онкоген nrf2 и его применение

Формула изобретения

1. Способ прогнозирования реакции больного раком на агент, который ингибирует экспрессию или активность mTOR или биологический путь mTOR, включающий:

детектирование ДНК или РНК, кодирующей мутантный белок NRF2 или детектирование мутантного белка NRF2 в образце опухоли, взятом у больного; и

ассоциирование измеренного уровня ДНК или РНК, кодирующей мутантный белок NRF2, или мутантного белка NRF2, с реакцией рака у больного на связанный с mTOR противораковый препарат,

где более высокий уровень экспрессии ДНК или РНК, кодирующей мутантный белок NRF2, или мутантного белка NRF2, при сравнении с пациентом, чей ответ на связанный с mTOR противораковый препарат был слаб, или с пациентом, чей ответ на связанный с mTOR противораковый препарат известен как слабый, указывает на то, что пациент хорошо отвечает на связанный с mTOR противораковый препарат,

где мутантный белок NRF2 является белком, в котором триптофан в позиции 24 белка NRF2 замещен на цистеин или лизин, глутамин в позиции 26 белка NRF2 замещен на глутаминовую кислоту, изолейцин в позиции 28 белка NRF2 замещен на глицин, лейцин в позиции 30 белка NRF2 замещен на фенилаланин, глицин в позиции 31 белка NRF2 замещен на аланин, глутамин в позиции 75 белка NRF2 замещен на гистидин, аспарагиновая кислота в позиции 77 белка NRF2 замещена на валин или глицин, глутаминовая кислота в позиции 79 белка NRF2 замещена на лизин, треонин в позиции 80 белка NRF2 замещена на лизин или пролин, и/или глутаминовая кислота в позиции 82 белка NRF2 замещена на аспарагиновую кислоту.

2. Способ по п.1, в котором указанный агент ингибирует экспрессию или активность mTOR, PI3K, PDK1, FKBP12, Akt, S6K1, JNK или HIF1 альфа.

3. Способ по п.1, в котором указанный агент ингибирует экспрессию или активность mTOR или PI3K.

4. Способ по п.1, в котором указанный агент ингибирует экспрессию или активность mTOR.

5. Способ прогнозирования реакции рака у больного на агент, который ингибирует экспрессию или активность mTOR или биологический путь mTOR, из образца опухоли, взятого у больного, включающий:

детектирование ДНК или РНК, кодирующей мутантный белок NRF2, или детектирование мутантного белка NRF2 в образце опухоли, взятом у больного;

отнесение к одному из классов реакции рака с заданным уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутантный ген NRF2, или с заданным уровнем мутантного белка NRF2, где представители, которые принадлежат к определенному классу реакции рака демонстрируют тот одинаковый или похожий ответ на связанный с mTOR противораковый препарат в соответствии с выявленным уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутантный ген NRF2, или с выявленным уровнем мутантного белка NRF2, причем результат классификации зависит от уровня экспрессии ДНК или РНК, кодирующей мутантный белок NRF2, или от уровня экспрессии мутантного белка NRF2; и

предсказание реакции рака у больного на противораковый препарат, где отнесение к более высокому уровню ДНК или РНК, кодирующей мутантный ген NRF2, или к более высокому уровню мутантного белка NRF2 при сравнении с пациентом, чей ответ на связанный с mTOR противораковый препарат был слаб, или пациентом, чей ответ на связанный с mTOR противораковый препарат известен как слабый, означает более сильную реакцию на указанный агент,

где мутантный белок NRF2 является белком, в котором триптофан в позиции 24 белка NRF2 замещен на цистеин или лизин, глутамин в позиции 26 белка NRF2 замещен на глутаминовую кислоту, изолейцин в позиции 28 белка NRF2 замещен на глицин, лейцин в позиции 30 белка NRF2 замещен на фенилаланин, глицин в позиции 31 белка NRF2 замещен на аланин, глутамин в позиции 75 белка NRF2 замещен на гистидин, аспарагиновая кислота в позиции 77 белка NRF2 замещена на валин или глицин, глутаминовая кислота в позиции 79 белка NRF2 замещена на лизин, треонин в позиции 80 белка NRF2 замещена на лизин или пролин, и/или глутаминовая кислота в позиции 82 белка NRF2 замещена на аспарагиновую кислоту.

6. Способ по п.5, в котором указанный агент ингибирует экспрессию или активность mTOR, PI3K, PDK1, FKBP12, Akt, S6K1, JNK или HIF1 альфа.

7. Способ по п.5, в котором указанный агент ингибирует экспрессию или активность mTOR или PI3K.

8. Способ по п.5, в котором указанный агент ингибирует экспрессию или активность mTOR.

9. Набор для использования в способе прогнозирования реакции больного раком на связанный с mTOR противораковый препарат, который включает

i) вещество, которое не связывается с геном NRF2, но связывается с ДНК или РНК, кодирующей конкретный мутантный белок NRF2, как это определено в способе по п.1, и

ii) вещество (являющееся контролем), которое связывается с геном NRF2, но не связывается с ДНК или РНК, кодирующей конкретный мутантный белок NRF2, как это определено в способе по п.1.

10. Набор для использования в способе прогнозирования реакции больного раком на связанный с mTOR противораковый препарат, который включает

i) вещество, которое не связывается с белком NRF2, но связывается с мутантным белком NRF2, как это определено в способе по п.1, и

ii) вещество (являющееся контролем), которое связывается с белком NRF2, но не связывается с мутантным белком NRF2, как это определено в способе по п.1.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области прогнозирования эффективности противораковых препаратов, предсказания прогноза при раке и лечения рака. В частности, настоящее изобретение касается способа прогнозирования эффективности связанных с mTOR противораковых препаратов путем выявления нарушений NRF2, способа предсказания прогноза при раке путем выявления нарушений NRF2 и средств лечения рака, ингибирующих ген или белок NRF2.

Уровень техники

Известно, что такие факторы окружающей среды, как курение, радиация, хроническое воспаление, вызванное вирусной инфекцией и т.п., и воздействие токсических химических веществ, влияют на возникновение и протекание рака. Предшествующие исследования показали, что окислительный стресс, вызванный факторами, вызывающими нарушения ДНК и белка, сопровождает возникновение рака.

Живой организм обладает физиологическим защитным механизмом против такого окислительного стресса. Одной из важных молекул, играющих роль в молекулярном механизме данной физиологической защитной системы, признан транскрипционный фактор, называемый ядерным фактором-2, родственным эритроидному фактору 2 (NRF2). NRF2 является ДНК-связывающей молекулой с высокой способностью к индуцированию транскрипции, которая активируется при воздействии на клетку окислительного стресса и индуцирует экспрессию многих групп ферментов типа глютатионредуктазы, которые снимают окислительный стресс, защищая клетку от нарушений, вызванных стрессом.

Например, NRF2 известен как важный транскрипционный фактор, который передает стимулирующий сигнал на компонент антиоксидантного реагирующего элемента (ARE), который представляет собой ДНК-регулирующий элемент, контролирующий транскрипцию генных продуктов, защищающих клетки от канцерогенов, оксидантов и других токсических соединений. Сообщалось, что энхансер, действующий через ARE, обладающий противораковой активностью, повышает уровень NRF2 в ядре (см. Yuesheng et al., Molecular Cancer Therapeutics, 3 (7) 885-893, 2004). На модели с пероральным введением бензо- -пирана оказалось, что количество опухолей у мышей с нокаутом NRF2 повышается по сравнению с диким типом (см. Ramos-Gomez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 3410-3415, 2001). Кроме того, в этой работе показано, что противораковое средство олтипраз усиливает экспрессию NRF2, но противораковый эффект олтипраза не наблюдается у мышей с нокаутом NRF2, так что усиление экспрессии NRF2 может вести к противораковому действию.

Кроме того, сообщалось, что у живых организмов наличие NRF2 контролируется по отрицательной обратной связи Kelch-подобным ЕСН-связанным белком 1 (КЕАР1), причем ингибитор КЕАР1 сейчас разрабатывается в качестве противоракового средства (см. Ewan, Drug Discovery Today, 10 (14) 950-951, 2005). Таким образом, следует ожидать, что препараты, направленные на NRF2 или КЕАР1, которые усиливают экспрессию NRF2, могут применяться в качестве противораковых средств.

С другой стороны, сообщается, что при раке легких наблюдается постоянная активация NRF2 вследствие снижения активности КЕАР1, вызванного мутацией гена КЕАР1, а активированный NRF2 индуцирует постоянную экспрессию антиоксидантного белка. Сообщали, что усиление экспрессии NRF2 может быть одной из причин устойчивости раковых клеток к цисплатине (см. Ohta et al., Cancer Res., 68, 1303-1309, 2008; и International Publication WO 2006/128041). Также сообщали, что введение алкилирующих средств, как-то цисплатина, мефалана, хлорамбуцила и BCNU, ведет к усилению экспрессии такого гена, регулируемого ARE, как NRF2. Предполагается, что усиление экспрессии продуктов генов, регулируемых ARE, может участвовать в устойчивости раковых клеток к противораковым средствам. Также предполагается, что all-транс-ретиноевая кислота (ATRA), которая способна связывается с NRF2, может усиливать эффект химиотерапевтических препаратов (см. International Publication WO 2008/012534).

Таким образом, оказывается, что введение алкилирующих противораковых средств может активировать NRF2, а NRF2 может играть роль в устойчивости к алкилирующим противораковым средствам. Алкилирующие противораковые средства препятствуют пролиферации путем образования поперечных связей между основаниями ДНК в раковых клетках. Механизм активации NRF2 при введении алкилирующих средств пока еще не ясен. Хотя часть механизма приобретения вызванной NRF2 устойчивости к действию алкилирующих противораковых средств вытекает из цитопротекторного действия NRF2, однако полного понимания еще нет. Еще не было сообщений о связи между NRF2 и другими противораковыми средствами, чем алкилирующие противораковые средства.

Как отмечено выше, активация NRF2, наблюдавшаяся в раковых клетках, главным образом рассматривается, исходя из снижения активности КЕАР1 вследствие мутации гена КЕАР1. Связь между мутацией и активацией NRF2 в раковых клетках и связь между активацией NRF2 вследствие мутации и злокачественным перерождением при раке пока не известна. В частности, поскольку считается, что NRF2 обладает противораковым действием при возникновении рака, вызванном окислительным стрессом, то полагают, что NRF2 скорее подавляет злокачественное перерождение при раке. В связи с химиотерапевтическими препаратами предполагалось, что NRF2 реагирует на введение алкилирующих средств, по крайней мере, all-транс-ретиноевая кислота усиливает эффект алкилирующих средств. Однако пока еще совершенно неизвестно, основывается ли эффект all-транс-ретиноевой кислоты на подавлении NRF2, а если так, то какой механизм лежит в основе ингибирования. Таким образом, связь между подавлением NRF2 и другими противораковыми средствами, чем алкилирующие противораковые средства, еще совсем не ясна.

Мишень рапамицина у млекопитающих (mTOR) представляет собой сериновую/треониновую киназу, которая идентифицирована как мишень макролидного антибиотика - рапамицина и служит регулятором роста клеток, пролиферации клеток, клеточной подвижности, жизнеспособности клеток, синтеза белка и транскрипции. Поскольку рапамицин вызывает апоптоз у раковых клеток с отсутствием функции р53, то считается, что ингибиторы mTOR обладают противораковым действием (см. Shile Huang et al., Molecular Cell, 11, 1491-1501, 2003). К тому же ингибиторы mTOR уже разрабатываются как противораковые средства, к примеру, при раке почек и раке протока поджелудочной железы.

mTOR также известен как тирозиновая киназа инсулиновых рецепторов. При исследовании апоптоза церебрально-васкулярных эндотелиальных клеток у больных гипергликемией сделан вывод, что ингибитор mTOR нарушает экспрессию индуцируемой инсулином, опосредованной NRF2 каталитической субъединицы глутамат-L-цистеин-лигазы (GCLc), окислительно-восстановительный баланс и жизнеспособность церебрально-васкулярных эндотелиальных клеток человека (см. Okouchi, Masahiro et al., Current Neurovascular Research, 3 (4) 249-261, 2006). Однако, особенно в сфере лечения рака, еще не было сообщений об эффекте экспрессии NRF2 на действие ингибиторов mTOR.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение касается способа прогнозирования рака путем выявления мутаций гена NRF2. В частности, настоящее изобретение касается способа прогнозирования эффективности связанных с mTOR противораковых препаратов, способа отбора эффективных пациентов путем выявления мутаций гена NRF2 и способа предсказания прогноза при раке. Настоящее изобретение также касается способа лечения рака путем ингибирования гена NRF2 или белка NRF2, либо средства для лечения рака, в котором в качестве активного ингредиента используется ингибитор гена NRF2 или белка NRF2.

В отдельном воплощении настоящее изобретение касается способа получения информации о способе отбора для прогнозирования эффективности связанных с mTOR противораковых препаратов или способе отбора эффективных пациентов путем выявления мутаций гена NRF2 или белка. Кроме того, настоящее изобретение касается способа прогнозирования эффективности связанных с mTOR противораковых препаратов или способа отбора эффективных пациентов путем выявления мутаций гена или белка NRF2. В частности, настоящее изобретение касается способа прогнозирования того, что связанный с mTOR противораковый препарат будет эффективным при мутации гена или белка NRF2. Настоящее изобретение также касается набора, способного выявлять мутации в NRF2 для прогнозирования эффективности связанных с mTOR противораковых препаратов. К примеру, настоящее изобретение касается набора, содержащего нуклеиновую кислоту, способную связываться с геном NRF2, либо вещество, способное связываться с белком NRF2 (напр., антитело), причем нуклеиновая кислота и это вещество способны выявлять мутации NRF2. С другой стороны, настоящее изобретение касается набора, способного выявлять изменения в функционировании NRF2 вследствие мутации. К примеру, настоящее изобретение также касается набора, выявляющего расщепление NRF2 под действием КЕАР1.

В другом воплощении настоящее изобретение касается способа получения информации о злокачественности рака либо о прогностическом качестве путем выявления мутаций NRF2 в клетках раковых тканей от больных раком. С другой стороны, настоящее изобретение касается способа диагностики злокачественности рака или предсказания прогноза при раке, который включает выявление мутаций NRF2 в клетках раковых тканей от больных раком и диагностирование больных с мутацией в NRF2 как злокачественных или предсказание плохого прогноза у больных с мутацией в NRF2. С другой стороны, настоящее изобретение касается набора для диагностики рака или предсказания прогноза, который способен выявлять мутации в NRF2. К примеру, настоящее изобретение касается набора, содержащего нуклеиновую кислоту, способную связываться с геном NRF2, либо вещество, способное связываться с белком NRF2, типа антитела, причем нуклеиновая кислота и это вещество способны выявлять мутации в NRF2. Кроме того, настоящее изобретение касается набора, способного выявлять мутации по технологии амплификации гена типа ПЦР. Далее, настоящее изобретение касается набора, содержащего зонд-инвейдер, аллельный зонд, триплекс-специфичную ДНКазу и универсальный зонд с флуоресцентной меткой и гасителем зонда, например, набора для анализа Invader и др. Кроме того, настоящее изобретение включает и набор, способный измерять метергазию NRF2, вызванную мутацией. К примеру, настоящее изобретение также касается набора, способного выявлять расщепление NRF2 под действием КЕАР1.

В другом воплощении настоящее изобретение касается способа лечения рака, включающего ингибирование гена NRF2 или белка NRF2. Настоящее изобретение включает способ лечения рака, включающий подавление экспрессии гена NRF2. Кроме того, настоящее изобретение касается способа лечения рака, включающего подавление экспрессии или активности белка NRF2. Далее, настоящее изобретение касается противораковых препаратов, содержащих ингибиторы гена NRF2 или белка NRF2. В частности, настоящее изобретение касается средств для лечения рака, включающих в качестве активного ингредиента антисмысловую НК, дцРНК, рибозим, аптамер для NRF2, фрагмент NRF2-связывающего белка либо антитело или его фрагмент.

Более конкретно, настоящее изобретение касается следующих изобретений.

(1) Способ получения информации для прогнозирования реакции больных раком на связанные с mTOR противораковые препараты, включающий:

(a) детектирование ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2 в образце, взятом у больного; и

(b) ассоциирование измеренного уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, с реакцией рака у больного на связанный с mTOR противораковый препарат.

(2) Способ получения информации для прогнозирования реакции рака у больных на связанные с mTOR противораковые препараты из образца опухоли, взятого у больного, включающий:

(a) детектирование ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2 в образце, взятом у больного; и

(b) отнесение к одному из классов реакции рака в соответствии с выявленным уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, причем результат классификации зависит от уровня экспрессии мутировавшего гена NRF2 или мутировавшего белка NRF2; и

(c) предсказание реакции рака у больного на противораковый препарат, исходя из известного свойства, присущего видам рака, принадлежащим к тому классу реакции рака, к которому он отнесен.

(3) Способ согласно (2), в котором высокий уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, означает, что больной хорошо реагирует на связанный с mTOR противораковый препарат.

(4) Набор для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат, который включает по меньшей мере одно из веществ от (i) до (iv):

(i) вещество, которое связывается с ДНК или РНК, кодирующей NRF2, но не связывается с ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2;

(ii) вещество, которое не связывается с геном NRF2, но связывается с мутировавшим геном NRF2;

(iii) вещество, которое связывается с белком NRF2, но не связывается с мутировавшим белком NRF2; и

(iv) вещество, которое не связывается с белком NRF2, но связывается с мутировавшим белком NRF2.

(5) Способ получения информации для предсказания прогноза у больных раком, включающий:

(a) детектирование ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2 в образце, взятом у больного; и

(b) ассоциирование измеренного уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, с прогнозом для больного.

(6) Способ согласно (5), в котором высокий уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, означает плохой прогноз для больного.

(7) Противораковый препарат, содержащий ингибитор NRF2 в качестве активного ингредиента.

(8) Противораковый препарат согласно (7), в котором ингибитор NRF2 представляет собой антисмысловую НК, дцРНК, рибозим, аптамер для NRF2, фрагмент NRF2-связывающего белка либо антитело или его фрагмент.

Способ прогнозирования эффективности по настоящему изобретению способен предсказать реакцию больного раком на связанный с mTOR противораковый препарат или предсказать, будет ли связанный с mTOR противораковый препарат оказывать действие на больного раком еще до введения. Таким образом, настоящее изобретение позволяет выбрать препарат, который будет эффективным для больного раком, и избежать введения ненужного противоракового препарата больному, который не будет на него эффективно реагировать, и тем самым освободить больного от тяжести нежелательных побочных эффектов. Настоящее изобретение может предоставить информацию для выбора противораковых препаратов. Кроме того, настоящее изобретение может предоставить информацию для выбора режима лечения больных раком путем предсказания прогноза для больного раком. Более того, способ ингибирования гена NRF2 или белка NRF2 по настоящему изобретению или лечебный препарат настоящего изобретения, содержащий ингибитор гена NRF2 или белка NRF2, могут применяться в качестве нового способа лечения или нового препарата для лечения рака.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлен биологический путь, связанный с mTOR.

На фиг.2 представлены положения мутаций в гене NRF2 и вызванных ими замен аминокислот в клинических образцах рака пищевода и клетках раковых линий пищевода (KYSE-50, KYSE-70, KYSE-180).

На фиг.3 представлены результаты выявления экспрессии NRF2 в нормальном пищеводе (А и В) и при раке пищевода (С) методом иммунологического окрашивания с помощью антител против NRF2. На фигуре стрелками обозначены клетки, экспрессирующие NRF2. На фиг.3В приведено увеличенное изображение части фиг.3А.

На фиг.4 представлены результаты статистического анализа (анализа по Kaplan-Meier) взаимосвязи между сроком жизни после операции и наличием или отсутствием мутаций гена при раке пищевода при скрининге на мутации гена NRF2. На фигуре по вертикальной оси приведен кумулятивный показатель выживаемости, а по горизонтальной - сколько дней прошло после операции.

На фиг.5 представлены изменения пролиферации клеток после введения или без введения дцРНК для клеток раковых линий пищевода, содержащих мутации гена NRF2 (KYSE-50 и KYSE-180). На фигуре по вертикальной оси приведено отношение числа клеток, получавших дцРНК NRF2, к числу клеток, получавших контрольную дцРНК.

На фиг.6 представлены изменения пролиферации вследствие обработки рапамицином для клеток раковых линий пищевода без отклонений в гене NRF2 (KYSE-30, KYSE-140, KYSE-170, KYSE-270) и для клеток раковых линий с отклонениями в гене NRF2 (KYSE-50, KYSE-70, KYSE-180). На фигуре по вертикальной оси приведено отношение числа клеток по каждой линии клеток, при этом за 100% принимали число клеток при 0 нМ рапамицина (без препарата). По горизонтальной оси приведена дозировка рапамицина.

На фиг.7 представлены изменения пролиферации вследствие обработки рапамицином для клеток раковых линий легких без отклонений в гене NRF2 (SQ-5, QG-56) и для клеток раковых линий с отклонениями в гене NRF2 (LK-2, ЕВС-1). На фигуре по вертикальной оси приведено отношение числа клеток по каждой линии клеток, при этом за 100% принимали число клеток при 0 нМ рапамицина (без препарата). По горизонтальной оси приведена дозировка рапамицина.

На фиг.8 представлены изменения пролиферации вследствие обработки рапамицином для клеток раковых линий головы и шеи без отклонений в гене NRF2 (HO-1-N-1, HSC2) и для клеток раковых линий с отклонениями в гене NRF2 (HO-1-u-1). На фигуре по вертикальной оси приведено отношение числа клеток по каждой линии клеток, при этом за 100% принимали число клеток при 0 нМ рапамицина (без препарата). По горизонтальной оси приведена дозировка рапамицина.

Осуществление изобретения

А. Прогнозирование связанных с mTOR противораковых препаратов

В одном аспекте настоящее изобретение касается способа или набора для прогнозирования реакции больных раком на связанные с mTOR противораковые препараты либо способа получения информации для прогнозирования реакции больных раком на связанные с mTOR противораковые препараты.

В настоящем изобретении "связанный с mTOR противораковый препарат" не имеет ограничений, если только он ингибирует экспрессию или активность mTOR или вещества, задействованного выше или ниже его в пути mTOR, и эффективен для лечения рака. Связанные с mTOR противораковые препараты включают средства, которые прямо ингибируют mTOR (ингибиторы mTOR), например, такие химиотерапевтические препараты, как сиролимус (также известен как рапамицин), эверолимус, темсиролимус и деферолимус; белки типа антител; пептиды типа фрагментов антител; и нуклеиновые кислоты типа аптамеров, антисмысловых и дцДНК. Поскольку ингибиторы NRF2 ингибируют путь mTOR, то ингибиторы NRF2 по настоящему изобретению также можно причислить к ингибиторам mTOR. Известно, что путь mTOR задействован в нескольких путях, как показано на фиг.1. Однако особенно предпочтительными агентами, которые задействованы в пути mTOR и являются мишенью связанных с mTOR противораковых препаратов в настоящей заявке, являются, к примеру, фосфоинозитид-3-киназа I типа (в дальнейшем сокращенно "PI3K"), киназа-1 пируватдегидрогеназы (в дальнейшем сокращенно "PDK1"), FK506-связывающий белок (FKBP12), Akt (также известен как протеинкиназа В (РКВ)), S6-киназа-1 рибосомного белка р70 (в дальнейшем сокращенно "S6K1"), N-концевая киназа с-Jun (в дальнейшем сокращенно "JNK") и гипоксический индуцибельный фактор 1-альфа (в дальнейшем сокращенно "HIF1-альфа"). Поэтому в число связанных с mTOR противораковых препаратов в настоящей заявке включены такие ингибиторы PI3K, как TG100115, TCN-P, LY294002, вортманнин, BFZ235 и SF1126; такие ингибиторы PDK1, как UCN-01, BX912, В-3012 и OSU030313; такие ингибиторы FKBP12, как АР 1903 и такролимус; такие ингибиторы Akt, как XL418, LY294002, вортманнин, TCN-P, BV-1701-1, FPA-124, KP372-1 и GSK690693; такие ингибиторы S6K1, как XL418 и Н-89; такие ингибиторы JNK, как AM111, SP600125, соединения, описанные в U.S. Patent No. 7,199,124 и AS601245; и такие ингибиторы HIF1-альфа, как РХ478 и SF1126.

В настоящем изобретении "реакция на связанный с mTOR противораковый препарат" означает эффект по меньшей мере на один из показателей, представляющих состояние больного раком при введении ему связанного с mTOR противоракового препарата, причем этот эффект вызван введением связанного с mTOR противоракового препарата. Показатели включают уменьшение размера опухоли, подавление роста опухоли, метастазирование, качество прогноза, рецидивы или повторность и т.д. В настоящем изобретении "хорошая реакция на связанный с mTOR противораковый препарат" означает проявление действия по меньшей мере на один из показателей, представляющих состояние заболевания у больного раком, получающего связанный с mTOR противораковый препарат, и включает, к примеру, уменьшение размера опухоли, подавление роста опухоли, подавление метастазирования или отсутствие метастазов, улучшение прогноза, отсутствие рецидивов или повторности и т.д.

В настоящем изобретении "ДНК или РНК, кодирующая мутировавший ген NRF2" означает кодирующую ДНК или РНК, содержащую мутации в любой части последовательности нуклеотидов или рибонуклеотидов, кодирующей нормальный NRF2, например, ДНК, содержащую мутации в части последовательности SEQ ID NO.1. В настоящем изобретении "мутировавший белок NRF2" означает белок, содержащий мутации в части аминокислотной последовательности (SEQ ID NO.2), составляющей нормальный NRF2. В частности, ДНК или РНК, кодирующая мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, означает такую ДНК или РНК, кодирующую мутировавший ген или белок NRF2, при мутации которой повышается уровень экспрессии белка NRF2. В более предпочтительном аспекте мутировавшие белки NRF2 включают белки, у которых триптофан в положении 24 белка NRF2 заменен цистеином или лизином, глутамин в положении 26 белка NRF2 заменен глутаминовой кислотой, изолейцин в положении 28 белка NRF2 заменен глицином, лейцин в положении 30 белка NRF2 заменен фенилаланином, глицин в положении 31 белка NRF2 заменен аланином, глутамин в положении 75 белка NRF2 заменен гистидином, аспарагиновая кислота в положении 77 белка NRF2 заменена валином или глицином, глутаминовая кислота в положении 79 белка NRF2 заменена лизином, треонин в положении 80 белка NRF2 заменен лизином или пролином и/или глутаминовая кислота в положении 82 белка NRF2 заменена аспарагиновой кислотой. Мутировавшие гены NRF2 включают гены, кодирующие такие мутировавшие белки NRF2, у которых триптофан в положении 24 белка NRF2 заменен цистеином или лизином, глутамин в положении 26 белка NRF2 заменен глутаминовой кислотой, изолейцин в положении 28 белка NRF2 заменен глицином, лейцин в положении 30 белка NRF2 заменен фенилаланином, глицин в положении 31 белка NRF2 заменен аланином, глутамин в положении 75 белка NRF2 заменен гистидином, аспарагиновая кислота в положении 77 белка NRF2 заменена валином или глицином, глутаминовая кислота в положении 79 белка NRF2 заменена лизином, треонин в положении 80 белка NRF2 заменен лизином или пролином и/или глутаминовая кислота в положении 82 белка NRF2 заменена аспарагиновой кислотой. Уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, означает такой уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, который измерен по методике, способной выявить мутировавший ген, включая уровень, который измерен таким методом с использованием гибридизации, как Southern-блоттинг, Northern-блоттинг или метод ASO, либо таким методом с использованием ПЦР, как PCR-SSCP, метод ARMS или прямое определение в геле, или же уровень, выраженный значением, рассчитанным с помощью программы, подходящей для каждого метода измерения.

В настоящем изобретении термин "ассоциировать с" при использовании его в связи с отношением между измеренным уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, и реакцией пациента на связанный с mTOR противораковый препарат для того, чтобы установить реакцию пациента на связанный с mTOR противораковый препарат, означает сравнить наличие или уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у субъекта с уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у пациента, у которого реакция на связанный с mTOR противораковый препарат была слабой, или у пациента, у которого реакция на связанный с mTOR противораковый препарат известна как слабая, либо у пациента, у которого реакция на связанный с mTOR противораковый препарат не была слабой, или у пациента, у которого реакция на связанный с mTOR противораковый препарат прогнозируется как не слабая. Уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у пациента для сравнения можно получить, к примеру, исходя из описания настоящего изобретения, путем измерения уровня мутировавшего гена NRF2 или мутировавшего белка NRF2 в образце, взятом у пациента, у которого реакция на связанный с mTOR противораковый препарат установлена ранее, либо путем оценки в сочетании с другим методом оценки с использованием другого показателя реакции на связанный с mTOR противораковый препарат. Вероятность того, что пациент будет реагировать на связанный с mTOR противораковый препарат, можно определить по уровню ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2. Уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, можно ассоциировать с реакцией на связанный с mTOR противораковый препарат при помощи статистического анализа. Статистическая значимость определяется путем сравнения двух или нескольких групп и определения доверительного интервала и/или значения р (Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983). Доверительный интервал по настоящему изобретению может составлять, к примеру, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 99,99%. Кроме того, значение р по настоящему изобретению может составлять, к примеру, 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0002 или 0,0001.

Предпочтительно ДНК или РНК, кодирующую мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, можно ассоциировать с реакцией пациента на связанный с mTOR противораковый препарат по ее наличию или отсутствию. С другой стороны, уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, в образце, взятом у пациента, можно ассоциировать с реакцией пациента на связанный с mTOR противораковый препарат путем сравнения с пороговым уровнем, установленным в качестве показателя реакции на связанный с mTOR противораковый препарат, для ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2. Такой пороговый уровень может быть определен, к примеру, с чувствительностью не менее 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98%. Пороговый уровень может быть определен, к примеру, со специфичностью не менее 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98%.

Определение реакции на связанный с mTOR противораковый препарат означает предсказание течения или исхода заболевания у пациента при введении связанного с mTOR противоракового препарата, но это не значит, что течение или исход заболевания у пациента при введении можно предсказать со 100% точностью. Определение реакции на связанный с mTOR противораковый препарат означает определение того, будет ли повышаться вероятность определенного течения или исхода при введении противоракового средства, но это не значит, что определение вероятности определенного течения или исхода происходит путем сравнения с таким случаем, когда течение или исход не встречается. То есть результат определения реакции на связанный с mTOR противораковый препарат показывает, что при введении связанного с mTOR противоракового препарата определенное течение или исход будет наблюдаться с большей вероятностью у таких пациентов, у которых уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, повышен по сравнению с пациентами, не проявляющими такого признака.

В настоящем изобретении "класс реакции рака" означает группу раковых заболеваний, обладающих подобными свойствами. В частности, класс реакции рака означает группу раковых заболеваний, обладающих сходным профилем экспрессии определенного гена или проявляющих сходное клиническое состояние. Представители определенного класса реакции рака проявляют одинаковую или близкую реакцию на связанный с mTOR противораковый препарат. Экспрессия гена или клиническое состояние у представителей одного класса реакции рака предпочтительно отличаются и отличимы от экспрессии гена или клинического состояния у не входящих в тот же самый класс реакции рака. В качестве такой экспрессии гена предпочтительна экспрессия мутировавшего гена NRF2. В классы реакции рака могут входить по меньшей мере два класса, у которых "реакция на mTOR сильная" и "реакция на mTOR слабая". Кроме того, может входить и большее количество классов.

В настоящем изобретении "распределение в один из классов реакции рака" означает группирование больных раком в соответствии с уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, в образцах, взятых у пациентов. Обычно уровень означает количество ДНК, РНК или белка типа уровня экспрессии, но может означать уровень мутаций, как-то число или степень мутаций. Группирование может осуществляться по абсолютному или относительному показателю. Например, группирование может проводиться путем отнесения данного пациента в группу с заданным уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, в соответствии с уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у пациента. С другой стороны, после определения уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, в группе неопределенных пациентов, включая данного пациента, их можно разбить на две или несколько групп по различиям в относительном уровне ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2. Кроме того, классификация может проводиться по степени различия в сравнении с уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у здоровых лиц в качестве показателя. Предпочтительно после сравнения субъекта распределяют в класс с более сильной реакцией на mTOR при более высоком уровне ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2.

В одном воплощении способ или набор настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат может осуществляться на основе известного метода с использованием молекул нуклеиновой кислоты, как-то метода southern-гибридизации, northern-гибридизации, дот-гибридизации, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), ДНК-микроматрицы, метода ASO и др. С помощью набора для прогнозирования можно проводить качественный, количественный или полуколичественный анализ.

В частности, способ настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат может выполняться, к примеру, со следующими стадиями:

(a) подготовка образца, взятого у больного;

(b) контактирование образца по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой, причем нуклеиновая кислота выбирается из (i) и (ii):

(i) нуклеиновая кислота, которая специфически связывается с ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, но не связывается с ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, и нуклеиновая кислота, которая связывается и с ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, и с ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, и

(ii) нуклеиновая кислота, которая не связывается с ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, но специфически связывается с ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2;

(c) детектирование связывания ДНК или РНК с нуклеиновой кислотой и измерение уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2; и

(d) прогнозирование реакции больного раком на связанный с mTOR противораковый препарат по уровню ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, при этом наличие или возрастание ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, означает, что больной с большой вероятностью будет реагировать на связанный с mTOR противораковый препарат.

Набор настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат на основе известного метода с использованием молекул нуклеиновой кислоты включает нуклеиновые кислоты, которые специфически связываются с определенным геном (например, ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, либо с обеими). В частности, набор настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат содержит по меньшей мере одно из веществ, выбранное из (i)-(iv):

(i) вещество, которое связывается с ДНК или РНК, кодирующей NRF2, но не связывается с ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2;

(ii) вещество, которое не связывается с геном NRF2, но связывается с мутировавшим геном NRF2;

(iii) вещество, которое связывается с белком NRF2, но не связывается с мутировавшим белком NRF2;

(iv) вещество, которое не связывается с белком NRF2, но связывается с мутировавшим белком NRF2.

Нуклеиновая кислота, используемая для набора, может быть получена путем химического синтеза либо путем получения гена, содержащего нужную нуклеиновую кислоту, из биоматериала, а затем амплифицирования его с помощью праймеров, составленных для амплификации нужной нуклеиновой кислоты.

В другом воплощении способ или набор настоящего изобретения может основываться на известном методе с применением ПЦР. Например, в такой способ может входить метод ARMS (система амплификации с рефракторными мутациями), метод ОТ-ПЦР (обратно-транскриптазной ПЦР), метод вложенной ПЦР и др. Амплифицированную нуклеиновую кислоту можно детектировать при помощи метода дот-блот-гибридизации, метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR), метода ПЦР-RFLP, метода ОТ-ПЦР in situ, метода ПЦР-SSO (специфичных к последовательности олигонуклеотидов), метода ПЦР-SSP, метода AmpFLP (полиморфизма по длине амплифицированных фрагментов), метода MVR-ПЦР и метода ПЦР-SSCP (полиморфизма по одноцепочечной конформации). С помощью набора можно проводить качественный, количественный или полуколичественный анализ.

В частности, способ настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат может выполняться, к примеру, по следующим стадиям:

(a) подготовка образца, взятого у больного;

(b) амплифицирование по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты из числа ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, и ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2;

(c) детектирование уровня амплификации нуклеиновой кислоты и измерение уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2; и

(d) прогнозирование реакции больного раком на связанный с mTOR противораковый препарат по уровню ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, при этом наличие или возрастание ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, означает, что больной с большой вероятностью будет реагировать на связанный с mTOR противораковый препарат.

Набор настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат на основе известного метода с применением ПЦР включает праймер, который связывается с участком определенного гена (например, ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, либо обеих). Используемые в наборе праймеры могут быть получены путем химического синтеза, правильно составлены при помощи метода, известного специалистам, прибегая к изложению настоящего описания и известной информации, и приготовлены путем химического синтеза.

В другом воплощении способ настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат может выполняться, к примеру, с помощью известного метода, как-то метода Invader (к примеру, см. Kwiatkowski R.W. et al.: "Clinical genetic, and pharmacogenetic applications of the Invader assay." Mol. Diagn., 4: 353-364, 1999).

Например, способ прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат по настоящему изобретению может выполняться по следующим стадиям:

(a) подготовка образца, взятого у больного;

(b) образование тройной спирали (триплекса) с ДНК, комплементарной аллель-ному зонду, при контактировании образцов с нуклеиновой кислотой, приведенной в следующих пунктах (i) и (ii):

(i) аллелеспецифичный зонд, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей нормальный NRF2, и последовательность, комплементарную части гасителя зондов (флэп), и/или последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей мутировавший NRF2, и последовательность, комплементарную части гасителя зондов (флэп), и

(ii) зонд Invader, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей нормальный NRF2, и/или ДНК, кодирующей мутировавший NRF2;

(c) высвобождение флэпа из образованного нуклеиновой кислотой триплекса при контактировании триплекс-специфичной ДНКазы с образцом нуклеиновой кислоты, полученным из (b);

(d) контактирование высвобожденных флэпов с универсальным флуоресцентным зондом, содержащим последовательность, комплементарную флэпам, и гаситель зондов;

(e) генерирование флуоресценции при высвобождении флуоресцентного зонда при контактировании триплекс-специфичной ДНКазы с образцом нуклеиновой кислоты, полученным из (d); и

(f) измерение уровня ДНК, кодирующей мутировавший NRF2, путем детектирования генерируемой флуоресценции, причем наличие или возрастание ДНК, кодирующей мутировавший NRF2, означает, что пациент с большой вероятностью будет реагировать на mTOR.

В одном воплощении набор из настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат может предназначаться для вышеприведенного метода Invader . Например, набор из настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат может включать аллелеспецифичный зонд, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей нормальный NRF2, и последовательность, комплементарную части гасителя зондов (флэп), и/или аллелеспецифичный зонд, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей мутировавший NRF2, и последовательность, комплементарную части гасителя зондов (флэп); зонд Invader, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей нормальный NRF2, и/или ДНК, кодирующей мутировавший NRF2; триплекс-специфичную ДНКазу; и универсальный флуоресцентный зонд, снабженный гасителем зондов. Предпочтительно флэпы у аллелеспецифичных зондов разные. Флуоресцентные метки могут быть выбраны из числа тех, что известны специалистам, причем у универсальных флуоресцентных зондов они предпочтительно разные. Например, в качестве флуоресцентных меток можно использовать РАМ и VIC.

Зонды, входящие в вышеприведенные наборы из настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат, могут быть получены путем химического синтеза, правильно составлены при помощи метода, известного специалистам, прибегая к изложению настоящего описания и известной информации, и приготовлены путем химического синтеза, либо получены путем получения гена, содержащего нужные последовательности нуклеиновой кислоты, из биоматериала и амплификации его с помощью праймеров, составленных для амплификации нужных последовательностей нуклеиновой кислоты. Входящая в наборы из настоящего изобретения триплекс-специфичная ДНКаза является коммерчески доступной (например, Cleavase, Third Wave Japan, Inc).

В другом воплощении способ или набор настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат может основываться на известном методе с использованием молекул антител. Например, в качестве такого метода можно включить метод ELISA (Catty, Raykundalia, 1989), радиоиммуноанализ (Catty, Murphy, 1989), иммуногистохимические методы (Heider et al., 1993), Western-блоттинг и др.

В следующем воплощении способ настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат может включать стадии:

(a) подготовка образца, взятого у больного;

(b) контактирование по меньшей мере одного антитела с образцом, причем антитело выбирается из следующих (i) и (ii):

(i) антитело, которое специфически связывается с белком NRF2, но не связывается с мутировавшим белком NRF2, и антитело, которое связывается с белком NRF2 и с мутировавшим белком NRF2, и

(ii) антитело, которое не связывается с белком NRF2, но специфически связывается с мутировавшим белком NRF2;

(c) детектирование связывания белка с антителом и измерение уровня экспрессии мутировавшего белка NRF2; и

(d) прогнозирование реакции больного раком на связанный с mTOR противораковый препарат по уровню экспрессии мутировавшего белка NRF2, при этом экспрессия или повышение экспрессии мутировавшего белка NRF2 означает, что больной с большой вероятностью будет реагировать на связанный с mTOR препарат.

Набор из настоящего изобретения включает антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с определенным белком (к примеру, белком NRF2, мутировавшим белком NRF2 или тем и другим). Можно использовать антитело или его фрагмент любой структуры, размера, класса иммуноглобулина, происхождения и т.д., лишь бы оно связывалось с данным белком. Антитело или его фрагмент, входящие в набор настоящего изобретения, может быть моноклональным или поликлональным. Фрагмент антитела есть часть антитела (частичный фрагмент) либо пептид, содержащий часть антитела, сохраняющую активность связывания антитела с антигеном. Фрагменты антител могут включать F(ab') ₂, Fab', Fab, одноцепочечные Fv (scFv), связанные через дисульфид Fv (dsFv) или их полимеры, димеризованные V-области (diabody) либо пептиды, содержащие CDR. В настоящем изобретении CDR определяется по Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services, 1983; либо Chothia et al., J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987. Набор из настоящего изобретения может включать выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, входящее в набор, либо кодирующую аминокислотную последовательность фрагмента антитела, вектор, содержащий эту нуклеиновую кислоту, и клетки, несущие этот вектор.

Антитела могут быть получены способом, хорошо известным в этой области. Например, готовят полипептид, сохраняющий весь намеченный белок или его часть, либо экспрессирующий вектор для клеток млекопитающих со встроенным полинуклеотидом, кодирующим его, в качестве антигена. После иммунизации животного с помощью антигена, полученные из иммунизированного животного иммунные клетки сливают с клетками миеломы, получая гибридому. Затем из культуры гибридомы собирают антитела. Наконец, можно получить моноклональные антитела против белка NRF2 или мутировавшего белка NRF2, проводя специфичную к антигену очистку полученных антител с помощью белка NRF2 или мутировавшего белка NRF2 или его части, использовавшейся для антигена. Поликлональные антитела можно получить при иммунизации животного тем же антигеном, что и выше, отбирая образец крови из иммунизированного животного, отделяя сыворотку от крови, а затем проводя специфичную к антигену очистку сыворотки с помощью вышеприведенного антигена. Фрагменты антител можно получить при обработке полученных антител ферментом или используя информацию о последовательности полученных антител.

Присоединение метки к антителам или их фрагментам может осуществляться общеизвестными методами. Например, в белок или пептид можно ввести флуоресцентную метку, промывая белок или пептид фосфатным буфером, добавляя краситель, приготовленный на DMSO, буфере и т.п., а затем оставляя на 10 мин при комнатной температуре после перемешивания раствора. Кроме того, для введения метки можно использовать коммерчески доступный набор для мечения, как-то набор для мечения биотином типа Biotin Labeling Kit-NH ₂, Biotin Labeling Kit-SH (Dojindo Laboratories); набор для мечения щелочной фосфатазой типа Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2, Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH (Dojindo Laboratories); набор для мечения пероксидазой типа Peroxidase Labeling Kit-NH ₂, Peroxidase Labeling Kit-SH (Dojindo Laboratories); набор для мечения фикобилипротеидом типа Allophycocyanin Labeling Kit-NH ₂, Allophycocyanin Labeling Kit-SH, B-Phycoerythrin Labeling Kit-NH₂, B-Phycoerythrin Labeling Kit-SH, R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH₂, R-Phycoerythrin Labeling Kit-SH (Dojindo Laboratories); наборы для введения флуоресцентных меток типа Fluorescein Labeling Kit-NH₂, HiLyte Fluor 555 Labeling Kit-NH₂, HiLyte Fluor 647 Labeling Kit-NH₂ (Dojindo Laboratories); DyLight 547 и DyLight 647 (Techno Chemical Corp.), Zenon , набор для мечения антител Alexa Fluor , набор для мечения антител Qdot (Invitrogen Corporation) и EZ-Label Protein Labeling Kit (Funakoshi Corporation). Меченые антитела или их фрагменты можно детектировать при помощи прибора, подходящего для соответствующей метки.

В качестве образцов для способа прогнозирования и набора для прогнозирования по настоящему изобретению можно использовать, к примеру, образцы ткани или жидкости, взятые у субъекта для биопсии. Образцы не имеют особых ограничений, если только они подходят для иммунологического определения по настоящему изобретению; например, они могут включать ткань, кровь, плазму, сыворотку, лимфатическую жидкость, мочу, серозную жидкость, спинномозговую жидкость, синовиальную жидкость, водянистую влагу, слезы, слюну либо их часть или обработанный материал. Предпочтительно в качестве образцов используется ткань, в особенности раковая ткань. В способе настоящего изобретения для прогнозирования реакции больных раком на связанный с mTOR противораковый препарат тип рака не имеет особых ограничений, а предпочтительно он представляет собой солидный рак, как-то рак легких, рак головы и шеи, рак пищевода, рак шейки матки, рак желчных путей, рак молочной железы и злокачественная меланома. С помощью набора можно проводить качественный, количественный или полуколичественный анализ.

В. Прогноз при раке

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ или набор для предсказания прогноза у больных раком либо способ получения информации для предсказания прогноза у больных раком. В настоящем изобретении предсказание прогноза может представлять собой определение риска рецидива, метастазов или в особенности смерти пациента в качестве исхода рака.

В настоящем изобретении "прогноз" означает течение или исход у больного раком после подавления или ослабления роста опухоли хирургическим путем и т.п. (например, наличие или отсутствие метастазов, состояние организма и т.д.). В настоящем описании прогноз может означать состояние организма по прошествии 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 лет или больше после подавления или ослабления роста опухоли хирургическим путем. Прогноз может быть получен путем исследования биомаркера - мутировавшего белка NRF2 или гена, кодирующего мутировавший белок NRF2. Предсказание прогноза может осуществляться путем определения того, будет ли прогноз у пациента хорошим или плохим либо определения вероятности хорошего прогноза или плохого прогноза по наличию или отсутствию либо возрастанию или понижению биомаркера. В настоящем изобретении "составление прогноза" и "оценка прогноза" применяются как синонимы "предсказания прогноза".

В настоящем изобретении "хороший прогноз" означает, что состояние пациента не было критическим на протяжении длительного времени (к примеру, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 лет или больше) после подавления или ослабления роста опухоли хирургическим путем и т.п. С другой стороны, хороший прогноз может означать выживаемость, отсутствие метастазов, рецидивов или повторности на протяжении такого длительного времени. Например, хороший прогноз может означать выживание, предпочтительно без метастазов или рецидивов, как минимум на протяжении трех лет или в особенности на протяжении пяти лет. Наиболее предпочтительным состоянием для хорошего прогноза является продолжительный срок жизни без заболевания. "Хороший прогноз" в настоящем изобретении также может означать любое состояние, при котором могут обнаруживаться такие болезни, как метастазы, но со слабой злокачественностью и, не влияющие серьезно на выживаемость.

В настоящем изобретении "плохой прогноз" означает, что состояние пациента станет фатальным через короткий промежуток времени (к примеру, 1, 2, 3, 4, 5 лет или меньше) после подавления или ослабления роста опухоли хирургическим путем и т.п. С другой стороны, плохой прогноз может означать смерть, метастазы, рецидивы или повторность через такой короткий промежуток времени. Например, плохой прогноз может означать появление рецидивов, метастазов или смерть как минимум через три года или в особенности через пять лет.

В настоящем изобретении термин "ассоциировать с" в применении к взаимосвязи между измеренным уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, и реакцией пациента при определении реакции пациента означает сравнение наличия или уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у субъекта, с уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у такого пациента, у которого реакция была слабой, или у такого пациента, у которого реакция оказалась слабой, либо у такого пациента, у которого реакция не была слабой, или у такого пациента, у которого реакция не должна быть слабой. "Ассоциировать с" также применяется при сравнении наличия или уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у субъекта, с уровнем ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у здорового субъекта, у которого нет рака. Уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, у пациента для сравнения можно получить, к примеру, на основе описания настоящего изобретения, путем измерения уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, в образце, взятом у пациента, у которого реакция была установлена ранее, либо путем определения в сочетании с другим методом оценки с помощью другого показателя реакции. Уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, можно использовать для предсказания возможной смерти, рецидива или метастазов у пациента. Можно ассоциировать прогностический фактор с прогнозом при помощи статистического анализа. Статистическая значимость определяется путем сравнения двух или нескольких групп и определения доверительного интервала и/или значения р (Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983). Доверительный интервал по настоящему изобретению может составлять, к примеру, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 99,99%. Кроме того, значение p по настоящему изобретению может составлять, к примеру, 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0002 или 0,0001.

Например, ДНК или РНК, кодирующую мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2 по настоящему изобретению, можно ассоциировать с реакцией пациента по ее наличию или отсутствию. С другой стороны, уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, в образце, взятом у пациента, можно ассоциировать с реакцией пациента путем сравнения с пороговым уровнем, установленным в качестве показателя прогноза для ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2 по настоящему изобретению. Такой пороговый уровень может быть определен, к примеру, с чувствительностью не менее 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98%. Пороговый уровень может быть определен, к примеру, со специфичностью не менее 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98%.

Определение прогноза означает предсказание течения или исхода заболевания у пациента, но это не значит, что течение или исход заболевания у пациента можно предсказать со 100% точностью. Определение прогноза означает определение того, будет ли повышаться вероятность определенного течения или исхода, но это не значит, что определение вероятности определенного течения или исхода происходит путем сравнения с таким случаем, когда течение или исход не встречается. То есть результат определения прогноза показывает, что определенное течение или исход будет наблюдаться с большей вероятностью у таких пациентов, у которых уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, повышен или понижен по сравнению с пациентами, не проявляющими такого признака.

В одном воплощении способ или набор настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком может основываться на известном методе с использованием молекул нуклеиновой кислоты. Например, в качестве такого метода можно включить метод southem-гибридизации, northem-гибридизации, дот-гибридизации, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), ДНК-микроматрицы и др. В качестве образцов для набора можно использовать, к примеру, образцы ткани или жидкости, взятые у субъекта для биопсии. Образцы не имеют особых ограничений, если только они подходят для иммунологического определения по настоящему изобретению; они могут включать ткань, кровь, плазму, сыворотку, лимфатическую жидкость, мочу, серозную жидкость, спинномозговую жидкость, синовиальную жидкость, водянистую влагу, слезы, слюну либо их часть или обработанный материал. Предпочтительно в качестве образцов для набора используется ткань, в особенности раковая ткань. Можно проводить качественный, количественный или полуколичественный анализ.

Способ настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком может выполняться, к примеру, со следующими стадиями:

(a) подготовка образца, взятого у больного;

(b) контактирование по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты с образцом, причем нуклеиновая кислота выбирается из (i) и (ii):

(i) нуклеиновая кислота, которая специфически связывается с ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, но не связывается с ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, и нуклеиновая кислота, которая связывается и с ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, и с ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, и

(ii) нуклеиновая кислота, которая не связывается с ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, но специфически связывается с ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2;

(c) детектирование связывания этой нуклеиновой кислоты с ДНК или РНК и измерение уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2; и

(d) предсказание прогноза у больного раком по уровню экспрессии ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, при этом экспрессия или усиление экспрессии ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, означает плохой прогноз у больного раком.

Набор настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком включает нуклеиновые кислоты, которые специфически связываются с определенной ДНК или РНК (например, ДНК или РНК, кодирующей нормальный NRF2, ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2, либо с обеими). В частности, набор настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком содержит по меньшей мере одно из веществ, выбранное из (i)-(iv):

(i) вещество, которое связывается с ДНК или РНК, кодирующей NRF2, но не связывается с ДНК или РНК, кодирующей мутировавший NRF2;

(ii) вещество, которое не связывается с геном NRF2, но связывается с мутировавшим геном NRF2;

(iii) вещество, которое связывается с белком NRF2, но не связывается с мутировавшим белком NRF2;

(iv) вещество, которое не связывается с белком NRF2, но связывается с мутировавшим белком NRF2.

Нуклеиновая кислота, используемая для набора, может быть получена путем химического синтеза либо путем получения гена, содержащего нужную последовательность нуклеиновой кислоты, из биоматериала, а затем амплифицирования его с помощью праймеров, составленных для амплификации нужной последовательности нуклеиновой кислоты.

В другом воплощении способ настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком может выполняться, к примеру, с помощью известного метода, как-то метода Invader (к примеру, см. Kwiatkowski R.W. et al.: "Clinical genetic, and pharmacogenetic applications of the Invader assay." Mol. Diagn., 4: 353-364, 1999).

Например, способ предсказания прогноза у больных раком может выполняться по следующим стадиям:

(a) подготовка образца, взятого у больного;

(b) образование тройной спирали (триплекса) с ДНК, комплементарной аллельному зонду, при контактировании образцов с нуклеиновой кислотой, приведенной в следующих пунктах (i) и (ii):

(i) аллелеспецифичный зонд, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей нормальный NRF2, и последовательность, комплементарную части гасителя зондов (флэп), и/или последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей мутировавший NRF2, и последовательность, комплементарную части гасителя зондов (флэп), и

(ii) зонд Invader, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей нормальный NRF2, и/или ДНК, кодирующей мутировавший NRF2;

(c) высвобождение флэпа из образованного нуклеиновой кислотой триплекса при контактировании триплекс-специфичной ДНКазы с образцом нуклеиновой кислоты, полученным из (b);

(d) контактирование высвобожденных флэпов с универсальным флуоресцентным зондом, содержащим последовательность, комплементарную флэпам, и гаситель зондов;

(e) генерирование флуоресценции при высвобождении флуоресцентного зонда при контактировании триплекс-специфичной ДНКазы с образцом нуклеиновой кислоты, полученным из (d); и

(f) измерение уровня ДНК, кодирующей мутировавший NRF2, путем детектирования генерируемой флуоресценции, причем наличие или возрастание ДНК, кодирующей мутировавший NRF2, означает плохой прогноз у больного раком.

В одном воплощении набор из настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком может предназначаться для вышеприведенного метода Invader . Например, набор из настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком может включать аллелеспецифичный зонд, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей нормальный NRF2, и последовательность, комплементарную части гасителя зондов (флэп), и/или аллелеспецифичный зонд, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей мутировавший NRF2, и последовательность, комплементарную части гасителя зондов (флэп); зонд Invader, содержащий последовательность, комплементарную части ДНК, кодирующей нормальный NRF2, и/или ДНК, кодирующей мутировавший NRF2; триплекс-специфичную ДНКазу; и универсальный флуоресцентный зонд, снабженный гасителем зондов. Предпочтительно флэпы у аллелеспецифичных зондов разные. Флуоресцентные метки могут быть выбраны из числа тех, что известны специалистам, причем у универсальных флуоресцентных зондов они предпочтительно разные. Например, в качестве флуоресцентных меток можно использовать FAM и VIC.

Зонды, входящие в наборы из настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком, могут быть получены путем химического синтеза, правильно составлены при помощи метода, известного специалистам, прибегая к изложению настоящего описания и известной информации, и приготовлены путем химического синтеза, либо получены путем получения гена, содержащего нужные последовательности нуклеиновой кислоты, из биоматериала и амплификации его с помощью праймеров, составленных для амплификации нужных последовательностей нуклеиновой кислоты. Входящая в наборы из настоящего изобретения триплекс-специфичная ДНКаза является коммерчески доступной (например, Cleavase, Third Wave Japan, Inc).

В другом воплощении способ или набор настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком может основываться на известном методе с использованием молекул антител. Например, в качестве такого метода можно включить метод ELISA (Catty, Raykundalia, 1989), радиоиммуноанализ (Catty, Murphy, 1989), иммуногисто-химические методы (Heider et al., 1993), Western-блоттинг и др.

Способ настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком может выполняться, к примеру, со следующими стадиями:

(a) подготовка образца, взятого у больного;

(b) контактирование по меньшей мере одного антитела с образцом, причем антитело выбирается из (i) и (ii):

(i) антитело, которое специфически связывается с белком NRF2, но не связывается с мутировавшим белком NRF2, и антитело, которое связывается с белком NRF2 и с мутировавшим белком NRF2, и

(ii) антитело, которое не связывается с белком NRF2, но специфически связывается с мутировавшим белком NRF2;

(c) детектирование связывания белка с антителом и измерение уровня экспрессии мутировавшего белка NRF2; и

(d) предсказание прогноза у больного раком по уровню экспрессии мутировавшего белка NRF2, при этом экспрессия или усиление экспрессии мутировавшего белка NRF2 означает плохой прогноз у больного раком.

Набор из настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком включает антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с определенным белком (к примеру, белком NRF2, мутировавшим белком NRF2 или тем и другим). Можно использовать антитело или его фрагмент любой структуры, размера, класса иммуноглобулина, происхождения и т.д., лишь бы оно связывалось с данным белком. Антитело или его фрагмент, входящие в набор настоящего изобретения, может быть моноклональным или поликлональным. Фрагмент антитела есть часть антитела (частичный фрагмент) либо пептид, содержащий часть антитела, сохраняющую активность связывания антитела с антигеном. Фрагменты антител могут включать F(ab')₂ , Fab', Fab, одноцепочечные Fv (scFv), связанные через дисульфид Fv (dsFv) или их полимеры, димеризованные V-области (diabody) либо пептиды, содержащие CDR. В настоящем изобретении CDR определяется по Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services, 1983; либо Chothia et al., J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987. Набор из настоящего изобретения может включать выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, входящее в набор настоящего изобретения, либо кодирующую аминокислотную последовательность фрагмента антитела, вектор, содержащий эту нуклеиновую кислоту, и клетки, несущие этот вектор.

Антитела, предназначенные для набора из настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком, могут быть получены способом, описанным выше. Также и присоединение метки к антителам или их фрагментам может осуществляться методами, приведенными выше. Кроме того, для введения метки можно использовать коммерчески доступный набор для мечения типа, перечисленных выше. Меченые антитела или их фрагменты можно детектировать при помощи прибора, подходящего для соответствующей метки.

В качестве образцов для набора для предсказания прогноза у больных раком можно использовать, к примеру, образцы ткани или жидкости, взятые у субъекта для биопсии. Образцы не имеют особых ограничений, если только они подходят для иммунологического определения по настоящему изобретению; например, они могут включать ткань, кровь, плазму, сыворотку, лимфатическую жидкость, мочу, серозную жидкость, спинномозговую жидкость, синовиальную жидкость, водянистую влагу, слезы, слюну либо их часть или обработанный материал. Предпочтительно образцы для набора представляют собой ткани, в особенности раковые ткани. Можно проводить качественный, количественный или полуколичественный анализ. В вышеприведенных способах настоящего изобретения для предсказания прогноза у больных раком тип рака не имеет особых ограничений, а предпочтительно он представляет собой солидный рак, как-то рак легких, рак головы и шеи, рак пищевода, рак шейки матки, рак желчных путей, рак молочной железы и злокачественная меланома.

С. Скрининг противораковых препаратов

В следующем аспекте настоящее изобретение касается способа скрининга противораковых препаратов. Поскольку ДНК или РНК, кодирующая мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, может использоваться в качестве показателя прогноза у больных раком, то ДНК или РНК, кодирующая мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, может использоваться и при скрининге противораковых препаратов в качестве показателя улучшения прогноза у больных. Например, можно определить эффект противоракового препарата на улучшение прогноза рака путем измерения уровня ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, через определенный промежуток времени после добавления тестируемого препарата к раковым клеткам или после введения тестируемого препарата животным на модели рака. В частности, если после добавления или введения тестируемого препарата уровень ДНК или РНК, кодирующей мутировавший ген NRF2 или мутировавший белок NRF2, снижается или не отмечается, то этот препарат может быть выбран в качестве лечебного препарата, улучшающего прогноз при раке.

D. Противораковые препараты

В следующем аспекте настоящее изобретение касается противораковых препаратов, содержащих ингибитор NRF2 в качестве активного ингредиента. В настоящем изобретении "ингибитор NRF2" не имеет ограничений, если только он ингибирует функцию или экспрессию белка NRF2 или экспрессию гена NRF2, и может включать антисмысловую НК, дцРНК, рибозим, аптамер, фрагмент NRF2-связывающего белка, антитело к NRF2 либо его фрагмент или связывающий белок.

"Антисмысловая" относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность, комплементарную мРНК, кодирующей NRF2. Антисмысловая НК может состоять из ДНК, РНК или обеих. Антисмысловая НК не обязательно на 100% комплементарна мРНК данного NRF2. Если только она способна специфически гибридизироваться в строгих условиях (Sambrook et al., 1989), антисмысловая НК может содержать и не комплементарные основания. При введении антисмысловой НК в клетки она связывается с искомым полинуклеотидом и ингибирует транскрипцию, процессинг РНК, трансляцию или нарушает стабильность. Антисмысловая НК включает, наряду с антисмысловыми полинуклеотидами, и содержащие модифицированный остов, и 3'- и 5'-концевые части. Такие антисмысловые НК можно правильно составить по информации о последовательности NRF2 и получить методами, хорошо известными в этой области (например, химического синтеза).

"дцРНК" относится к РНК, содержащей двухцепочечную структуру РНК, которая ингибирует экспрессию генов путем интерференции с РНК (RNAi), и включает киРНК (siRNA, короткая интерферирующая РНК) и кшРНК (shRNA, короткая шпильковая РНК). дцРНК не обязательно на 100% гомологична последовательности искомого гена, лишь бы она ингибировала его экспрессию. Часть дцРНК может быть заменена на ДНК для стабилизации или других целей. Предпочтительно киРНК представляет собой двухцепочечную РНК из 21-23 оснований. киРНК может быть получена методами, хорошо известными в этой области, например, путем химического синтеза или путем введения в клетки ДНК, кодирующей кшРНК, и экспрессирования этой ДНК.

"Рибозим" представляет собой РНК, обладающую каталитической активностью, причем она способна расщеплять, склеивать, встраивать и переносить РНК. Структура рибозима может включать головку молотка, шпильку и др.

"Аптамер" представляет собой нуклеиновую кислоту, связывающуюся с таким веществом, как белок. Аптамер может представлять собой ДНК или РНК. Нуклеиновая кислота может находиться в двухцепочечной или одноцепочечной форме. Длина аптамера не имеет ограничений, если только он способен специфически связываться с искомой молекулой, и может состоять, к примеру, из 10-200 нуклеотидов, предпочтительно 10-100 нуклеотидов, более предпочтительно 15-80 нуклеотидов и еще более предпочтительно 15-50 нуклеотидов. Аптамер можно выбрать с помощью методов, хорошо известных в этой области. Например, можно воспользоваться методом SELEX (систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения) (Tuerk С. and Gold L., 1990, Science, 249, 505-510).

"Фрагмент NRF2-связывающего белка" представляет собой фрагмент белка, который связывается с NRF2 и ингибирует выполнение им своей первичной функции. NRF2-связывающий белок может включать, к примеру, легкий полипептид ферритина (FTL), онкоген jun (JUN), катепсин L1 (CTSL1), фактор связывания энхансера интерлейкина 3 (ILF3), КЕАР1, белок, взаимодействующий с доменом гомологии плекстрина (PHIP), ядерный фактор эритроидного происхождения 2 (NFE2), гомолог G онкогена v-maf апоневрозно-мышечной фибросаркомы (MAFG) и белок К семейства онкогенов v-maf апоневрозно-мышечной фибросаркомы (МАFК). Например, фрагмент NRF2-связывающего белка может быть получен путем получения частичных пептидов такого белка и отбора пептида, связывающегося с NRF2. Кроме того, для улучшения его стабильности или повышения его ингибиторной активности пептид можно подвергнуть соответствующей модификации, а также ввести аминокислотную мутацию в какую-то часть пептида.

Количество аминокислот, распознаваемых антителом против NRF2 или его фрагментом, использующимся в наборе или лечебном препарате настоящего изобретения, не имеет особых ограничений, если только антитело связывается с NRF2. Когда антитело применяется в качестве лечебного препарата, то предпочтительно, чтобы оно распознавало как можно больше аминокислот, чтобы ингибировать функционирование NRF2. Количество аминокислот, распознаваемых антителом или его фрагментом, равно как минимум 1, более предпочтительно как минимум 3. Класс иммуноглобулина у антител не имеет ограничений, это может быть IgG, IgM, IgA, IgE, IgD или IgY, но предпочтительно IgG. Антитела настоящей заявки могут включать любые изотипы антител.

В настоящем изобретении "фрагмент антитела" есть часть антитела (частичный фрагмент) или пептид, содержащий часть антитела, сохраняющую активность антитела в отношении антигена. Фрагменты антител могут включать F(ab')₂, Fab', Fab, одноцепочечные Fv (в дальнейшем сокращенно scFv), связанные через дисульфид Fv (в дальнейшем сокращенно dsFv) или их полимеры, димеризованные V-области (в дальнейшем сокращенно diabody) либо пептиды, содержащие CDR.

F(ab')₂ представляет собой фрагмент, получаемый при обработке IgG протео-литическим ферментом пепсином в виде фрагмента антитела, с молекулярной массой около 100000 и сохраняющий авидность к антигену. Fab' - это фрагмент антитела, получаемый при расщеплении дисульфидных связей на шарнирном участке F(ab'), с молекулярной массой около 50000 и сохраняющий авидность к антигену. scFv - это полипептид, у которого один V_H и один V_L соединяются пептидным линкером, причем он сохраняет авидность к антигену. dsFv - это фрагмент, сохраняющий авидность к антигену, у которого замещенные цистеином аминокислотные остатки в V_H и V_L соединяются через дисульфидную связь. Diabody (диатело) - это фрагмент из димеризованных scFv. Диатела настоящего изобретения могут быть моноспецифичными или биспецифичными (мульти-специфичные антитела). Димеризованные scFv могут быть одинаковыми или разными. Пептид, содержащий CDR, - это пептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере одного CDR из числа CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи.

Антитела настоящего изобретения могут быть получены путем иммунизации млекопитающих (кроме человека) или птиц пептидом, содержащим NRF2 или часть NRF2, при необходимости с использованием адъюванта (к примеру, минерального масла или осажденного алюминия, убитых нагреванием бактерий или липополисахаридов, полного адъюванта Фрейнда, неполного адъюванта Фрейнда и т.п.).

Используемый в качестве иммуногена NRF2 не имеет ограничений, если только это NRF2 млекопитающих, как-то мыши, кролика и человека, а предпочтительно это NRF2 человека. Используемый для получения антител настоящего изобретения иммуноген может быть получен путем введения экспрессирующего вектора, содержащего кДНК, кодирующую NRF2, в клетки Escherichia coli, дрожжевые клетки, клетки насекомых, клетки животных и т.д. и экспрессирования его. Если в качестве иммуногена используется пептид, то можно использовать пептид, содержащий часть NRF2, или комбинированные пептиды, у которых один или несколько типов частей NRF2 соединяются через линкер.

Пептиды, содержащие NRF2 или часть NRF2, могут быть получены путем химического синтеза с применением метода Fmoc, метода Воc или подобного им. Например, пептид, содержащий нужную аминокислотную последовательность, можно получить путем фиксирования С-концевой аминокислоты пептида, содержащего NRF2 или часть NRF2, на полистиреновой смоле, проведения реакции с аминокислотой, блокированной с помощью 9-фторенилметилоксикарбонильной группы (группы Fmoc) или трет-бутоксикарбонильной группы (группы Boc), используя конденсирующий реагент типа диизопропилкарбодиимида (DIC) для присоединения деблокированной аминокислоты к С-концевой аминокислоте, и повторения процесса отмывки и деблокирования.

Пептиды, содержащие NRF2 или часть NRF2, также можно синтезировать и с помощью автоматизированного синтезатора пептидов. Такие синтезаторы пептидов могут включать, к примеру, PSSM-8 (Shimazu Corporation), Model 433A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems, Inc.), ACT 396 Apex (Advanced ChemTech Inc.) и др.

Животные для иммунизации не имеют ограничений, если только можно получить гибридому, при этом можно использовать мышей, крыс, хомяков, кроликов, кур, уток и т.п. Предпочтительно для иммунизации используют мышей или крыс, более предпочтительно мышей, а наиболее предпочтительно мышей с нокаутом NRF2. Иммуноген можно вводить, к примеру, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, интрадермально, внутримышечно или интраплантарно, но предпочтительно подкожное или внутри-брюшинное введение. Количество иммуногена не имеет ограничений, если только его хватает для получения антител, предпочтительно 0,1-1000 мкг, более предпочтительно 1-500 мкг и еще более предпочтительно 10-100 мкг. Иммунизация может проводиться один или несколько раз с соответствующим интервалом. Предпочтительно иммунизация проводится от 2 до 5 раз с интервалом в 1-5 недель, более предпочтительно 3 раза с интервалом в 3 недели. Через 1-2 недели после последней иммунизации отбирается проба крови из глазницы или хвостовой вены иммунизированного животного и измеряется титр антител в сыворотке. Измерение титра антител может проводиться хорошо известным в этой области методом, например, методом радиоизотопного иммуноанализа (RIA), твердофазного ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), методом флуоресцентных антител и методом пассивной гемагглютинации, предпочтительно методом ELISA. Антитела настоящего изобретения могут быть получены при очистке из сыворотки животного, проявляющего достаточный титр антител.

Моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть получены путем культивирования гибридомы, полученной при слиянии клеток миеломы с вырабатывающими антитела клетками, выделенными из животного, подвергнутого иммунизации вышеприведенным способом. Слияние может осуществляться таким, к примеру, методом, как метод Milstein et al. (Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). При этом клетки, вырабатывающие антитела, можно выделить из селезенки, поджелудочной железы, лимфатических узлов и периферической крови, предпочтительно из селезенки мыши или крысы, подвергнутой иммунизации вышеприведенным способом и проявляющей достаточный титр антител в сыворотке. Используемые клетки миеломы не имеют ограничений, если только они происходят из млекопитающих типа мышей, крыс, морских свинок, хомяков, кроликов или человека и могут размножаться in vitro. К таким клеткам можно отнести, к примеру, P3-X63Ag8 (X63) (Nature, 256, 495, 1975), P3/NS1/1-Ag4-1 (NS1) (Eur. J. Immunol., 6, 292, 1976), P3X63Ag8U1 (P3U1) (Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978), P3X63Ag8.653 (653) (J. Immunol., 123, 1548, 1979), Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) (Nature, 276, 269, 1978), Sp2/O/FO-2 (FO-2) (J. Immunol. Methods, 35, 1, 1980), a предпочтительными являются клетки P3U1.

Вырабатывающие антитела клетки и клетки миеломы, полученные в соответствии с вышеприведенным способом, промывают средой, PBS (физраствором на фосфатном буфере) и т.п., а затем подвергают слиянию добавлением агглютинирующей клетки среды типа полиэтиленгликоля (в дальнейшем сокращенно "PEG") (Elsevier Publishing, 1988). Соотношение между вырабатывающими антитела клетками и подлежащими слиянию клетками миеломы может составлять, к примеру, от 2:1 до 1:2. По завершении слияния клеток гибридому культивируют в культуральной среде типа среды HAT (гипоксантин-аминоптерин-тимидин), способствующей селективной пролиферации. После культивирования собирают супернатант культуры и методом ELISA проводят отбор образца, связывающегося с белком антигена, но не связывающегося с другими белками. Из образца получают одиночные клетки методом предельного разведения и отбирают клетки, которые стабильно проявляют высокий титр антител.

Моноклональные антитела могут быть получены при культивировании гибридомы, полученной вышеприведенным способом in vitro, с последующей очисткой культуры. С другой стороны, моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть получены путем выделения асцитов после трансплантации гибридомы изогенному животному или иммунодефицитному животному, которому перед этим вводили пристан в брюшную полость, а затем очистки выделенных асцитов. Очистка моноклональных антител может осуществляться, после разделения центрифугированием, путем сбора фракций IgG из колонки с белком А, белком G и т.п. Если антитела относятся к классу IgY или IgM, то очистка может проводиться на колонке с меркаптопиридином в качестве лиганда. Очистка может проводиться, независимо от класса антител, на колонке с иммобилизованным NRF2, методом ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии и др.

При использовании антител в качестве лечебного препарата предпочтительно использовать в качестве антител гуманизованные химерные антитела, гуманизованные антитела или человеческие антитела. Гуманизованные химерные антитела могут быть получены путем конструирования ДНК, кодирующей V_H и V_L, полученного не из человека, а из животного моноклонального антитела, связывающегося с NRF2 и ингибирующего функционирование NRF2, встраивания сконструированной ДНК в кДНК константной области человеческого иммуноглобулина и вставления встроенной ДНК в экспрессирующий вектор, а затем введения вектора в соответствующие клетки хозяина для его экспрессирования (Morrison S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984).

Гуманизованные антитела могут быть получены путем конструирования ДНК, кодирующей V-область, в которой последовательность нуклеотидов, кодирующая CDR из V_H и V_L, полученного не из человека, а из животного моноклонального антитела, связывающегося с NRF2 и ингибирующего функционирование NRF2, пересажена в FRs из V_H и V_L человеческого антитела, встраивания сконструированной ДНК в кДНК константной области человеческого иммуноглобулина и вставления встроенной ДНК в экспрессирующий вектор, а затем введения вектора в соответствующие клетки хозяина для его экспрессирования (см. Rieohmann L. et al., Nature, 332, 323, 1988; Kettleborough C.A. et al., Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., Immunol. Today., 21, 397-402, 2000).

Человеческие антитела могут быть получены при помощи фаговой библиотеки антител человека или вырабатывающих человеческие антитела трансгенных мышей, к примеру (Tomizuka et al., Nature Genet., 15, 146-156 (1997)). Фаговая библиотека антител человека представляет собой библиотеку фагов, выставляющих фрагменты Fab или scFv антител человека и др. на поверхности в виде слитых белков при введении гена V_H и гена V _L из пула генов антител, состоящего из различных последовательностей, происходящих из В-клеток человека, в гены фага. Такие фаговые библиотеки антител человека могут включать "наивные" (неиммунные) библиотеки, которые создаются при амплификации гена V_H и гена V_L антител у нормального человека из лимфоцитов периферической крови и др. методом ОТ-ПЦР и создания из них библиотеки (Cambridge Antibody Technology; Medical Research Council; Dyax Corp. и др.); синтетические библиотеки, которые создают путем отбора определенных функциональных генов антител в В-клетках человека, замены части антигенсвязывающих участков во фрагменте V-гена типа участка CDR3 на олиго-нуклеотид, кодирующий достаточный отрезок рандомизованной последовательности аминокислот, и создания из них библиотеки (BioInvent International AB; Crucell; и MorphoSys AG); и иммунных библиотек, которые получают из лимфоцитов больных раком, аутоиммунными заболеваниями или инфекционными заболеваниями либо лиц, подвергавшихся вакцинации с помощью данного антигена в качестве вакцины.

Фрагменты антител типа F(ab')₂, Fab', Fab, scFv, dsFv или его полимеров, diabody или пептидов, содержащих CDR, могут быть получены следующим образом. Фрагменты F(ab')₂ могут быть получены в виде фрагментов антител с молекулярной массой около 100 000, сохраняющих авидность к антигену, при обработке антител настоящего изобретения типа IgG, связывающихся с NRF2, протеолитическим ферментом пепсином с расщеплением по остатку аминокислоты 234 тяжелой цепи. С другой стороны, фрагменты F(ab')₂ по настоящему изобретению могут быть получены путем соединения фрагментов Fab', которые будут описаны ниже, через тиоэфирную связь или дисульфидную связь. Fab'-фрагменты настоящего изобретения могут быть получены при обработке F(ab')₂, связывающихся с NRF2 и полученных вышеприведенным способом, восстанавливающим реагентом дитиотреитолом. С другой стороны, Fab'-фрагменты настоящего изобретения могут быть получены путем вставления ДНК, кодирующей Fab' из антитела, связывающегося с NRF2, в экспрессирующий вектор, введения вектора в клетки хозяина и его экспрессирования. Fab-фрагменты могут быть получены в виде фрагментов антител с молекулярной массой примерно 50000, сохраняющих авидность к антигену, у которых около половины тяжелой цепи с N-концевой стороны и вся область легкой цепи соединяются через дисульфидную связь, при обработке связывающихся с NRF2 антител протеолитическим ферментом папаином с расщеплением по остатку аминокислоты 224 тяжелой цепи. Кроме того, Fab-фрагменты могут быть получены путем вставления ДНК, кодирующей Fab из антитела, связывающегося с NRF2, в экспрессирующий вектор, введения вектора в клетки хозяина и экспрессирования ДНК. scFv можно получить путем конструирования ДНК, кодирующей scFv, путем получения кДНК, кодирующей V_H и V _L из NRF2-связывающего антитела, вставки ДНК, кодирующей последовательность линкера, между этими кДНК, вставления ДНК в экспрессирующий вектор, введения вектора в клетки хозяина и экспрессирования ДНК. Длина линкера не имеет ограничений, если только он способствует ассоциации между V_H и V _L, но предпочтительно она составляет от 10 до 20 остатков, более предпочтительно 15 остатков. Последовательность линкера не имеет ограничений, если только он не ингибирует укладку полипептидных цепей двух доменов, V_H и V_L. Линкер предпочтительно состоит из глицина и/или серина, более предпочтительно из последовательности GGGGS (G=глицин, S=серин) или ее повторов. dsFv можно получить путем замены одного аминокислотного остатка в каждом V_H и V_L на остаток цистеина методом направленного мутагенеза и соединения V_H и V_L через дисульфидную связь между остатками цистеина. Подлежащие замене аминокислоты не имеют ограничений, если только они не затрагивают связывание антигена за счет конформации. Диатела могут быть получены путем конструирования ДНК, кодирующей вышеприведенные scFv, таким образом, чтобы аминокислотная последовательность линкера составляла 8 остатков или меньше (предпочтительно 5 остатков), вставления ДНК в экспрессирующий вектор, введения вектора в клетки хозяина и его экспрессирования. Биспецифичные диатела могут быть получены путем объединения ДНК V_H и V_L из двух разных типов scFv. Пептиды, содержащие CDR, можно получить путем конструирования ДНК, включающей ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность CDR из V_H или V_L антитела, связывающегося с NRF2, вставления ДНК в экспрессирующий вектор, введения вектора в клетки хозяина и его экспрессирования.

Препарат настоящего изобретения можно вводить в виде медицинского препарата сам по себе или вместе с другим препаратом. Другой препарат, который можно вводить вместе с препаратом настоящего изобретения, не имеет ограничений, если только он не нарушает эффект лечебного или профилактического препарата настоящего изобретения, а предпочтительно можно включить препарат для лечения или профилактики рака, к примеру, алкилирующий агент, как-то ифосфамид, циклофосфамид, дакарбазин, темозоломид, нимустин, бусульфан, прокарбазин, мелфалан и ранимустин; антиметаболит, как-то еноцитабин, капецитабин, кармофур, кладрибин, гемцитабин, цитарабин, цитарабин-октосфат, тегафур, тегафур-урацил, тегафур-гимерацил-отерацил калиевый, доксифлуридин, гидроксикарбамид, фторурацил, флударабин, пеметрексед, пентостатин, меркаптопурин и метотрексат; растительный алкалоид, как-то иринотекан, этопозид, собузоксан, доцетаксель, ногитекан, паклитаксель, винорелбин, виндезин и винбластин; противораковый антибиотик, как-то актиномицин D, акларубицин, амрубицин, идарубицин, эпирубицин, зиностатин стималамер, даунорубицин, доксорубицин, пирарубицин, блеомицин, пепломицин, митомицин С и митоксантрон; препарат на основе платины, как-то оксалиплатин, карбоплатин, цисплатин и недаплатин; гормональный препарат, как-то анастрозол, экземестан, эстрамустин, этинилэстрадиол, хлормадинон, госерелин, тамоксифен, дексаметазон, торемифен, бикалутамид, флутамид, преднизолон, фосфестрол, митотан, метилтестостерон, медроксипрогестерон, мепитиостан, лейпрорелин и летрозол; модификатор биологических реакций, как-то -интерферон, -интерферон, -интерферон, интерлейкин, убенимекс, высушенный BCG и лейтинан; и препарат для молекулярной мишени, как-то иматиниб, гефитиниб, гемтузумаб, озогамицин, тамибаротен, трастузумаб, третиноин, бортезомиб, ритуксимаб и др.

Лекарственная форма препаратов настоящего изобретения не имеет ограничений, если только их можно ввести пациенту, но предпочтительно это форма для инъекций. Лекарственные формы препаратов настоящего изобретения могут включать, к примеру, жидкие формы или лиофилизованные формы. Лекарственные формы для инъекций могут включать препараты настоящего изобретения, вспомогательные вещества, например, солюбилизирующие вещества типа пропиленгликоля и этилендиамина; буферные вещества типа фосфата; поддерживающие изотоничность, к примеру, NaCl и глицерин; стабилизирующие вещества типа сульфита; консерванты типа фенола; и успокаивающие вещества типа лидокаина (см. Iyakuhin Tenkabutsu Jiten (Японский каталог фармацевтических наполнителей), Yakuji Nippo Limited; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, Fifth Edition, APhA Publications). Если препарат настоящего изобретения применяется в форме для инъекций, то в качестве контейнера для хранения могут использоваться ампулы, флаконы, заполненные шприцы, ручки-инжекторы с картриджем, мешочки для внутривенного введения и др.

Способ введения препаратов настоящего изобретения не имеет ограничений, если только они оказывают требуемый лечебный или профилактический эффект, но предпочтительным является внутрисосудистое введение. В частности, они могут вводиться в кровеносные сосуды, к примеру, внутривенно или в коронарную артерию. Способ применения препаратов настоящего изобретения может включать внутривенное введение посредством инъекции или капельного вливания, а также внутримышечное введение посредством внутримышечной инъекции. Препараты настоящего изобретения можно вводить путем однократного, непрерывного или периодического введения. Например, препарат настоящего изобретения можно вводить непрерывно в течение от 1 мин до 2 недель. Препараты настоящего изобретения предпочтительно вводятся непрерывно в течение от 5 мин до 1 часа, более предпочтительно они вводятся непрерывно в течение от 5 мин до 15 мин.

Дозировка препаратов настоящего изобретения не имеет ограничений, если только получается требуемый лечебный или профилактический эффект, и ее можно правильно установить в соответствии с симптомами, полом, возрастом и т.д. Дозировка лечебного или профилактического препарата настоящего изобретения может быть установлена, к примеру, используя в качестве показателя лечебное или профилактическое действие на рак. Дозировка лечебного или профилактического препарата настоящего изобретения предпочтительно составляет от 1 нг/кг до 10 мг/кг, более предпочтительно от 10 нг/кг до 1 мг/кг, еще более предпочтительно от 50 нг/кг до 500 мкг/кг, еще более предпочтительно от 50 нг/кг до 100 мкг/кг, еще более предпочтительно от 50 нг/кг до 50 мкг/кг и наиболее предпочтительно от 50 нг/кг до 5 мкг/кг.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Подробные примеры настоящего изобретения приведены ниже. Однако настоящее изобретение никоим образом не ограничивается аспектами, описанными в примерах.

Пример 1. Мутации гена NRF2 при раке пищевода

После экстрагирования ДНК из клинических образцов рака пищевода (образцы, извлеченные хирургическим путем) и клеток раковых линий пищевода (KYSE-50, KYSE-70, KYSE-180) амплифицировали гены NRF2 методом ПЦР, а затем определяли их последовательности путем секвенирования. Использовавшиеся праймеры и их последовательности приведены в табл.1. После амплификации каждого экзона методом ПЦР проводили реакции секвенирования, используя те же самые праймеры, а последовательности расшифровывали на полностью автоматическом капиллярном секвенаторе (ABI 3130). Условия ПЦР: 30 сек при 94°С, 30 циклов по 30 сек при 94°С, 30 сек при 55°С и 90 сек при 72°С, а затем 5 мин при 72°С.

Таблица 1
Праймер	Последовательность	№ последовательности
NRF2-EX1, прямой праймер	5'-GCCGCCACCAGAGCCGCCCTGTC-3'	3
NRF2-EX1, прямой (внутренний)	5'-AGCCCCAACACACGGTCCACAGCT-3'	4
NRF2-EX1, обратный праймер	5'-GAAGCCGGTTGCGGCTGTCCCTC-3'	5
NRP2-EX2, прямой праймер	5'-ACCATCAACAGTGGCATAATGTG-3'	6
NRF2-EX2, обратный праймер	5'-GGCAAAGCTGGAACTCAAATCCAG-3'	7
NRF2-EX3, прямой праймер	5'-TGAATATTTAGCTTGGCAATGTGA-3'	8
NRF2-EX3, обратный праймер	5'-GGAGATTCATTGACGGGACTTAC-3'	9
NRF2-EX4, прямой праймер	5'-GTTTTGTAGTGGTGCCTTAGAGC-3'	10
NRF2-EX4, обратный праймер	5'-TAATAGCACCCTCCAATCCTTCC-3'	11
NRF2-EX5-1, прямой праймер	5'-CTGAAGATAATGTGGGTAGGGAG-3'	12
NRF2-EX5-1, обратный праймер	5'-TAGAAGTTCAGAGAGTGAATGGC-3'	13
NRF2-EX5-2, прямой праймер	5'-TCTGCTTTCATAGCTGAGCCCAG-3'	14
NRF2-EX5-2, обратный праймер	5'-CAGGCAATTCTTTCTCTGGTGTG-3'	15
NRF2-EX5-3, прямой праймер	5'-ACCCTTGTCACCATCTCAGGGGC-3'	16
NRF2-EX5-3, обратный праймер	5'-CATCTTCATCACGTAGCATGCTG-3'	17
NRF2-EX5-4, прямой праймер	5'-AAATGACAAAAGCCTTCACCTAC-3'	18
NRF2-EX5-4, обратный праймер	5'-GCATTTCACATCACAGTAGGAGC-3'	19

Положения мутаций в гене NRF2 и вызванные этим замены аминокислот в клинических образцах рака пищевода и клетках раковых линий пищевода (KYSE-50, KYSE-70, KYSE-180) приведены на фиг.2. Мутации отмечались на поздней стадии рака (18/82,22%), а на ранней стадии рака их не отмечалось (0/36).

Пример 2. Экспрессия гена NRF2 в нормальном эпителии пищевода и при раке пищевода

Экспрессию NRF2 в нормальном пищеводе (А и В) и при раке пищевода (С) выявляли по иммуногистохимическому окрашиванию с помощью антител против NRF2. Готовили срезы толщиной 3 мкм из образца рака пищевода, фиксированного формалином и залитого парафином, которые подвергали реакции с поликлональным антителом против NRF2 (С-20, Santa Cruz Biotechnology, разведенное в 100 раз). Затем визуализировали экспрессию иммуногистологическим методом (коричневая окраска).

Результаты представлены на фиг.3. Стрелками выделены клетки, проявляющие экспрессию. На фиг.3В представлен увеличенный вид части фиг.3А. В нормальном эпителии пищевода наблюдалась экспрессия NRF2, приуроченная к нижнему слою базальных клеток, а в раковых клетках пищевода наблюдалось усиление экспрессии NRF2.

Пример 3. Корреляция между отклонениями в гене NRF2 и жизненным прогнозом у больных раком

Корреляцию между сроком жизни после операции и наличием или отсутствием мутаций гена подвергали статистическому анализу (методом Kaplan-Meier) для тех случаев рака пищевода, при которых проводился скрининг на мутации гена NRF2.

Результаты представлены на фиг.4. Отмечалась значимая корреляция между ними при значении р=0.005. У больных раком с отклонениями в гене NRF2 был плохой жизненный прогноз по сравнению с больными раком без отклонений в гене NRF2. Этот результат свидетельствует, что больным с отклонениями в гене NRF2 может потребоваться активное лечение после операции.

Пример 4. Эффект подавления роста раковых клеток, обусловленный дцРНК против NRF2

Экспрессия гена NRF2 подавлялась под действием дцРНК у тех клеток раковых линий пищевода, которые содержат мутации гена NRF2 (KYSE-50 и KYSE-180). Клетки раковых линий пищевода высеивали в 96-луночные планшеты при 5000 клеток на лунку и вводили в них контрольную дцРНК (ON-TARGET plus Non-targeting Pool, Dharmacon, D-001810-10) или дцРНК против NRF2 (дцРНК NRF2: 5'-UAAAGUGGCUGCUCAGAAUUU-3' (SEQ ID NO.20) и 5'-pAUUCUGAGCAGCCACUUUAUU-3' (SEQ ID NO.21) с помощью липофектамина (Lipofectamine RNAiMax, Invitrogen). Затем их инкубировали при 37°С в течение 72 часов. После этого определяли число жизнеспособных клеток методом MTS по активности NADH (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega).

Результаты представлены на фиг.5. Приведено отношение числа клеток для дцРНК NRF2 к числу клеток для контрольной дцРНК. Когда экспрессия гена NRF2 подавлялась под действием дцРНК в клетках раковых линий пищевода, содержащих мутации гена NRF2 (KYSE-50 и KYSE-180), то отмечался эффект подавления пролиферации на 26% (KYSE-50) или 38% (KYSE-180) по сравнению с контролем.

Пример 5. Идентификация молекулярного пути, связанного с активацией NRF2, по данным биостатистического анализа

Для того, чтобы исследовать изменения экспрессии гена NRF2 вследствие мутации, проводили сравнение уровня экспрессии между генами, экспрессированными в клетках, в которые был введен мутировавший ген NRF2, и генами, экспрессированными в контрольных клетках, при этом анализировали, какая группа генов менялась при мутации NRF2. В клетки 293 вводили гены NRF2 с двумя разными мутациями (NRF2-TK и NRF2-LF) и отбирали клоны, постоянно экспрессирующие мутировавший NRF2. Из отобранных клеток и контрольных клеток (в которые вводили только вектор) экстрагировали РНК. После мечения 0,5 мг тотальной РНК с помощью Cy3-СРТ измеряли уровень экспрессии примерно у 30000 генов на микроматрице экспрессии генов Agilent.

Проводили сравнение экспрессии генов на двух микроматрицах из вариантов NRF2 и на двух микроматрицах из контрольных клеток методом IBMT (Sartor M.A, Tomlinson C.R., Wesselkamper S.C., Sivaganesan S., Leikauf G.D., Medvedovic. Intensity-based hierarchical Bayes method improves testing for differentially expressed genes in microarray experiments. BMC Bioinformatics 7: 538-54, 2006). При анализе получили значение р, означающее значимое различие в экспрессии между генами. Полученное значение р подвергали коррекции по методу Benjamini & Hochberg (Benjamini Y. and Hochberg Y. (1995) Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B, 57, 289-300) и обозначали как исправленное значение р. Гены со значением р менее 0,05 считались статистически значимыми, при этом было получено 2290 подходящих генов. Для того, чтобы узнать, будут ли эти 2290 генов сконцентрированы в определенном пути, проводили статистические испытания на основе гипергеометрического распределения (Boyle E.I., Weng S., Gollub J., Jin H., Botstein D., Cherry J.M., Sherlock G. (2004) GO: TermFinder-open source software for accessing Gene Ontology information and finding significantly enriched Gene Ontology terms associated with a list of genes. Bioinformatics 20, 3710-3715) по базе данных по группам генов, публикуемой институтом BROAD (MsigDB, C2) (Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, Paulovich A, Pomeroy SL, Golub TR, Lander ES, Mesirov JP (2005) Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (43): 15545-50). Затем полученное значение p подвергали коррекции по методу Benjamini & Hochberg, приведенному выше. Группа генов со значением р менее 0,05 считалась статистически значимой.

В результате среди тех групп генов, которые были статистически значимыми, оказалась группа PENG_RAPAMYCIN_DN. Значение р для PENG_RAPAMYCIN_DN приведено в табл.2. Методами биостатистики PENG_RAPAMYCIN_DN и другие были идентифицированы как молекулярные пути, которые значительно активировались при активации гена NRF2. PENG_RAPAMYCIN_DN представляет собой молекулярный путь, в котором экспрессия снижалась при обработке рапамицином, являющимся ингибитором пути mTOR. Иными словами, именно этот путь может служить индикатором активации пути mTOR (Peng et al, Mol. Cell Biol. 2002 Aug; 22 (15): 5575-5584).

Пример 6. Реакция раковых клеток с отклонениями гена NRF2 на ингибитор mTOR (рапамицин)

Исследовали подавление пролиферации при обработке рапамицином для клеток раковых линий пищевода без отклонений гена NRF2 (KYSE-30, KYSE-140, KYSE-170, KYSE-270) и для клеточных линий с отклонениями гена NRF2 (KYSE-50, KYSE-70, KYSE-180). Клетки 7 раковых линий пищевода высеивали в 96-луночные планшеты при 5000 клеток на лунку и добавляли 0, 1, 5 и 10 нМ рапамицина. После инкубации при 37°С в течение 72 часов определяли число жизнеспособных клеток по активности NADH методом MTS (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega).

Кроме того, исследовали и эффект подавления роста при обработке рапамицином для клеток раковых линий легких без отклонений гена NRF2 (SQ-5, QG-56) или с отклонениями гена NRF2 (LK-2, ЕВС-1) и клеток раковых линий головы и шеи без отклонений гена NRF2 (HO-1-N-1, HSC2) или с отклонениями гена NRF2 (HO-1-u-1) аналогичным методом, как для вышеописанных клеток раковых линий пищевода.

Результаты представлены на фиг.6, 7 и 8. На графиках приведены изменения отношения числа клеток для каждой линии клеток при каждой из концентраций, при этом за 100% принимали 0 нМ (без добавления препарата). Как видно из фиг.6, пролиферация клеток раковых линий пищевода с отклонениями гена NRF2 значительно подавлялась при обработке рапамицином (снижалась до 70% от контроля). Также, как видно из фиг.7 и 8, пролиферация клеток раковых линий легких и раковых линий головы и шеи с отклонениями гена NRF2 значительно подавлялась при обработке рапамицином до 62-70% и 70% от контроля, соответственно.

Все содержание Японской патентной заявки № 2008-192876, поданной в Бюро патентов Японии 25 июля 2008 г., которая служит основанием для притязания на приоритет настоящего изобретения, включено в него путем ссылки. Также и все содержание всех патентов, патентных заявок и справочных документов, приведенных в настоящей заявке, включено в нее путем ссылки.

Промышленная применимость

Способ прогнозирования эффективности по настоящему изобретению может применяться в качестве способа предсказания реакции больных раком на связанные с mTOR противораковые препараты или предсказания того, будет ли связанный с mTOR противораковый препарат эффективным для больного раком еще до введения. Кроме того, способ предсказания прогноза по настоящему изобретению может дать важную информацию для разработки режима лечения больных раком путем предсказания прогноза для них. Более того, способ настоящего изобретения для ингибирования гена NRF2 или белка NRF2 и лечебный препарат настоящего изобретения, содержащий ингибитор гена NRF2 или белка NRF2, могут применяться в качестве способа лечения рака или лечебного препарата против рака.