способ выращивания посадочного материала

Формула изобретения

Способ выращивания посадочного материала, включающий заготовку побегов, их стерилизацию, индукцию развития основного пазушного побега на первичных эксплантах, укоренение изолированных побегов, их мильтипликацию в условиях in vitro и перевод в нестерильные условия, отличающийся тем, что микрочеренкование осуществляют на питательной среде WPM - Woody Plant Medium, со сниженным содержанием БАМ - бензиламинопурин 0,2 мг/л и добавлением ГК - гиббереллиновой кислоты 0,2 мг/л, и высадка пробирочных микрорастений в нестерильные условия проводится без их предварительной адаптации к условиям климатической камеры.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к растениеводству, лесному, лесопарковому и сельскому хозяйству, а именно к питомниководству.

Изобретение решает задачу производства качественного посадочного материала с высокими показателями темпа роста и повышения приживаемости саженцев.

Известен способ размножения посадочного материала древесных растений, включающий выращивание побегов in vitro на искусственной питательной среде, тестирование методом иммуно-ферментного анализа, прививку растений (патент РФ № 2118486, МПК А01G 01/00, опубл. 10.09.1998). Однако данный способ дорогостоящий.

В качестве прототипа выбран способ размножения растений in-vitro, включающий высадку боковых побегов растений в заполненные агаризованной средой сосуды без дна для начального укоренения, помещение укорененных побегов в емкость, заполненную перлитом, пропитанным жидкой стерильной средой (патент РФ № 2277773, МПК А01Н 04/00, опубл. 20.06.2006). Однако данный способ очень трудоемкий.

Способ предназначен для массового тиражирования хозяйственно ценных сортов древесных растений, которые относятся к трудно черенкуемым традиционным способом, и выращивания качественного стандартного посадочного материала для создания плантационных насаждений, полезащитных полос, лесных угодий.

Для этого регенерация растений осуществляется на основе пролиферации пазушных меристем (прямой выгонки пазушных побегов), их укоренения и мультипликации полученных микрорастений, т.е. с помощью модели размножения, исключающей этап каллусообразования. При этом в качестве эксплантов используются узловые сегменты активно растущих летних неодревесневших (а не зимних одревесневших) побегов, применение гормональных питательных сред ограничивается всего одним сроком культивирования (один месяц) первичных эксплантов взрослых деревьев, а на этапе укоренения микропобегов, их доращивания и мультипликации используются одни и те же безгормональные среды.

Предлагаемый способ выращивания посадочного материала осуществляют следующим образом.

1 этап - Заготовка побегов, изоляция эксплантов и получение асептических жизнеспособных культур.

Заготовка побегов: однолетние растущие неодревесневшие (зеленые) побеги тополя размером 40 50 см с пазушными вегетативными почками заготавливают в начале - середине июня из средней части кроны взрослых отобранных деревьев. Отбираются побеги с хорошо выраженными пазушными почками и междоузлиями. Срезанные побеги помещают в банках с водопроводной водой в условия холодильника (температура 10 12°С), где выдерживают в течение 3 5 суток для их холодовой предобработки перед изоляцией эксплантов. Каждые три дня проводится обновление срезов и смена воды.

Стерилизация побегов. Сначала проводится предварительная подготовка побегов. Для этого отрезки побегов величиной 10 см тщательно промывают теплой водой с хозяйственным мылом, а затем подвергают поэтапной стерилизации:

1) Поверхностная стерилизация коммерческим 2% раствором «Domestos» (подогретым до 30 40°С) в течение 15 минут с последующей промывкой в проточной водопроводной воде (не менее 20 минут). Осуществляется в нестерильных условиях.

2) Основная стерилизация побегов в асептических условиях (в условиях ламинар-бокса) 0,025% раствором мертиолята в сочетании с жидким дезинфицирующим раствором "Белизна" (7% раствор) в течение 15 мин, с последующей 5-кратной промывкой стерильной дистиллированной водой. Для лучшего смачивания побегов во время основной стерилизации в раствор мертиолята рекомендуется добавить Твин 20 (0,08 0,12%).

2 этап - Индукция развития основного пазушного побега на первичных эксплантах.

Простерилизованные побеги разрезают в асептических условиях на сегменты величиной 1,5-2 см с одной пазушной почкой (культуральные экспланты). Экспланты в асептических условиях (в ламинар-боксе) помещают в вертикальном или слегка наклонном положении по одному в культуральные сосуды (стеклянные биологические пробирки) с питательной средой WPM (среда № 1) с добавлением 6-БАП (6-бензиламинопурина) 0,5 мг/л, ГК (гиббереллиновая кислота) 0,2 мг/л.

Более полно морфогенные потенции (формирование хорошо развитых пазушных побегов) проявляются при культивировании эксплантов на питательной среде WPM, дополненной БАП 0.5 мг/л и ГК 0.2 мг/л (таблица 1). Добавление в питательную среду ГК позволяет не только повысить количество морфогенных культур (например, в 1,7 раза у тополя Хоперский 1 (77,4% против 44,3% без ГК) и 1,9 раз - у тополя Приярского), но и способствует элонгации (доращиванию) индуцированных побегов. В этом случае в течение месяца с момента начала культивирования формируются побеги, отличающиеся хорошим ростом в высоту (4 8 см) с нормально развитыми листовыми пластинками, отсутствием признаков сомаклональной изменчивости. Низкое содержание БАП в среде (0.2 мг/л) на начальном этапе культивирования недостаточно для эффективной индукции и развития первичных побегов. Более же высокое содержание БАП в среде (1.0 мг/л) подавляет развитие эксплантов и рост побегов в высоту.

Для увеличения количества индуцированных побегов рекомендуется рекультивирование первичных эксплантов с отрезанным пазушным побегом (снятие апикального доминирования) на среде WPM со сниженным содержанием БАП - 0.2 мг/л и добавлением ГК 0.2 мг/л. В этом случае в течение месяца культивирования происходит интенсивное множественное образование дополнительных побегов, отличающихся хорошим ростом (3 5 см) и нормальным развитием. Количество побегов на 1 эксплант составляет 9,6 с варьированием от 6 до 14 побегов.

Таблица 1
Морфогенетическая активность первичных эксплантов летних черенков тополя сереющего в зависимости от гормонального состава питательной среды WPM
№ п/п	БАП мг/л	ГК мг/л	% эксплантов, сформировавших основной побег
Хоперский 1	Приярский
1	0.2	-	8,2±0,5	5,1±0,3
2	0.2	0.2	17,5±1,6	10,8±1,5
3	0.5	-	44,3±4,4	28,0±3,3
4	0.5	0.2	77,4±3,9*	54,4±3,6*
5	1.0	-	21,8±1,5	12,3±0,7
6	1.0	0.2	44,3±4.1	31,2±2.7

3 этап - Укоренение изолированных побегов и их мультипликация (клональное микроразмножение) в условиях in vitro.

Сформировавшиеся пазушные или индуцированные дополнительные побеги (достигшие высоты 1,5 3 см) изолируют и переносят на среду для спонтанного укоренения WPM или 1/2 WPM (с уменьшенным содержанием макросолей) без гормонов. Более крупные побеги перед посадкой разрезают на микрочеренки с одной пазушной почкой размером 1,5 3 см.

Для микроклонального размножения рекомендуется использовать все микрочеренки растения-регенеранта, что может повысить производительность работы. Это связано с отсутствием существенных различий между черенками разного яруса одного растения (верхняя, средняя, нижняя часть побега) по эффективности их укоренения в условиях in vitro. Все одноузловые сегменты хорошо укореняются и имеют нормальный рост.

Мультипликация микрорастений (многократное микрочеренкование, осуществляемое для увеличения численности клона) проводится раз в месяц или раз в 2 месяца на питательных средах WPM или 1/2 WPM без гормонов. Для этого микрочеренки длиной 1 1,5 см, содержащие одну пазушную почку, помещают по 20 штук в один пластиковый контейнер.

Перевод микрорастений в нестерильные условия необходимо проводить без предварительной адаптации в условиях климатической камеры, что позволяет повысить сохранность регенерантов на 20%.

Прямая высадка растений из пробирочной культуры в почву предусматривает отсутствие промежуточного этапа доращивания в лаборатории. Перенос микрорастений из культуральных сосудов непосредственно в нестерильный субстрат теплицы осуществляли весной и летом (май-июль). Растения, преадаптированные в открытых культуральных сосудах, извлекают и пикируют в прямолинейные бороздки, сделанные в хорошо разрыхленном и выровненном грунте.

Проливают слабым раствором марганцовки (KMnO ₄), присыпают почвой, уплотняют. Размещение растений - от 100 до 200 штук на 1 м прямолинейными рядами. Междурядье не менее 10 см. Такое размещение способствует качественному и своевременному уходу (рыхление, прополка) в течение первого вегетационного периода, что, в свою очередь, повышает приживаемость пробирочных растений в почве.

Для получения стандартного посадочного материала (двухлетних саженцев) перезимовавшие в теплице растения ранней весной пересаживают на открытый участок. На этом этапе особое внимание следует уделять срокам высадки растений, от которых существенно зависит не только их приживаемость, но и ростовые процессы.

В течение вегетационного периода необходим уход за растениями (прополка, рыхление, подкормка минеральными удобрениями, например, Кемира-универсал), а в жаркое и сухое лето - ежедневный полив.

Предлагаемый способ способствует в максимальной степени сохранения хозяйственной и генетической ценности исходных экземпляров и позволяет в условиях открытого грунта получать качественный однородный (стандартный) двухлетний посадочный материал.