способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине

Формула изобретения

Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине, включающий скрещивание коммерческого сорта мягкой пшеницы с линией мягкой пшеницы, являющейся донором гена устойчивости, самоопыление гибридов первого поколения F₁ для получения гибридов второго поколения F₂, среди которых с помощью молекулярного ПЦР-маркера и цитологических ДНК-маркеров отбирают растения с геном устойчивости, повторное самоопыление отобранных растений для получения растений поколения F₃ и тестирование последних в полевых условиях на устойчивость к бурой ржавчине, отличающийся тем, что в качестве линии-донора гена устойчивости используют гибридную линию 21-4, содержащую новый ген LrN21, а среди гибридов второго поколения проводят отбор растений, содержащих ген LrN21, локализованный в хромосоме 5В, с помощью последовательного применения ПЦР-маркера 34vrn5b и цитологических ДНК-маркеров pSc119.2 и Spelt1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в генетике и селекции зерновых культур.

В настоящее время стало очевидным, что интенсивная селекция мягкой пшеницы, направленная на повышение урожайности, приводит к значительному сужению генетического разнообразия современных сортов по уровню устойчивости к грибным болезням. Создание сортов с генетической или «хозяйской» устойчивостью является одним из элементов защиты пшеницы от болезней. Расширение генетического разнообразия зерновых культур и пополнение генофонда по генам устойчивости к грибным болезням может быть достигнуто за счет включения в селекционный процесс диких сородичей, которые являются неисчерпаемым источником генов устойчивости [1]. В настоящее время известно пять генов устойчивости к бурой ржавчине, перенесенных в геном мягкой пшеницы от диплоидного вида Aegilops speltoides. Эти гены локализованы в хромосомах 4AL, 2В, 6BS, 1BL и 7AS мягкой пшеницы [www.grs.mg.ac.ip/wheat/komugi/genes]. К сожалению, часть из них к настоящему времени потеряла свою эффективность, остальные гены не могут быть использованы в селекционных целях из-за сложностей, возникающих в процессе переноса генов и их дальнейшей идентификации в элитных сортах мягкой пшеницы [2].

Известен способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине (патент RU 2407283, опубл. 27.12.2010), заключающийся в следующем. Коммерческий сорт мягкой пшеницы скрещивают с линией-донором, содержащей ген Lr. В качестве донора устойчивости используют гибридную линию 832-2, содержащую в составе генома не более шести фрагментов хромосом Т. timopheevii, для которой предварительно проведен молекулярно-генетический анализ, установлена хромосомная локализация генов устойчивости и определены ДНК-маркеры для генов устойчивости. Далее гибриды первого поколения (F₁) беккроссируют двукратно на исходный сорт, потомство BC₂F₁ тестируют ДНК-маркерами cfe229 и cfe204 к гену устойчивости Lr и отбирают линии, несущие ДНК-маркеры. Отобранные линии беккроссируют третий раз, проводят самоопыление потомства и в потомстве BC ₃F₂ отбирают линии, несущие ДНК-маркеры к гену устойчивости Lr в гомозиготном состоянии. На заключительном этапе потомство BC₃F₃ тестируют в полевых условиях. Однако данный способ является более трудоемким и длительным по времени, поскольку предполагает проведение трех этапов беккроссирования гибридов первого поколения, сопровождающихся самоопылением гибридных растений.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу-прототипу является способ создания гибридных форм мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине, с использованием линии-донора гена Lr28 от Aegilops speltoides [3]. В данном способе линию-донор, содержащую ген Lr28, скрещивают с линией, полученной на основе коммерческого сорта мягкой пшеницы HD2687, гибридные растения F₁ самоопыляют для получения поколения F₂, среди которых с помощью молекулярного маркера SCS421₅₇₀ отбирают растения с геном Lr28. Для выявления хромосомной локализации гена Lr28 растения поколения F₂ анализируют с помощью 602 молекулярных маркеров, отобранные растения самоопыляют до поколения F2, в котором выявляют растения с геном Lr28 в гомозиготном состоянии. Полученные F₃ растения проверяют на устойчивость к полевой популяции бурой ржавчины.

Недостатками данного способа являются:

1. Отсутствие специфичности маркера SCS421₅₇₀. Амплификация фрагмента, специфичного для маркера SCS421₅₇₀, не всегда связана с наличием гена Lr28, что не позволяет однозначно различать устойчивые и чувствительные растения. В связи с отсутствием специфичности маркер SCS421₅₇₀ не включен в список маркеров, рекомендуемых для использования в селекционных программах [http://maswheat.ucdavis.edu1].

2. Маркер SCS421570 выявляет наличие гена Lr28, но не определяет его хромосомную локализацию. Информация о хромосомной локализации гена устойчивости необходима для прогнозирования влияния чужеродного фрагмента хромосомы, содержащей ген устойчивости, на другие хозяйственно-ценные признаки сорта-реципиента.

3. Использование 602 молекулярных маркеров для выявления хромосомной локализации гена, что увеличивает время проведения анализа и его стоимость.

4. Значительное снижение и даже полная потеря устойчивости к бурой ржавчине уже созданных сортов мягкой пшеницы, содержащих ген Lr28 [4].

Задачей данного изобретения является создание линии-донора мягкой пшеницы, содержащей новый эффективный ген устойчивости к бурой ржавчине от Aegilops speltoides.

Технический результат заключается в упрощении известного способа и расширении его функциональных возможностей.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Гибридную линию мягкой пшеницы 21-4 (Т. aestivum - Ae.speltoides), содержащую новый ген устойчивости LrN21, локализованный в дистальном районе хромосомы 5В, скрещивают с элитным сортом мягкой пшеницы и растения поколения F₁ самоопыляют до поколения F ₂. Из поколения F₂ с помощью молекулярного ПЦР маркера 34vrn5b отбирают растения, содержащие ген LrN21. Отобранные с помощью ПЦР-маркера 34vrn5b растения F₂ с геном LrN21 проверяют цитологическими ДНК-маркерами Spelt1 и pSc119.2, с помощью которых выявляют растения с локализацией гена LrN21 в хромосоме 5В и в гомозиготном состоянии.

Основными определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:

- в качестве линии-донора используют гибридную линию мягкой пшеницы 21-4, содержащую новый более эффективный ген устойчивости к бурой ржавчине LrN21 от Aegilops speltoides;

- из поколения F₂ с помощью молекулярного ПЦР маркера 34vrn5b отбирают растения, содержащие новый ген LrN21, что позволяет на ранних стадиях создания линий быстро и экономично отбирать растения, содержащие ген LrN21 без проведения полевых испытаний;

- в качестве цитологических ДНК-маркеров используют специально подобранные известные маркеры Speltl/pSc119.2, выявляющие хромосомную локализацию гена LrN21

и его гомозиготное состояние на стадии F₂, что позволяет сократить время и стоимость создания устойчивых линий.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример

Гибридные линии Т. aestivum - Ае. speltoides, полученные ранее от скрещивания мягкой пшеницы с видом Ае. speltoides, были проверены на устойчивость к бурой ржавчине на стадиях проростков и взрослых растений. Среди проверенных образцов была отобрана линия 21-4, проявляющая высокий уровень устойчивости к бурой ржавчине (по шкале иммунности Майнса и Джексона [5]). В таблице 1 представлены данные (в баллах) по устойчивости гибридных линий с генетическим материалом Aegilops speltoides и изогенной линии с геном Lr28. Из таблицы 1 видно, что линия ThLr28, содержащая ген Lr28 (прототип), показала средний уровень устойчивости (балл 1 и 2 по шкале иммунности) к этой же популяции бурой ржавчины.

Цитологический и молекулярной анализ показал, что линия 21-4 имеет единичный фрагмент генома Aegilops speltoides, который находится в дистальном районе хромосомы 5В и имеет происхождение из хромосомы 5S Aegilops speltoides. Согласно литературным данным до настоящего времени не зафиксировано гена устойчивости к бурой ржавчине, происходящего из хромосомы 5S Aegilops speltoides [1, www.grs.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes]. Новый ген был обозначен символом LrN21.

Гибридную линию 21-4 - донор нового гена скрещивали с сортом мягкой пшеницы Новосибирская 29 и полученные гибридные растения поколения F ₁ самоопыляли до поколения F₂. В поколении F ₂ с помощью ПЦР-маркера 34vrn5b отбирали растения, содержащие ген LrN21. Нуклеотидная последовательность ПЦР-маркера 34vrn5b, условия реакции для ПЦР и размер фрагмента амплификации приведены в таблице 2.

Отобранные с помощью ПЦР-маркера 34vrn5b растения поколения F₂, содержащие новый ген LrN21, проверяли с помощью цитологических ДНК-маркеров Spelt1 и pSc119.2 для выявления хромосомной локализации гена и его гомозиготного состояния.

Информация о цитологических ДНК-маркерах Spelt1 и pSc119.2 и методе флюоресцентной in situ гибридизации для их визуализации опубликована в [6]. Маркер pSc119.2 использовали для идентификации хромосомы 5В мягкой пшеницы. Маркер Spelt1 использовали для выявления участка хромосомы 5S Aegilops speltoides, содержащей новый ген устойчивости LrN21.

Растения поколения F₂, отобранные с помощью ПЦР-маркера 34vrn5b и цитологических ДНК-маркеров pSc119.2 и Speltl, самоопыляли до поколения F₃ и дополнительно проверяли на устойчивость к бурой ржавчине в полевых условиях. Результаты представлены в таблице 3.

Результаты фитопатологического теста показали эффективность применения ПЦР-маркера 34vrn5b и цитологических ДНК-маркеров pSc119.2 и Spelt1 для маркирования нового гена устойчивости к бурой ржавчине LrN21 и его выявления в потомстве от скрещивания линии-донора 21-4 и сорта Новосибирская 29.

Результаты анализа для ПЦР-маркера 34vrn5b с геномной ДНК линии-донора 21-4, сорта мягкой пшеницы Новосибирская 29 (Н29), вида Aegilops speltoides (Ae.sp) и растений поколения F₂, полученных от скрещивания линии-донора 21-4 и сорта Новосибирская 29, не содержащих (растения 1 и 5) и содержащих (растения 2, 3 и 4) новый ген LrN21, приведены на фиг.1. Фрагмент ДНК длиной 900 п.н., свидетельствующий об отсутствии или наличии гена LrN21, указан стрелкой.

На фиг.2 представлены хромосома 5В сорта мягкой пшеницы Новосибирская 29 (Н29), хромосома 5S вида Aegilops speltoides (Ae.sp) и хромосома 5В линии-донора 21-4, содержащая участок хромосомы 5S Aegilops speltoides. Локализация цитологических ДНК-маркеров соответствует черным точкам на хромосомах, из них стрелками показана локализация маркера Spelt1, который маркирует участок хромосомы 5S Aegilops speltoides с геном устойчивости LrN21.

Таким образом, созданные предложенным способом линии могут пополнить генофонд мягкой пшеницы по генам устойчивости и могут быть использованы в селекционных программах как доноры генов для получения устойчивых сортов мягкой пшеницы. Молекулярный ПЦР-маркер и цитологические ДНК-маркеры, подобранные к новому гену устойчивости LrN21, позволят отбирать линии, содержащие данный ген устойчивости, без проведения полевых тестов и, соответственно, сократить срок создания новых форм мягкой пшеницы.

Таблица 1
№ гибридной линии T.aestivum - Ae.speltoides	Устойчивость к бурой ржавчине (в баллах)
Стадия проростков	Стадия взрослых растений
6-1	4	4
7-4	3	4
8-7	4	4
10-6	4	4
11-6	3	4
13-3	2	3
17-7	2	2
17-12	2	3
21-4	0	0
21-12	1	1,2
ThLr28	1	1,2

Таблица 2
Маркер	34vrn5b
Нуклеотидные последовательности праймеров	5'-CATATCAGATCCAGGAAGGT-3'5'-CATCCTCTGCCCTCTCTCCTGA-3'
Условия реакции ПЦР	(1 мин при 94°С, 1 мин при 55°С, 1 мин при 72°С): 30 циклов
Размер продукта амплификации	900 пар нуклеотидов
Условия проведения электрофореза	1% агароза

Таблица 3
Образец	Устойчивость к бурой ржавчине (в бал.)	Наличие ПЦР-маркера 34vrn5b	Наличие цитологического ДНК-маркера pSc119.2	Наличие цитологического ДНК-маркера Spelt1
Новосибирская 29	4	присутствует	присутствует	отсутствует
Линия 21-4	0	отсутствует	присутствует	присутствует
Aegilops speltoides	0	отсутствует	присутствует	присутствует
Растение 1	0	отсутствует	присутствует	присутствует
Растение 2	4	присутствует	присутствует	отсутствует
Растение 3	4	присутствует	присутствует	отсутствует
Растение 4	4	присутствует	присутствует	отсутствует
Растение 5	0	отсутствует	присутствует	присутствует

Источники информации

1. Mclntosh R.A., Yamazaki Y., Dubcovsky J., et al. Catalogue of Gene Symbols for Wheat. 2010. www.grs.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes.

2. Афанасенко О.С. Проблемы создания сортов с длительной устойчивостью к болезням. Защита и карантин растений. 2010, № 3: 4-9.

3. Vinod K.B.B., Sharma J.B., Singh A.K., Sivasamy M., Singh M., Prabhu K.V., Tomar S.M.S., Sharma T.R., Singh B. Molecular markers assisted pyramiding of leaf rust resistance genes Lr19 and Lr28 in bred wheat (T.aestivum L.) variety HD2687. Indian J. Genet. 2011, 71: 304-311.

4. Волкова Г.В. Изучение и использование генетического потенциала устойчивости пшеницы к грибным болезням. Защита и карантин растений. 2010, № 9: 13-17.

5. Mains E.B., Jackson H.S. Physiological specialization in the leaf rust of wheat, Puccinia triticina Erikss. Phytopathology. 1926, 16: 89-120.

6. Салина Е.А., Егорова Е.М., Адонина И.Г. и др. ДНК маркеры для генотипирования и создания интрогрессивных линий пшеницы (Triticum aestivum L. x Aegilops speltoides Tausch;

Т. aestivum x T. timopheevii Zhuk.) Вестник ВОГиС. 2008, 12: 620-628.