York/55/04 (xPR8), названного A/New York/55/04 X-157 (H3N2), к репликации оценивали в яйцах от кур группы G1, которые были отложены в возрасте 40-41 (Тест 2) и 49-50 (Тест 3) недель, и в яйцах от кур группы G2, которые были отложены в возрасте 26-27 (Тест 1), 40-41 (Тест 2) и 49-50 (Тест 3) недель. Параллельно, способность вируса штаммов A/New Caledonia/20/99 (xPR8) (H1N1) и A/New York/55/04 (xPR8) (H3N2) к репликации оценивали тем же самым образом в контрольных яйцах, полученных от невакцинированных кур SPF (контрольная группа).

Все яйца, отложенные в течение недели, сохраняли в терморегулирующей камере (от 12 до 15°C). Яйца одного и того же теста и происходящие от одной и той же группы животных группировали и затем инициировали процесс эмбриогенеза, инкубируя яйца в течение 10 дней при 37-38°C в камере, в которой относительная влажность составляла приблизительно 70-80%. После инкубации в течение 10 дней, живучесть эмбриона подтверждали в каждом яйце посредством устройства для проверки сквозным просвечиванием, и аллантоисную полость точно определяли и помечали крестом. Яйца с развивающимся эмбрионом одного и того же теста и происходящие от одной и той же группы животных группировали в пулы по 8 яиц. Яйца с развивающимся эмбрионом одного и того же пула инфицировали одной и той же инфекционной дозой вируса гриппа, введенной в объеме 200 мкл на уровне креста после дезинфекции и последующей перфорации скорлупы яйца. Тестировали инфекционные дозы 10 ², 10³ и 10⁴ EID₅₀ (Egg Infectious Dose 50%) вируса A/New Caledonia/20/99 (xPR8) (H1N1) и A/New York/55/04 (xPR8) (H3N2). Инфекционные дозы 10³ и 10⁴ EID₅₀ на яйцо тестировали в яйцах тестов 1 и 2. Инфекционные дозы 10² и 10³ EID₅₀ на яйцо тестировали в яйцах теста 3. Инфицированные яйца с развивающимся эмбрионом затем инкубировали при 34°C в течение 48 часов в камере, в которой относительная влажность составляла 80%, и затем помещали в камеру с температурой +4°C на ночь. Затем из каждого яйца собирали инфицированную аллантоисную жидкость. Титр инфицирования оценивали на каждой взятой аллантоисной жидкости, измеряя титр UHA (гемагглютинирующих единиц). Для измерения титра UHA аллантоисных жидкостей, инфицированных штаммом A/New York/55/04 (xPR8) (H3N2), использовали эритроциты индейки. Для измерения титра UHA аллантоисных жидкостей, инфицированных штаммом A/New Caledonia/20/99 (xPR8) (H1N1), использовали эритроциты курицы. Титр UHA выражали инверсией последнего разведения инфицированной аллантоисной жидкости, которая показывала видимую гемагглютинацию в присутствии суспензии эритроцитов курицы или индейки в концентрации 0,5% в фосфатном буфере.

1.2) Результаты

Средние значения титров UHA, полученных в яйцах, происходящих от различных групп вакцинированных и невакцинированных кур, в зависимости от инфекционной дозы вируса, введенной в яйца, и в зависимости от момента отбора яиц, приведены в таблицах I и II.

Таблица I Гемагглютинирующие титры, полученные в аллантоисных жидкостях в зависимости от используемой инфекционной дозы A/New Caledonia/20/99 (xPR8) (H1N1), происхождения яиц (G1, G2, невакцинированный контроль) и момента кладки яиц (Тест 1, Тест 2, Тест 3)
Инфекционная доза (EID50/яйцо)	100	1000	10000
Группа	тест 3	тест 1	тест 2	тест 3	тест 1	тест 2
Невакцинированный контроль	640*	1050	1660	1280	861	1522
G1 (vFP2211/инакт.вак. H5N9)	1140	NA	1974	830	NA	1974
G2 (Инакт.вак. H5N9/инакт.вак. H5N9)	806	905	1660	1159	905	1974
*: Гемагглютинирующий титр (UHA), выраженный в форме средней геометрической величины 8 титров UHA/50 мкл, полученных на аллантоисных жидкостях 8 яиц, включенных в каждое условие. NA: Не применимо

Таблица II Гемагглютинирующие титры, полученные в аллантоисных жидкостях в зависимости от используемой инфекционной дозы A/New York/55/04 (xPR8) (H3N2), происхождения яиц (G1, G2, невакцинированный контроль) и момента кладки яиц (Тест 1, Тест 2, Тест 3)
Инфекционная доза (EID50/яйцо)	100	1000	10000
Группа	тест 3	тест 1	тест 3	тест 1
Невакцинированный контроль	211*	861	349	830
G1 (vFP2211/инакт.вак. H5N9)	88	NA	254	NA
G2 (инакт.вак. H5N9/инакт.вак. H5N9)	254	987	557	844
*: Гемагглютинирующий титр (UHA), выраженный в форме средней геометрической величины 8 титров UHA/50 мкл, полученных на аллантоисных жидкостях 8 яиц, включенных в каждое условие. NA: Не применимо

Результаты, полученные в таблицах I и II, показывают, что средние значения титров UHA аллантоисных жидкостей яиц, происходящих от вакцинированных кур (G1 и G2), эквивалентны средним значениям титров UHA аллантоисных жидкостей яиц, происходящих от невакцинированных кур.

Статистический анализ проводили, чтобы изучить факторы вакцины и дозы. Индивидуальные значения UHA преобразовывали в log₂ и затем анализировали с использованием модели дисперсии. Гетерогенность дисперсии проверяли, используя тест уменьшенного охвата, выполненный с остатками модели (SAS v8.2 программное обеспечение).

Статистический анализ, выполненный на индивидуальных значениях титров UHA, показал, что не было никакого эффекта вакцинации. Также не было замечено какого-либо эффекта, связанного с дозой вируса, используемой для инфицирования яиц. Титры UHA заметно не колебались в ходе изученного периода откладывания яиц (в пределах от 26 недель (Тест 1) до 50 недель (Тест 3)).

Пример 2: Способ получения двух пандемических вакцинных штаммов A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9) и A/Vietnam/1194/04 NIBRG14 (H5N1) с использованием яиц с развивающимся эмбрионом от кур, которых вакцинировали либо двумя инъекциями инактивированной вакцины, содержащей птичий вирус гриппа штамма A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9), либо инъекцией рекомбинантного поксвируса птиц, кодирующего НА штамма H5N1, с последующей второй инъекцией инактивированной вакцины H5N9, содержащей штамм вируса птичьего гриппа

2.1.1) Вакцинация кур

Протокол вакцинации кур был идентичен тому, который использовали в примере 1.

2.1.2) Протокол инфицирования яиц, происходящих от кур групп G1 и G2 и от неиммунизированных кур, с использованием вирусных штаммов A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9) и A/Vietnam/1194/04 NIBRG14 (H5N1)

Протокол инфицирования был тем же самым, как тот, который использовался в примере 1, за исключением следующих модификаций:

Низкопатогенный птичий штамм A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9), полученный от Laboratoire Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Virologia, Padua, Италия, и аттенуированный пандемический вакцинный штамм-реассортант A/Vietnam/1194/04 NIBRG14 (H5N1) использовали для инфицирования яиц. Последний штамм был предоставлен National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) laboratory, South Mimms, Potters Bar, Herts EN6 3QG, Великобритания и был получен обратной генетикой, как описано C. Nicolson et al., Generation of influenza vaccine viruses on Vero cells by reverse genetics: an H5N1 candidate vaccine strain produced under a quality system, 2005, Vaccine, 23: 2943-2952.

На этих двух штаммах тестировали инфекционные дозы 10², 10³, 10⁴ и 10⁵ EID₅₀ (Egg Infectious Dose 50%). Инфекционные дозы 10³, 10⁴ и 10⁵ EID₅₀ на яйцо тестировали в яйцах теста 1. Инфекционные дозы 10⁴ и 10⁵ EID₅₀ на яйцо тестировали в яйцах теста 2. Инфекционные дозы 10² и 10³ EID₅₀ на яйцо тестировали в яйцах теста 3.

Для измерения титров UHA аллантоисных жидкостей, инфицированных A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9) или A/Vietnam/1194/04 NIBRG14 (H5N1), использовали эритроциты кур.

2.2) Результаты

Титры UHA, полученные в яйцах, происходящих от различных групп вакцинированных и невакцинированных кур, в зависимости от инфекционной дозы вируса, введенного в яйца, и в зависимости от момента отбора яиц, приведены в таблицах III и IV.

Таблица III Гемагглютинирующие титры, полученные в аллантоисных жидкостях в зависимости от используемой инфекционной дозы A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9), происхождения яиц (G1, G2, невакцинированный контроль) и момента кладки яиц (Тест 1, Тест 2, Тест 3)
Инфекционная доза (EID50/яйцо)	100	1000	10000	100000
Группа	тест 3	тест 1	тест 3	тест 1	тест 2	тест 1	тест 2
Невакцинированный контроль	35*	53	32	53	64	54	53
G1 (vFP2211/инакт.вак. H5N9)	64	NA	54	NA	59	NA	86
G2 (инакт.вак. H5N9/инакт.вак. H5N9)	102	64	57	59	70	102	59
*: Гемагглютинирующий титр (UHA), выраженный в форме средней геометрической величины 8 титров UHA/50 мкл, полученных на аллантоисных жидкостях 8 яиц, включенных в каждое условие. NA: Не применимо

Таблица IV Гемагглютинирующие титры, полученные в аллантоисных жидкостях в зависимости от используемой инфекционной дозы A/Vietnam/1194/04 (H5N1) RG14, происхождения яиц (G1, G2, невакцинированный контроль) и момента кладки яиц (Тест 1, Тест 2, Тест 3)
Инфекционная доза (EID50/яйцо)	1000	10000	100000
Группа	тест 1	тест 1	тест 2	тест 1	тест 2
Невакцинированный контроль	194*	232	197	172	181
G1 (vFP2211/инакт.вак. H5N9)	NA	NA	197	NA	166
G2 (инакт.вак. H5N9/инакт.вак. H5N9)	152	279	215	181	235
*: Гемагглютинирующий титр (UHA), выраженный в форме средней геометрической величины 8 титров UHA/50 мкл, полученных на аллантоисных жидкостях 8 яиц, включенных в каждое условие. NA: Не применимо

Результаты, приведенные в таблицах III и IV, а также статистический анализ показывают, что титры UHA аллантоисных жидкостей, происходящих от яиц от вакцинированных кур (G1 и G2) подобны титрам UHA аллантоисных жидкостей яиц от невакцинированных кур, даже в случае, когда кур вакцинируют штаммом, идентичным тому, который использовался для инфицирования яиц с развивающимся эмбрионом, происходящих от этих кур (в случае групп G1 и G2, вакцинированных штаммом A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9)). Также нет никакого эффекта, связанного с дозой вируса, используемой для инфицирования яиц. Титры UHA заметно не колебались в ходе изученного периода откладывания яиц (в пределах от 26 недель (Тест 1) до 50 недель (Тест 3)).

Статистический анализ проводили как в примере 1.

Пример 3: Анализ антительного ответа материнскими антителами анти-H5 в яйцах от кур, вакцинированных вакцинным штаммом A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9)

3.1) Операционный протокол

Присутствие антител анти-H5 в яйцах от кур групп G1 и G2, вакцинированных штаммом A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9), было измерено согласно протоколу, описанному в параграфе 1.1.1). Параллельно, ответ анти-H5 также анализировали в желтках яиц от невакцинированных кур (контрольная группа).

Ответ анти-H5 анализировали в желтках яиц (или желточных жидкостях), которые были взяты во время тестов 1 (W26-27), 2 (W40-41) и 3 (W49-50). Анализ ответа анти-H5 в желтках яиц теста 1 проводили перед эмбриогенезом (J0) и после эмбриогенеза (J10) (то есть после фазы инкубации в течение 10 дней при 37°C). Анализ ответов анти-H5 в желтках яиц тестов 2 и 3 проводили только после эмбриогенеза (J10). Тот же самый анализ также осуществляли с яйцами, происходящими от невакцинированных кур (см. параграф 3.2.2)). Ответ анти-H5 также изучали в аллантоисных жидкостях яиц теста 2 после эмбриогенеза (J10). Яичные желтки удаляли отсасыванием, используя пипетку с одноразовым наконечником. За исключением теста 1, где яичные желтки сохраняли замороженными без предварительного разбавления, яичные желтки тестов 2 и 3 и аллантоисные жидкости перед замораживанием разбавляли 1/5 в фосфатном буфере. Разбавленные яичные желтки и аллантоисные жидкости сохраняли замороженными до времени тестирования антител анти-H5, который осуществляли, используя способ тестирования ингибированием гемагглютинации (IHA) куриных эритроцитов, которая имеет место в присутствии штамма A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9). Дозирование было основано на способности нейтрализирующих антител, направленных специфично к НА вируса, ингибировать "гемагглютинирующую" активность вируса. В этом тесте в качестве положительного контроля использовали сыворотку овец anti-A/Vietnam/1194/04, предоставленную NISBC, а в качестве отрицательного контроля использовали сыворотку наивных мышей. Последовательное двукратное разведение образцов (разбавленные яичные желтки или аллантоисные жидкости) осуществляли на микропланшете с коническим дном, чтобы получить 50 мкл каждого разведения на лунку. 50 мкл вирусной суспензии, имеющей титр 4 гемагглютинирующих единиц (4UHA) и происходящей от осветленной аллантоисной жидкости, которая была инфицирована штаммом A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9), предоставленным лабораторией Ilaria Capua (Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio Virologia, Padua, Италия), добавляли к каждой лунке. Планшет инкубировали в течение 1 часа при лабораторной температуре перед добавлением 50 мкл раствора куриных эритроцитов в концентрации 0,5% в фосфатном буфере. После 1 часа при +4°C тест считывали. Ингибирование гемагглютинации было отражено наличием красного пятна у основания микролунки, в то время как явление гемагглютинации было отражено наличием розоватого гало в микролунке. Титр антител IHA был представлен инверсией последнего разведения, при котором в микролунке не наблюдается гемагглютинации.

3.2) Результаты

3.2.1) Анализ ответа анти-H5 в яичных желтках теста 1

В J0 8 из 8 проанализированных яичных желтков невакцинированной группы дали отрицательные результаты в тесте IHA, тогда как 6 из 8 яичных желтков, происходящих от группы 2, дали положительный результат в тесте IHA, что указывает на присутствие антител анти-H5.

В J10 4 из 4 проанализированных яичных желтков невакцинированной группы дали отрицательные результаты в тесте IHA, тогда как 4 из 4 яичных желтков, происходящих от группы 2, дали положительный результат в тесте IHA.

3.2.2) Анализ ответа анти-H5 в яичных желтках и аллантоисных жидкостях теста 2

В J10 5 из 5 проанализированных яичных желтков невакцинированной группы дали отрицательные результаты в тесте IHA, тогда как 4 из 5 яичных желтков, происходящих от группы 1, и 4 из 5 яичных желтков, происходящих от группы 2, дали положительный результат в тесте IHA, что указывает на существование антител анти-H5 в этих группах. Индивидуальные значения полученных титров IHA приведены в таблице V.

Таблица V Титры IHA для желтков яиц, отобранных после эмбриогенеза (J10)
Яичные желтки	J10*
Группа 1 (vFR2211/инакт.вак. H5N9)	160
80
320
80
<5
Группа 2 (инакт.вак. H5N9/ инакт.вак. H5N9)	80
160
40
40
<5
Невакцинированная группа	<5
<5
<5
<5
<5
*: Титры в J10 происходят от различных яичных желтков

С другой стороны, все аллантоисные жидкости, происходящие от групп 1 и 2, дали отрицательные результаты в тесте IHA, что означает, что не было никаких антител, ингибирующих гемагглютинацию вируса гриппа H5N9, которые могли бы быть обнаружены в аллантоисных жидкостях.

3.2.3) Анализ ответа анти-H5 в яичных желтках теста 3

В J10 5 из 5 проанализированных яичных желтков невакцинированной группы дали отрицательные результаты в тесте IHA, тогда как 5 из 5 яичных желтков, происходящих от группы 1, дали положительный результат в тесте IHA.

Индивидуальные значения титров IHA приведены в таблице VI.

Таблица VI Титры IHA желтков яиц, собранных после эмбриогенеза (J10) в зависимости от происхождения яиц
Яичные желтки	D10
Группа 1 (vFP2211/инакт.вак. H5N9)	80
80
160
5
320
Невакцинированная группа	<5
<5
<5
<5
<5

В заключение, на основе результатов примеров 2 и 3, присутствие материнских антител анти-H5N9, которое было показано в яичных желтках 3 тестов, не оказывает никакого эффекта на вирусную продуктивность аллантоисных жидкостей, инфицированных штаммом H5N1 или H5N9.

Пример 4: Анализ сывороточного ответа кур, вакцинированных вакцинным штаммом A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9), и ответа на уровне материнских антител анти-H5, присутствующих в яйцах от этих вакцинированных кур

Пробы крови отбирали в возрасте 28 и 36 недель от вакцинированных кур групп 1 и 2. Яйца, отложенные этими курами, собирали в недели 27 и 37, чтобы оценить важность переноса материнских антител в яичные желтки. Гуморальный иммунный ответ анти-H5 оценивали посредством теста ингибирования гемагглютинации с использованием в качестве антигена штамма A/chicken/Italy/22A/98 H5N9, гомологичного инактивированному вакцинному штамму. Результаты представлены как log₁₀ в таблице VII.

Таблица VII Титр антител, ингибирующий гемагглютинацию (антиген H5N9 A/chicken/Italy/22A/98) в сыворотке вакцинированных кур-несушек и в желтках яиц, отложенных этими курами
	Сыворотка	Желток	Сыворотка	Желток
Возраст в неделях	28	27	36	37
G1	2,10±0,61 (15)*	1,96±0,94 (21)**	1,92±0,91 (15)	1,63±0,89 (10)
G2	2,20±0,62 (15)	1,81±0,88 (13)	2,26±0,65 (15)	1,43±0,89 (14)
* среднее геометрическое ингибирующих гемагглютинацию титров антител, выраженное какlog10 ± стандартное отклонение (число протестированных образцов на группу) ** самое низкое разведение, протестированное на желтках, составляло 1/10 (1log10); для вычисления средних значений и стандартного отклонения значения яиц, которые показали отрицательные результаты в разведении 1/10, переводили в 0,7log 10.

Таблица VIII Титр антител, ингибирующий гемагглютинацию (антиген H5N9 A/turkey/Wisconsin/68) в желтках яиц, отложенных вакцинированными курами групп 1 и 2
	Желток
Возраст в неделях	27
G1	1,67±0,79 (21)*
G2	1,39±0,80 (13)
* среднее геометрическое ингибирующих гемагглютинацию титров антител, выраженное как log10 ± стандартное отклонение (число протестированных образцов на группу); самое низкое разведение, протестированное на желтках, составляло 1/10 (1log 10); для вычисления средних значений и стандартного отклонения значения яиц, которые показали отрицательные результаты в разведении 1/10, переводили в 0,7log10.

Эти результаты подтверждают перенос материнских антител в яичные желтки яиц, отложенных вакцинированными курами групп 1 и 2.

Титры гомологичных антител анти-H5N9 (таблица VII) в желтках больше, чем гетерологичные титры анти-H5N9 (таблица VIII), хотя это различие не является статистически значимым.

Пример 5: Получение штамма H5N9 A/turkey/Wisconsin/68 на яйцах, отложенных курами, вакцинированными инактивированной вакциной H5N9 (штамм A/chicken/Italy/22A/98) группы 2

5.1. Операционный протокол

Яйца (приблизительно 220-230) от кур группы 2, вакцинированных 2 раза в возрасте 3 и 17 недель инактивированной вакциной H5N9 (штамм A/chicken/Italy/22A/98), отбирали в течение недель 28 и 29. Эти яйца, после хранения при контролируемой температуре (от 12 до 15°C), инкубировали при 37°C в течение 11 дней. После проверки сквозным просвечиванием для подтверждения того, что эмбрионы имели хорошую жизнеспособность, яйца инокулировали в аллантоисную полость 0,2 мл разведения сток-раствора вирусного штамма H5N9 A/turkey/Wisconsin/68, имеющего титр 9,68 log ₁₀ EID₅₀/мл (инокулум). Формировали семь групп приблизительно по 30 яиц. Четыре группы (G1-G4) инокулировали следующим разведением инокулума: 10^-5, 10^-4 , 10^-3 и 10^-2. Три других группы (G5-G7) инокулировали разведением инокулума 10^-3. После инокуляции яйца инкубировали при 37°C±1,5°C при влажности 70%±10%. После инкубации в течение 20 часов, яйца просвечивали, чтобы отделить мертвые яйца, полученные в результате инокуляции, и затем их повторно инкубировали в тех же самых условиях. Спустя сорок два часа после инокуляции, яйца помещали на холод перед сбором аллантоисной жидкости. Аллантоисные жидкости яиц групп 1-4 объединяли (один пул жидкости на группу). Аллантоисные жидкости 4 групп яиц сохраняли при -70°C, после чего титровали на предмет определения гемагглютинирующих единиц и 50% инфекционной дозы (EID₅₀).

5.2. Результаты

Результаты приведены в таблице IX.

Таблица IX Гемагглютинирующие и инфекционные титры, полученные после получения штамма H5N9 A/turkey/Wisconsin/68 на яйцах, происходящих от кур, вакцинированных инактивированной вакциной, содержащей штамм H5N9 A/chicken/Italy/22A/98
Группа	Разведение инокулума	Титр гемагглютинирующих единиц (log10)	Инфекционный титр EID50 (log10/мл)
1	10-5	2,25	9,50
2	10-4	2,40	9,33
3	10-3	2,25	9,67
4	10-2	2,40	9,88

Эти результаты показывают очень схожие титры между группами и поэтому нет никакого эффекта разведения инокулума. Кроме того, полученные титры являются очень высокими и сопоставимы с полученным на яйцах, не имеющих материнских антител анти-H5N9 (исторические лабораторные данные). Эти результаты поэтому подтверждают, что, в условиях теста, присутствие материнских антител в яйцах не препятствует продукции вируса гриппа того же самого подтипа.