иммуностимулирующая композиция для животных

Формула изобретения

Иммуномодулирующая композиция для животных, содержащая в качестве активнодействующего вещества белок сыворотки молока лактоферрин, в качестве растворителя дистиллированную воду, отличающаяся тем, что активнодействующее вещество включает в дополнение к лактоферрину белки сыворотки молока лактоальбумин и лактоглобуллин, при этом активнодействующее вещество представляет собой водный раствор смеси белков сыворотки молока с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий 10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина, 60-70% лактоглобулина, кроме того, указанное активнодействующее вещество дополнительно содержит наночастицы селена при следующем соотношении компонентов, мас.%:

водный раствор смеси белков сыворотки молока с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий 10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина, 60-70% лактоглобулина 0,1-100, наночастицы селена 0,0001-1,0, дистиллированная вода до 100.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано как иммуностимулирующее средство.

В настоящее время в схемы лечения и профилактики заболеваний как заразной, так и незаразной этиологии включают ряд иммуностимулирующих лекарственных средств для повышения общей сопротивляемости организма или его неспецифического иммунитета, а также влияния на специфические иммунные реакции. Различают несколько групп иммуностимулирующих препаратов. Первую группу иммуностимуляторов представляют синтетические иммуностимуляторы. В нее входят: левамизол (декарис), леакадин, диуцифон и т.д. Вторая группа представлена эндогенными иммуностимуляторами и их синтетическими аналогами. Она включает препараты тимуса, красного костного мозга, селезенки и их синтетические аналоги (тималин, тимоген, тактивин (Т-активин), тимоптин, тимактид, тимостимулин, имунофан, миелопид, спленин), иммуноглобулины (человеческий поливалентный иммуноглобулин (интраглобин)), интерфероны (человеческий иммунный интерферон-гамма, рекомбинантный интерферон-гамма (гаммаферон, имукин)), интерлейкины (рекомбинантный интерлейкин-2 (альдеслейкин, пролейкин, ронколейкин), рекомбинантный интерлейкин 1-бета (беталейкин) и т.д.). В третью группу входят препараты микробного происхождения и их синтетические аналоги (пирогенал, продигиозан, рибомунил, имудон, ликопид и т.д.). Четвертая группа представлена препаратами различных фармакологических классов с иммуностимулирующей активностью. В нее входят адаптогены и препараты растительного происхождения (дибазол, бемитил, препараты эхинацеи, элеутерококка, женьшеня, родиолы розовой, тонзилгон Н и т.д.), а также витамины (кислота аскорбиновая (витамин С), токоферола ацетат (витамин Е), ретинола ацетат (витамин А)).

Наиболее близким к заявляемому изобретению является инъекционный лечебный ветеринарный препарат «Полиферрин-А», содержащий активно действующее вещество лактоферрин, выделяемый из молозива животных (http://www.narvac.com/art_poliferrin.htm, http://www.webvet.ru/equipment.asp?e_id=1954; http://www.veterinarka.ru/content/view/1142). Лактоферрин является природным гликопротеином млекопитающих, он относится к железосодержащим белкам, отвечающим за первичную защиту организма в качестве иммуностимулирующего вещества (http://www.narvac.com/art_laktoferrin3.htm: Лактоферрин как модулятор иммунного и воспалительного процессов. D.Legrand, E.Elass, M.Carpentier and J.Mazurier). Однако полиферрин-А недостаточно активно стимулирует клеточный иммунитет у животных, в ряде случаев вызывает аллергические реакции.

Технической задачей является повышение иммуностимулирующего воздействия на клеточный и гуморальный иммунитет.

Технический результат, который может быть получен от использования заявляемой композиции, - это усиление функциональной активности препарата, в том числе повышение стимулирующего влияния не только на клеточный, но и на гуморальный иммунитет, путем непосредственной презентации активных компонентов препарата в клетки ретикулоэндотелиальной системы.

Технический результат достигается тем, что иммуномодулирующая композиция для животных содержит в качестве активно действующего вещества белок сыворотки молока лактоферрин, в качестве растворителя дистиллированную воду, согласно изобретению активно действующее вещество включает в дополнение к лактоферрину белки сыворотки молока лактоальбумин и лактоглобуллин, при этом активно действующее вещество представляет собой водный раствор смеси белков сыворотки молока с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий 10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина, 60-70% лактоглобуллина, кроме того, указанное активно действующее вещество дополнительно содержит наночастицы селена, при следующем соотношении компонентов, масс.%:

водный раствор смеси белков сыворотки молока
с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий
10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина,
60-70% лактоглобуллина	0,1-10,0
наночастицы селена	0,0001-1,0
дистиллированная вода	до 100.

Новым является то, что совместное применение в активно действующем веществе 3 белков сыворотки молока - лактоферрина, лактоальбумина и лактоглобуллина, и введение в активно действующее вещество наночастиц селена впервые предложены для использования в качестве иммуностимулирующего препарата. Три указанные белка в сочетании друг с другом повышают стимулирующее действие активно действующего вещества. Наночастицы селена, включенные в состав активно действующего вещества, придают композиции дополнительный антиоксидантный эффект.

Иммуностимулирующую композицию для животных готовят следующим образом. Из цельного коровьего молока получают кислую молочную сыворотку, состоящую из лактоглобуллина, лактоальбумина, иммуноглобулинов, лактоферрина и других белков, путем створаживания лимонной кислотой. Белки из данной сыворотки извлекают путем осаждения их сернокислым аммонием. Полученный осадок растворяют дистиллированной водой до получения белковой взвеси, из которой отделяют смесь лактоферрина, лактоальбумина, лактоглобуллина: для этого белковую взвесь подвергают диализу при помощи диализных мембран с диаметром пор 12000-14000 Да с целью удаления белковых веществ с молекулярной массой менее 12000 Да. По окончании диализа получают водный раствор смеси трех белков, в котором содержится 10-20% лактоферрина (молекулярная масса 75000-80000 Да), 20-30% лактоальбумина (молекулярная масса 18000 Да), 60-70% лактоглобуллина (молекулярная масса 67000 Да). При таком способе получения смеси наличие трех указанных белков и их процентное соотношение являются постоянными, что подтверждено авторами изобретения путем проведения исследований водного раствора смеси трех белков методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле с применением стандартов (http://molbiol.ru/protocol/17_01.html). Данные проведенных исследований обработаны статистически с использованием критериев Стьюдента. Этим же способом электрофореза подтверждены вышеуказанные показатели молекулярной массы белков лактоферрина, лактоальбумина, лактоглобуллина.

В полученном водном растворе смеси трех белков (лактоферрин, лактоальбумин, лактоглобуллин) определяют концентрацию общего белка. Если концентрация общего белка больше 10 г/л, то данный раствор разбавляют дистиллированной водой до концентрации 10 г/л. Затем в композицию вводят наночастицы селена следующим образом. В водный раствор смеси трех белков добавляют 1М раствор солянокислого гидразина и 1М раствор селенита натрия NaSeO₄, затем объем полученной смеси доводят дистиллированной водой до 100 мас.%. Останавливают реакцию доведением рН раствора до 7,2 1М раствором гидроксида натрия и освобождают от низкомолекулярных соединений диализом против дистиллированной воды. В итоге получают иммуностимулирующую композицию для животных, содержащую:

водный раствор смеси белков сыворотки молока
с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий
10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина,
60-70% лактоглобуллина	0,1-10,0
наночастицы селена	0,0001-1,0
дистиллированная вода	до 100

Селен в иммуностимулирующей композиции для животных находится в наноразмерном состоянии: размер частиц коллоидного селена в препарате составляет от 60 до 140 нм, что подтверждено путем электронного микроскопирования на электронном микроскопе LIBRA 120 (Carl Zeiss, Германия).

Пример 1

Водный раствор смеси белков сыворотки молока
с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий
10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина,
60-70% лактоглобуллина	0,1
наночастицы селена	0,0001
дистиллированная вода	до 100

Пример 2

Водный раствор смеси белков сыворотки молока
с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий
10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина,
60-70% лактоглобуллина	5,0
наночастицы селена	0,01
дистиллированная вода	до 100

Пример 3

Водный раствор смеси белков сыворотки молока
с концентрацией общего белка 10 г/л, содержащий
10-20% лактоферрина, 20-30% лактоальбумина,
60-70% лактоглобуллина	10,0
наночастицы селена	1,0
дистиллированная вода	до 100

Для установления повышения иммуностимулирующих свойств заявляемой композиции по сравнению с аналогами было изучено:

- влияние иммуностимулирующей композиции на клеточный иммунный ответ (проведены исследования по влиянию иммуностимулирующей композиции на выживаемость стафилококка в присутствии перитонеальных клеток животных);

- влияние иммуностимулирующей композиции на гуморальный иммунный ответ (проведены исследования по влиянию иммуностимулирующей композиции на эффективность иммунизации животных);

- влияние иммуностимулирующей композиции на неспецифическую резистентность организма (проведены исследования по влиянию иммуностимулирующей композиции на окислительно-восстановительную активность клеток).

При проведении исследований по влиянию иммуностимулирующей композиции на выживаемость стафилококка в присутствии перитонеальных клеток животных получали перитонеальные клетки мыши (ПКМ) по стандартной методике в концентрации 3 млн клеток/мл. В эксперименте использовали культуры клеток микроорганизмов Staphylococcus aureus 209-P в логарифмической фазе роста на мясопептонном бульоне с получением концентрации стафилококка 200 млн КОЕ/мл и 20 млн КОЕ/мл.

В 1-м варианте исследований (таблица 1) смешивали:

I. перитонеальные клетки мыши в концентрации 3 млн клеток/мл, культуры клеток указанных микроорганизмов в концентрации 200 млн КОЕ/мл и иммуностимулирующую композицию.

II. перитонеальные клетки мыши в концентрации 3 млн клеток/мл, культуры клеток указанных микроорганизмов в концентрации 20 млн КОЕ/мл и иммуностимулирующую композицию.

Во 2-м варианте исследований (таблица 1) смешивали:

I. перитонеальные клетки мыши в концентрации 3 млн клеток/мл, культуры клеток указанных микроорганизмов в концентрации 200 млн КОЕ/мл.

II. перитонеальные клетки мыши в концентрации 3 млн клеток/мл, культуры клеток указанных микроорганизмов в концентрации 20 млн КОЕ/мл.

В 3-м варианте исследований (таблица 1) смешивали:

I. культуры клеток указанных микроорганизмов в концентрации 200 млн КОЕ/мл и иммуностимулирующую композицию.

II. культуры клеток указанных микроорганизмов в концентрации 20 млн КОЕ/мл и иммуностимулирующую композицию.

В 4-м варианте исследований (таблица 1) изучали:

I. культуры клеток указанных микроорганизмов в концентрации 200 млн КОЕ/мл.

II. культуры клеток указанных микроорганизмов в концентрации 20 млн КОЕ/мл.

Во всех вариантах исследования полученные культуры инкубировали 40 мин при 37°С, определяли число КОЕ стафилококка высевом разведений исходных образцов на солевой мясопептонный агар и подсчетом числа выросших колоний. Рассчитывали активность фагоцитоза ПКМ по формуле:

АФ=100×(а-б)/а,

где а - концентрация стафилококка в 4-м варианте, б - концентрация стафилококка в 1-м варианте, или 2-м варианте, или 3-м варианте исследования.

Результаты исследований отражены в графах 7 и 8 таблицы 1.

При оценке результатов исследований (таблица 1):

- сравнивали показатели концентрации клеток стафилококка по истечении инкубации 4-го варианта исследований с аналогичными показателями 1, 2 и 3-го вариантов: в 1-м варианте выживаемость стафилококка заметно падает, во 2-м варианте отмечается незначительное подавление роста стафилококка и в 3-м варианте установлено, что иммуностимулирующая композиция не обладает бактериостатическим эффектом в отношении стафилококка, что свидетельствует об отсутствии отрицательного воздействия иммуностимулирующей композиции на клетки живого организма;

- анализировали показатели активности фагоцитоза ПКМ: в 1-м варианте в результате воздействия иммуностимулирующей композиции на ПКМ активизируется клеточный иммунитет, что выражается в задержке роста стафилококка за счет повышения фагоцитарной активности ПКМ в 2-8 раз по сравнению со 2-м вариантом.

При проведении исследований по влиянию иммуностимулирующей композиции на гуморальный иммунный ответ выполняли исследование влияния иммуностимулирующей композиции на эффективность иммунизации. В эксперименте использовали 3 группы мышей по 3 животных в каждой. Мышам первой группы (контроль) на протяжении всей иммунизации вводили внутрибрюшинно биомассу полевого изолята Salmonella thyphimurium, убитой нагреванием. Мышам второй группы вводили внутрибрюшинно смесь биомассы сальмонеллы и иммуностимулирующей композиции, доза которой составляла 0,4 мл на 20 г живой массы. Мыши третьей группы получали внутрибрюшинно иммуностимулирующую композицию в указанной выше дозе и через сутки - биомассу сальмонеллы. Доза влажной биомассы сальмонелл во всех группах составляла 0,2 мг на 20 г живой массы. Иммунизацию проводили с интервалом 2 недели - всего 4 введения. Перед забоем проводили бустирование биомассой сальмонелл. Титр агглютинирующих антител в сыворотках экспериментальных животных определяли, используя метод радиальной иммунодиффузии в 1,5% агаровом геле. В таблице 2 представлены результаты определения титра агглютинирующих AT в сыворотках иммунизированных мышей.

Таблица 2
Титры агглютинирующих AT против сальмонеллы в сыворотках мышей, иммунизированных биомассой сальмонеллы совместно или параллельно с иммуностимулирующей композицией
№ п/п	Степень разведения сыворотки	Зона преципитации
1 группа	2 группа	3 группа
1	1	56,25	64	52,5625
2	2	49	56,25	49
3	4	36	49	36
4	8	30,25	42,25	30,25
5	16	20,25	36	27,5625
6	32	20,25	30,25	20,25
7	64	12,25	20,25	12,25
8	128	0	12,25	0
9	256	0	9	0
10	512	0	0	0

Как видно из таблицы 2, наиболее высокий титр AT обнаружен в сыворотке мышей, иммунизированных смесью сальмонелл и иммуностимулирующей композиции. У мышей, иммунизированных только биомассой, и мышей, иммунизированных биомассой через день после инъекции имммуностимулирующей композиции, титры AT одинаковы и существенно ниже, чем у животных, получавших иммуностимулирующую композицию и антиген одновременно. Иммунизация биомассой сальмонелл совместно с иммуностимулирующей композицией происходит эффективнее, при этом предварительная, за день до иммунизации, инъекция иммуностимулирующей композиции не сказывается на уровне AT в сыворотке по сравнению с контролем. Вывод: иммуностимулирующая композиция при иммунизации стимулирует фагоцитоз корпускулярного антигена, способствуя тем самым более полной и эффективной его презентации иммунной системе макроорганизма.

При изучении влияния иммуностимулирующей композиции на неспецифическую резистентность организма проводили исследование влияния иммуностимулирующей композиции на окислительно-восстановительную активность клеток. В одном варианте исследования препарат по прототипу вносили в монослойную культуру клеток в дозе 0,5 мл на 10 мл среды, во втором варианте исследования препарат по предлагаемой композиции вносили в монослойную культуру клеток в дозе 0,5 мл на 10 мл среды. Исследования проводили на клеточной линии SPEV-2. Культивирование проводили в течение 48 часов, после чего клетки снимались трипсинизацией и у них определялась интенсивность дыхания в МТТ тесте. В таблице 3 отражены сравнительные показатели изменения дыхательной активности в клеточной популяции при культивировании их в присутствии препарата по прототипу и предлагаемой иммуностимулирующей композиции (Р<=0,05).

Таблица 3
Сравнительные показатели изменения дыхательной активности в клеточной популяции при культивировании их в присутствии препарата по прототипу и предлагаемой иммуностимулирующей композиции (Р<=0,05)
Показатель	Монослойная культура клеточной линии SPEV-2 (Контроль)	Препарат по прототипу + монослойная культура клеточной линии SPEV-2	Иммуностимулирующая композиция + монослойная культура клеточной линии SPEV-2
Концентрация формазана в 1 клетке, Нг/мл	0,015217±	0,02545±	0,071245±
0,003381	0,005653	0,012305

Как видно из табл.3, при культивировании клеток в присутствии иммуностимулирующей композиции повышается дыхательная активность в 4 раза, по сравнению с контролем, а также более чем в 2 раза по сравнению с препаратом по прототипу, что свидетельствует о способности предлагаемой иммуностимулирующей композиции для животных активировать окислительно-восстановительные процессы клеточного метаболизма.