способ ранней диагностики мастита у коров

Формула изобретения

Способ ранней диагностики мастита у коров, включающий исследование проб молока, отличающийся тем, что проводят люминолиндуцированную хемилюминесценцию с добавлением к 0,5 мл молока 2,0 мл физиологического раствора с люминолом 10^-5 М, измеряют светосумму свечения методом хемилюминесцентного анализа в течение 5 мин при температуре 37°С и при ее значении выше 9,0 у.е. диагностируют мастит.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к животноводству и ветеринарии и может быть использовано для диагностики мастита у коров.

Известен способ диагностики мастита у коров, включающий изучение уровня содержания малонового диальдегида, при значениях более 0,05 единиц оптической плотности диагностируется мастит [патент RU 2182461, 2002 г.]. Недостатком данного метода является его неспецифичность, так как на уровень малонового диальдегида могут влиять не только воспалительные процессы, но и продукты разложения ДНК, липидных и нелипидных молекул.

Известен способ диагностики мастита у коров, характеризующийся тем, что на смесь молока с реактивом воздействуют высокочастотным полем, а в качестве исследуемого параметра используют диэлектрическую проницаемость смеси, которую сравнивают с эталонной, а о степени возникновения мастита судят по разнице в показателях диэлектрической проницаемости опытного и эталонного образцов [патент RU 2210768, 2003 г.]. Способ требует применения специального устройства.

Известен способ диагностики мастита, включающий облучение мочи, молока или вымени коровы видимыми световыми лучами и/или длинноволновыми инфракрасными лучами в диапазоне от 400 до 2500 нм, измерение интенсивности прошедших, отраженных или прошедших/отраженных световых лучей, осуществление многоэлементного, регрессионного анализа, при этом наличие или отсутствие мастита определяют на основании спектров указанных световых лучей [патент RU 2248554, 2005 г.]. Способ требует применения специального устройства.

Известен способ диагностики мастита, заключающийся в исследовании молока на содержание церулоплазмина в нем и при его значении выше 0,4 единиц оптической плотности диагностируется мастит [патент RU 2277246, 2006 г.]. Недостаток данного способа в том, что на уровень медьсодержащего белка в молоке могут влиять, помимо воспалительных процессов, множество других этиологических факторов. Так, снижение церулоплазмина в биологических средах, относящегося к гликопротеидам, отмечается при гепатоцеребральной дистрофии, беременности, апластической анемии, тиреотоксикозе, недостатке отдельных аминокислот и меди в рационах животных [Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: 3-е изд. - М.: Медицина, 2004. - 704 с.].

Известен способ диагностики субклинического мастита у коров, заключающийся в определении среднего по стаду показателя электропроводности молока и определении электропроводности исследуемого образца, для чего наполняют емкость молоком, помещают туда торец датчика, перемешивают 10 секунд, сравнивают разницу между эталонным и исследуемым образцами, при получении разницы в 10% диагностируют субклинический мастит [патент RU 2311759, 2007 г.]. Способ требует применения специального устройства.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ диагностики мастита у коров, основанный на регистрации в молоке соединения, сопутствующего воспалению - нитрита, продуцируемого в молоке иммунокомпетентными клетками, а также образующегося в результате распада нитрозотиолов под воздействием активных форм кислорода [патент RU 2371717, 2009 г.]. Метод предусматривает определение активности эндогенной каталазы. К недостаткам данного метода относятся:

- необходимость использования дорогостоящих реактивов и оборудования, сложность воспроизведения метода;

- неспецифичность метода, так как к ингибиторам каталазы, помимо нитрита, относятся гербициды, например 3-амино-1,2,4-триазол, применяемые в растениеводстве [Зайцев В.В. Свободнорадикальные процессы и метаболизм гидроперекисей внепатоцитах // Гепатоцит / Под ред. Л.Д.Лукьяновой. М.: Наука, 1985. С.125-146; Williams R.N., Delamere N.A., Paterson C.A. Inactivation of catalise with 3-amino-1,2,4-triazole: an indirect irreversible mechanism // Biochem. Pharmacol / 1985. Vol.34, № 18. P.3386-3389.].

Ингибирующее влияние на активность каталазы также оказывает явление гипотиреоза, дефицита железа, аминокислот, повышенное содержание в кормах тиоловых ядов - свинца, ртутьсодержащих пестицидов (гранозан, меркуран, меркургексан), хлорсодержащих ядохимикатов (гептахлор, хлориндан, гексахлоран). Вышеназванные соединения способны блокировать активность SH-группы тиоферментов, например коэнзима А, обеспечивающего процессы костномозгового биосинтеза гемопротеина, являющегося составной частью каталазы.

Задачей изобретения является разработка способа диагностики мастита у коров, обеспечивающего упрощение и повышение точности способа диагностики, сокращение времени исследования.

Технический результат при использовании изобретения - упрощение и повышение точности диагностики, сокращение времени исследования.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе ранней диагностики мастита у коров, включающем исследование проб молока, согласно изобретению проводят люминолиндуцированную хемилюминесценцию с добавлением к 0,5 мл молока 2,0 мл физиологического раствора с люминолом 10^-5 М, измеряют светосумму свечения методом хемилюминесцентного анализа в течение 5 минут при температуре 37°С и при ее значении выше 9,0 у.е. диагностируют мастит.

Сущность изобретения поясняется фигурой, на которой представлена типичная хемилюминограмма молока, где: 1 - молоко коровы с диагностированным маститом; 2 - молоко клинически здоровой коровы.

Предлагаемый способ ранней диагностики осуществляют следующим образом: настраивают прибор «Хемилюминомер» (ХЛ-003) по программе: «Мешалка-выключено», «Термостат-включен», «Время измерения-5 минут». В кювету прибора помещают 0,5 мл молока, индуцируют хемилюминесценцию введением в молоко 2,0 мл физиологического раствора с люминолом 10^-5 М при температуре в среде исследования 37°С. Определяют светосумму свечения и при ее значениях выше 9,0 у.е. диагностируют мастит.

Воспалительные заболевания вымени, индуцированные преимущественно стрептококками и стафилококками, сопровождаются активацией антибактериальных факторов молока, к числу которых относятся фагоцитирующие клетки (лейкоциты и моноциты).

Конечная цель фагоцитоза - обезвреживание микроорганизмов - обеспечивается процессами окисления при помощи генерирования фагоцитами активных форм кислорода (АФК) в результате так называемого «дыхательного взрыва». Воздействие микроорганизмов на мембранные рецепторы лейкоцитов и моноцитов стимулирует мембранные оксидазы, катализирующие перенос с электронов НАДФ·Н на молекулярный кислород с образованием супероксид-анион кислорода . При этом усиливается потребление кислорода, генерируются процессы образования других форм АФК - гидропероксильного (О ₂Н ), гидроксильного (ОН ) радикала, синглетной формы кислорода (¹ O₂), перекиси водорода (H₂O₂ ), гипохлорита (HOCl^-), гипойодида, оксида азота (NO) и пероксинитрита (ONOOH). Поставщиком необходимой энергии для образования АФК служит пентозофосфатный путь окисления глюкозы (респираторный взрыв). Процессы генерации АФК начинаются через 1-2 минуты после взаимодействия мембраны фагоцитов (лейкоцитов, моноцитов) с микроорганизмами и достигают своего максимума через 5-6 минут от начала активации антибактериальных факторов молока. Данный процесс сопровождается свечением, интенсивность которого резко увеличивается в присутствии люминола (5-амино, 2,3-дегидро-4-фталазиндон). Светосумма свечения является интегральным показателем генерации активных форм кислорода при мастите. В отличие от аналогов предлагаемый способ отличается высокой чувствительностью (определяется 10 ^-10 М радикалов), исследование не требует специальной подготовки материала и особых лабораторных условий, процессы измерения свечения ведутся в автоматическом режиме, что позволяет исключить технические ошибки, повысить точность и объективность получаемой информации. Техника регистрации свечения проста и занимает не более 15 минут.

В условиях МУСП «Араслановский» Мелеузовского района Республики Башкортостан было исследовано молоко от 120 коров семминтальской породы в соответствии с ГОСТ 23543 «Молоко. Методы определения соматических клеток» с применением вискозиметра. В ходе исследований диагностирован мастит у 5 голов, что составило 4,1% от общего числа обследованных. Параллельно изучали процессы сверхслабого свечения молока методом хемилюминесцентного анализа, выявлено 8 больных коров, то есть обнаружена субклиническая форма мастита дополнительно у 3-х коров. Таким образом, применение дополнительного метода обследования с использованием заявляемого способа позволило диагностировать мастит у 6,7% животных против 4,1% в контроле.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В лабораторию доставлено 200 мл цельного молока от коровы в возрасте 4,5 года из СПК «Дружба» с подозрением на мастит. В течение часа от момента доставки молока проведен хемилюминесцентный анализ. С целью уточнения предварительного диагноза в кювету с 0,5 мл молока добавили 2,0 мл физиологического раствора с люминолом 10^-5 М. Настроили прибор по программе: «Время измерения - 5 минут», «Мешалка - включена», «Термостат - включен», «Температура инкубации - 37°С». Показатель светосуммы свечения составил 10,5 у.е. На основании этого лабораторным методом был подтвержден диагноз мастит.

Пример 2. В хозяйстве у коровы в возрасте 6,0 лет на основании клинических признаков выставлен предварительный диагноз - мастит. С целью уточнения диагноза проведена проба с димастином. В каждое углубление молочно-контрольной пластины добавляли 1 мл молока из соответствующей четверти вымени и 1 мл 5% раствора димастина. В лунке под № 3 были обнаружены следы образования желе, что расценивается как сомнительная проба. С целью исключения субклинически протекающего мастита пробы молока (секреты) из каждой четверти вымени доставлены в лабораторию в течение 2-х часов с момента взятия в термосе со льдом.

В течение часа с момента доставки проведен хемилюминесцентный анализ. В 4 кюветы внесено 4 порции 0,5 мл молока, каждая из которых представляет секрет одной четверти вымени. Свечение в исследованных образцах индуцировали введением в среду инкубации 2,0 мл физиологического раствора с люминолом 10^-5 М. Светосумма свечения в 1-ом и 2-ом образцах составила 5,2 у.е., а в 3-ем и 4-ом 5,3 у.е. и 4,9 у.е. соответственно, что позволило исключить подозрение на мастит.