полипептиды, конкурентно ингибирующие gq- белок, способы их получения и применение

Формула изобретения

1. Полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO:2, для профилактики или лечения гипертрофии миокарда.

2. Полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO:3, для профилактики или лечения гипертрофии миокарда.

3. Полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO:5, для профилактики или лечения гипертрофии миокарда.

4. Полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO:6, для профилактики или лечения гипертрофии миокарда.

5. Полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO:7, для профилактики или лечения гипертрофии миокарда.

6. Полипептид, соответствующий последовательности SEQ ID NO:8, для профилактики или лечения гипертрофии миокарда.

7. Состав для профилактики или лечения гипертрофии миокарда, содержащий полипептид по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемые добавки.

8. Состав по п.7, отличающийся тем, что указанный состав представляет собой инъекционный препарат для парентерального введения.

9. Применение полипептида по любому из пп.1-6 совместно с фармацевтически приемлемыми добавками для получения лекарственного средства для профилактики или лечения гипертрофии миокарда.

10. Способ получения полипептида по любому из пп.1-6, включающий этап проведения синтеза полипептида с аминокислотной последовательностью по любому из пп.1-6 в синтезаторе полипептидов.

11. Способ получения полипептида по любому из пп.1-6, включающий следующие этапы:

лигирование соответствующей последовательности нуклеотидов с вектором с образованием рекомбинантного вектора;

трансформацию указанного рекомбинантного вектора в клетку-хозяина;

индукцию экспрессии указанного полипептида в указанной клетке-хозяине;

выделение указанного полипептида.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой плазмиду pIVEX2.3MCS, а указанная клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli штамм BL21.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к полипептиду. Более конкретно, настоящее изобретение относится к пептиду - конкурентному ингибитору Gq-белка . Настоящее изобретение также относится к способу получения указанного полипептида, составу, содержащему указанный полипептид, и применению указанного полипептида для получения лекарственного средства для реверсии перестройки миокарда.

Уровень техники

Перестройка миокарда (известная как гипертрофия миокарда) представляет собой симптом, при котором количество кардиоцитов постоянно, но объем кардиоцитов увеличен. Данное явление представляет собой совместный ответ кардиоцитов на различные патологические раздражители и может быть результатом воздействия гемореологических стимулов, таких как гипертензия, порок сердца, острый инфаркт миокарда, врожденные заболевания сердца и вызванное физической нагрузкой повышение кровяного давления, а также гуморальных регуляторов, таких как эндотелин, ангиотензин II, катехинамины, трансформирующий фактор роста и интерлейкин-1, и поэтому характеризуется чрезвычайно высокой распространенностью^[1]. Для одной лишь гипертензии уровень заболеваемости на Западе составляет 15-20%. Несмотря на то, что в Китае уровень заболеваемости немного ниже, число пациентов превышает 150 миллионов. Гипертрофия миокарда может сопровождаться некоторой компенсацией на начальной стадии развития данного симптома. С развитием данного состояния гипертрофия миокарда может приводить к нарушению функции сердца за счет развития отклонений, таких как рассеянная перестройка волокон миокарда и нарушения сократительной деятельности сердца, и подобным заболеваниям, и в дальнейшем может привести к сердечной недостаточности. Гипертрофия миокарда является основным фактором смертности, так как приводит к сердечной недостаточности, которая, в свою очередь, приводит к смерти. Таким образом, поиск конкретных лекарственных средств, эффективных для лечения и контроля гипертрофии миокарда, является не только предметом изучения и актуальной научно-исследовательской задачей, но также одной из основных задач в сфере здравоохранения, которая требует немедленного решения по всему миру.

В настоящее время не существует клинических терапевтических лекарственных средств, предназначенных специально для лечения гипертрофии миокарда, в основном по причине множественной этиологии и сложности механизма, лежащего в основе данного состояния. Исследования показали, что стимуляция растяжения, вызванного изменениями гемореологических параметров или действием гуморальных эндокринных регуляторов (что представляет собой обратную причинно-следственную связь при развитии данного заболевания), может вызывать патологические ответные реакции, такие как гипертрофия миокарда, интерстициальный фиброз и др., практически все из которых опосредуются через соответствующие рецепторы и пострецепторную передачу сигнала^[2]. На основании полученных данных были предприняты попытки различных видов терапии, направленных на устранение этиологических причин гипертрофии миокарда, с использованием антагониста эндотелина, гипотензивного лекарственного средства, ингибитора ангиотензин-превращающего фермента и других препаратов, для которых была показана хоть какая-то эффективность. Однако, поскольку многие факторы и рецепторы вовлечены в развитие патологической ответной реакции и, кроме того, вышеуказанные антагонисты/ингибиторы могут вызывать повышающую регуляцию соответствующих рецепторов и повышение компенсаторной секреции лигандов к другим родственным рецепторам при подавлении функции сигнальной молекулы, эффект от лечения становится очень ограниченным^[3-6]. Таким образом, существует выраженная потребность в разработке конкретного лекарственного средства для профилактики и лечения с задействованием более фундаментальных механизмов.

G-белки представляют собой гетеротримерные ГТФ-связывающие белки, состоящие из субъединиц , и и играющие ключевую роль в передаче стимулирующих сигналов из внеклеточного пространства внутрь клетки. Норэпинефрин (NE), эндотелин (ЕТ), ангиотензин II (Ang II) и подобные им вещества являются агонистами ₁-AR, AT₁ рецепторов и рецептора эндотелина соответственно, затем активируют эффекторный фермент, фосфолипазу С (PLC- ), с участием G-белков семейства Gq, при этом указанный фермент, в свою очередь, воздействует на PIP₂ с получением DAG и PIP₃; и индуцируют экспрессию эмбриональных генов в клетке, обычно через сигнальный путь DAG-PKC-Ras-MAPK и IP₃-Ca²⁺-CaN/CaMPK II-NFAT3/GATA-4, что приводит к перестройке миокарда. Кроме активации Raf1, опосредуемой интегринами, факторы, усиливающие растяжение, могут стимулировать секрецию Ang II, NE и ET₁ и, таким образом, также тесно связаны с Gq. Кроме того, эксперименты показали, что: (1) при патологическом процессе перестройки миокарда сигнал Gq является в значительной мере избыточным и значительно выше, чем физиологический сигнал Gq в нормальных тканях, при этом как функция, так и морфология кардиоцита не подвергается значительному изменению при повышении экспрессии Gq в два раза (или ниже); гипертрофия миокарда и нарушение сократительной функции сердца происходят при повышении экспрессии Gq в четыре раза, сердечная недостаточность происходит при повышении экспрессии Gq приблизительно в восемь раз; (2) избыточная экспрессия гена Gq , присущая трансгенным организмам, в сердце мыши может индуцировать заметную гипертрофию миокарда и фатальную сердечную недостаточность у животного; (3) блокирование экспрессии Gq в сердце может значительно ослаблять гипертрофическую ответную реакцию в сердце на повышение давления^[7-9] . Таким образом, можно видеть, что Gq играет центральную роль в возникновении и развитии перестройки миокарда и рассматривается в качестве общей мишени для множества сигнальных путей и ключевого сигнального элемента для перестройки /гипертрофии миокарда, вызываемой действием различных факторов. Таким образом, ожидается, что регуляция Gq может стать новой стратегией и может быть успешной для реверсии перестройки /гипертрофии миокарда.

Тем не менее трансгенные животные представляют собой класс животных, которым искусственно введен экзогенный ген, стабильно интегрированный в хромосомный геном и способный передаваться по наследству. Принцип получения трансгенных животных заключается в следующем: интересующий ген/фрагмент гена, изолированный методами молекулярной биологии, вводят в зиготы/преимплантационные эмбриональные клетки экспериментальных животных с применением различных генетических процедур, введенные зиготы/преимплантационные эмбриональные клетки затем трансплантируют внутрь маточной трубы или матки животного-реципиента и ожидают развития трансгенного животного, несущего экзогенный ген. Функционирование данного экзогенного гена оценивают путем анализа степени интеграции экзогенного гена у трансгенного животного и фенотипа трансгенного животного, и тех животных, которые получены методом генной инженерии и обладают лучшими качествами, разводят с применением обычных методов генетической селекции. Таким образом, на основании существующей в настоящее время технологии лечение взрослых пациентов с приобретенной перестройкой миокарда/гипертрофией с использованием трансгенных методов непрактично и нерационально. Кроме того, блокирование экспрессии Gq в сердце приведет к развитию тяжелых токсических побочных эффектов, поскольку Gq также обладает важными физиологическими функциями. Таким образом, две данные стратегии и методы, описанные выше, не имеют практической ценности в клиническом контроле перестройки /гипертрофии миокарда.

В связи с этим авторы изобретения получили серию полипептидов, обладающих значительной активностью в отношении реверсии перестройки миокарда/гипертрофии с использованием систематических методов, таких как молекулярное конструирование, оптимизация, генная инженерия, получение полипептидов, скрининг in vitro и in vivo активности и других методов.

Описание изобретения

С учетом вышеописанных недостатков, присущих известным решениям, задачей настоящего изобретения является получение серии полипептидов, которые не только обладают терапевтической активностью в отношении реверсии гипертрофии миокарда, но и также могут быть легко получены с низкими затратами и готовы для внедрения в производство и для коммерциализации.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения серии полипептидов, при этом такой способ должен быть простым в исполнении, экономически выгодным и должен приводить к получению серии полипептидных продуктов высокой чистоты, обладающих превосходными характеристиками активности в отношении реверсии гипертрофии миокарда.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение состава, содержащего данный полипептид и применение указанного полипептида для получения лекарственного средства для лечения перестройки миокарда.

Для достижения цели настоящего изобретения сначала был получен полипептид в соответствии с последовательностью полипептида Gq , аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:1 (последовательность пентапентаконтапептида) и обладает активностью в отношении реверсии гипертрофия миокарда.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, предложенный согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, полученный путем делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка в любом положении, начиная с первой аминокислоты с N-конца последовательности SEQ ID NO 1, при сохранении по меньшей мере 12 аминокислотных остатков с С-конца указанного полипептида.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, предложенный согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:2 (последовательность пентатетраконтапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях 1-10 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:3 (последовательность пентатриаконтапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях 1-20 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:4 (последовательность триаконтапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 25 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5 (последовательность гептакозапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 28 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:6 (последовательность пентакозапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 30 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:7 (последовательность икозапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 35 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:8 (последовательность гептадекапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 38 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:9 (последовательность пентадекапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 40 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, полипептид, согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:10 (последовательность додекапептида), который получен путем делеции аминокислотных остатков в положениях с 1 по 43 с N-конца последовательности SEQ ID NO:1.

Полипептид, предложенный в настоящем изобретении, может также представлять собой полипептид, который получен путем замены, делеции или добавления одной или более аминокислот в любую из вышеописанных полипептидных последовательностей, и обладает свойствами для реверсии перестройки миокарда, идентичной или сходной с действием данного полипептида с вышеописанной последовательности.

Полипептид, предложенный в настоящем изобретении, может также быть полипептидом, который включает вышеописанную полипептидную последовательность и обладает свойствами для реверсии перестройки миокарда.

Данное изобретение также включает нуклеотидные последовательности, кодирующие вышеописанные полипептиды:

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:11, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:1;

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:12, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:2;

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:13, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:3;

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:14, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:4;

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:15, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:5;

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:16, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:6;

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:17, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:7;

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:18, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:8;

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:19, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:9;

последовательность нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:20, кодирующая полипептид, представленный в SEQ ID NO:10,

Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный вектор, который содержит любую из вышеописанных нуклеотидных последовательностей.

В другом предпочтительном варианте реализации изобретения, рекомбинантный вектор содержит промотор Т7.

В предпочтительном варианте реализации изобретения рекомбинантный вектор содержит нуклеотидные последовательности и плазмиду pIVEX2.3MCS.

Согласно настоящему изобретению также предложен состав, содержащий вышеописанные полипептиды, и фармацевтически приемлемые добавки.

В предпочтительном варианте реализации изобретения данный состав представляет собой состав для парентеральной инъекции.

В другом аспекте, согласно настоящему изобретению предложено применение вышеописанного полипептида для получения лекарственного средства для лечения гипертрофии миокарда.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, предложенный полипептид выполняет функцию активного ингредиента в составе лекарственного средства, которое также включает фармацевтически приемлемые добавки.

В другом аспекте, согласно настоящему изобретению предложен способ получения полипептидов, включающий этап проведения синтеза полипептида в соответствии с вышеописанными аминокислотными последовательностями в синтезаторе полипептидов.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения полипептидов, включающий следующий этап: лигирование соответствующей нуклеотидной последовательности с вектором с образованием рекомбинантного вектора; трансформацию указанного рекомбинантного вектора в клетку-хозяина; индукцию экспрессии указанного полипептида в указанной клетке-хозяине; и выделение указанного полипептида.

В предпочтительном варианте реализации способа получения полипептида рекомбинантный вектор содержит промотор Т7.

В предпочтительном варианте реализации способа получения полипептида вектор представляет собой плазмиду, а клетка-хозяин представляет собой E.coli.

В предпочтительном варианте реализации изобретения для получения полипептида используют плазмиду pIVEX2.3MCS, a E.coli. представляет собой Е.coli. штамм BL21.

Для вышеупомянутых вариантов реализации изобретения предусмотрено, что серию полипептидов получают путем делеции некоторого числа, но по меньшей мере одного аминокислотного остатка в любом положении, начиная с первого аминокислотного остатка с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 в направлении к С-концу данной последовательности, что является постепенным уменьшением N-концевой последовательности до делеции 43 аминокислот при сохранении только 12 аминокислотных остатков с С-конца указанной последовательности. На основании данного изобретательского замысла были оптимизированы ген и молекулярная структура пантапентаконтапептида, длина пантапентаконтапептида была успешно сокращена на 78,2% с сохранением и усилением его активности, и исследуемые полипептиды были успешно синтезированы с 99,2% чистотой путем использования передовых методов синтеза пептидов и при наличии всех ключевых параметров для внедрения в производство.

Настоящее изобретение также позволяет успешно получать необходимый полипептид методами генной инженерии. Поскольку полная длина гена пантапентаконтапептида составляет только 165 п.н. и приблизительно 180 п.н. после добавления сайтов рестрикции, мы выбрали метод, при котором две части данного гена (состоящего из 4 фрагментов) были раздельно синтезированы и затем последовательно клонированы в экспрессионный вектор. Была сконструирована экспрессионная плазмида pIVEX2.3MCS2-пантапентаконтапептид, содержащая полноразмерный ген пантапентаконтапептида под контролем Т7-промотора. Это позволило осуществлять успешную экспрессию пантапентаконтапептида с использованием данной экспрессионной плазмиды в прокариотической клетке под контролем Т7-промотора.

В рамках настоящего изобретения было проведено более системное исследование фармакодинамики данного исследуемого полипептида с использованием таких методов, как световая микроскопия, электронная микроскопия, прямое взвешивание, цветное ультразвуковое исследование В-типа, и других методов и было показано, что фармакодинамические параметры характеризуются значительной эффективностью. При проведении данного исследования было показано, что исследуемый полипептид характеризуется хорошей эффективностью для проведения профилактики в in vitro модели гипертрофии кардиоцитов, индуцированной различными факторами, такими как ангиотензин II, норэпинефрин, и другими факторами; оказывает очень хорошее подавляющее действие на изменение активности МАРК, стимулируемое действием ангиотензина II, и другими факторами; оказывает хорошее терапевтическое действие как на гипертрофию миокарда у мыши в нормальной модели инвертированная коарктации грудной аорты, полученной путем проведения хирургического вмешательства in vivo. B рамках настоящего изобретения было проведено более системное исследование фармакодинамики данного исследуемого полипептида с использованием таких методов, как световая микроскопия, электронная микроскопия, прямое взвешивание, цветное ультразвуковое исследование В-типа и других методов и было показано, что фармакодинамические параметры характеризуются значительной эффективностью. При проведении данного исследования было показано, что исследуемый полипептид характеризуется хорошей эффективностью для проведения профилактики в in vitro модели гипертрофии кардиоцитов, индуцированной различными факторами, такими как ангиотензин II, норэпинефрин, и другими факторами; оказывает очень хорошее подавляющее действие на изменение активности МАРК, стимулируемое действием ангиотензина II, и другими факторами; оказывает положительное терапевтическое действие как на гипертрофию миокарда у мыши в нормальной модели инвертированная коарктации грудной аорты, полученной путем проведения хирургического вмешательства in vivo, и на гипертрофию миокарда, вызванной острой объемной перегрузкой у нормальных крыс; также было показано явное влияние на реверсию перестройки миокарда, реверсию патологического утолщения стенок сосудов и понижение кровяного давления у крыс со спонтанной гипертензией.

При предварительной оценке безопасности было показано, что данный исследуемый полипептид является чрезвычайно безопасным для введения. (1) Тест на цитотоксичность: цитотоксичность отсутствует (отрицательно). (2) Тест на генотоксичность: генотоксичность отсутствует (отрицательно). (3) Тест на мутагенность (тест Эймса): мутагенное действие отсутствует (отрицательно). Предельно допустимая доза данного исследуемого полипептида у мышей превышает минимальное значение 50 мг/кг, отношение предельно допустимой дозы к эффективной дозе превышает минимальное значение 500; где отношение LD50 для мыши к обычной дозе (клиническую дозу преобразовали в дозу для мыши) каптоприла, Лозартана и нифедипина, типичных гипотензивных лекарственных средств, обладающих действием реверсии гипертрофии миокарда, составляет 388, 349 и 157 соответственно, что указывает на то, что безопасность данного исследуемого полипептида значительно превышает безопасность вышеуказанных лекарственных средств. Более того, не наблюдали развития каких-либо токсических нежелательных явлений при проведении данного теста.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1. Изменения морфологии тканей сердечной мышцы в модельной группе у крыс со спонтанной гипертензией (SHR).

Фиг.2. Изменения морфологии тканей сердечной мышцы в модельной группе, получавших лозартан.

Фиг.3. Изменения морфологии тканей сердечной мышцы в группе, получавших гептакозапептид.

Фиг.4. Изменения ультрамикроструктуры тканей сердечной мышцы в модельной группе у крыс со спонтанной гипертензией.

Фиг.5. Изменения ультрамикроструктуры тканей сердечной мышцы в группе, получавших лозартан.

Фиг.6. Изменения ультрамикроструктуры тканей сердечной мышцы в группе, получавших гептакозапептид.

ПРИМЕРЫ

Данное изобретение более подробно проиллюстрировано согласно отдельному варианту реализации в комбинации с фигурами.

Пример 1: Твердофазный синтез полипептида

1. Процесс синтеза и очистки гептакозапептида

25 г смолы (постоянный заместитель 0,6 ммоль/г) использовали для получения в лабораторном масштабе на следующих этапах. В производственном масштабе использовали 1 кг смолы, пропорционально увеличивали загрузку веществ на входе и увеличивали время реакции.

1.1 Процесс синтеза гептакозапептида

1. Готовили точную навеску 25 г Fmoc-Val-Wang смолы и помещали внутрь реактора вместимостью 1000 мл, затем добавляли дихлорметан, встряхивали и перемешивали в течение 30 минут, промывали соответственно 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и фильтровали с использованием насоса для удаления растворителя.

2. Добавляли 500 мл 20% пиперидина/диметилформамида, встряхивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой защитной Fmoc-группы. После удаления растворителя путем фильтрования с использованием насоса смолу промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования.

3. Готовили навески 21,2 г Fmoc-Leu-OH и 22,8 г гексафторфосфата 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HBTU) и растворяли в 500 мл диметилформамида, затем добавляли 40 мл диизопропилэтиламина и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут при перемешивании. Полученную смесь затем помещали в реактор и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 часов при встряхивании. После удаления реакционной жидкости путем фильтрования с использованием насоса смолу промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования.

4. Повторяли этапы 2 и 3, все условия были оставлены без изменений и действия были идентичными за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asn(Trt)-OH в количестве 35,8 г, и время реакции составило 3 часа.

5. Повторяли этапы 2 и 3, и все условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Tyr(tBu)-OH в количестве 27,6 г.

6. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Glu(OtBu)-OH в количестве 25,5.

7. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Lys(Boc)-OH в количестве 28,1 г.

8. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Leu-OH в количестве 21,2 г.

9. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asn(Trt)-OH в количестве 35,8 г.

10. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Leu-OH в количестве 21,2 г.

11. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Gln(Trt)-OH в количестве 36,7 г.

12. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Leu-OH в количестве 21,2 г.

13. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-IIe-OH в количестве 21,2 г.

14. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Thr(tBu)-OH в количестве 23,9 г.

15. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asp(OtBu)-OH в количестве 24,7 г.

16. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Lys(Boc)-OH в количестве 28,1 г.

17. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Val-OH в количестве 20,4 г.

18. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Ala-OH в количестве 19,8 г.

19. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Ala-OH в количестве 19,8 г.

20. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Phe-OH в количестве 23,2 г.

21. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Val-OH в количестве 20,4 г.

22. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Phe-OH в количестве 23,2 г.

23. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Arg(pbf)-OH в количестве 39,0 г.

24. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-IIe-OH в количестве 21,2 г.

25. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asn(Trt)-OH в количестве 35,8 г.

26. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Glu(OtBu)-OH в количестве 25,5 г.

27. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Thr(tBu)-OH в количестве 23,9 г.

28. Повторяли этапы 2 и 3, и все другие условия были оставлены без изменений и действия были идентичными, за исключением того, что на Этапе 3 добавляли аминокислоту Fmoc-Asp(OtBu)-OH в количестве 24,7 г.

29. Добавляли 500 мл 20% пиперидина/диметилформамида, встряхивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой Fmoc защитной группы. После удаления растворителя путем вакуум-фильтрования смолу промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и фильтровали с использованием насоса для удаления растворителя. Смолу высушивали в вакууме в течение ночи.

30. Высушенную смолу взвешивали, общая масса составила 68 г, увеличение массы составило 43 г. Смолу помещали в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, добавляли 150 мл смеси трифторуксусная кислота/ТА/1,2-этан дитиол/ TIS/H₂O/фенол в соотношении 7:1:1:0,1:0,35/0,5 и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу отделяли от фильтрата путем фильтрования с использованием насоса, к фильтрату добавляли 2000 мл этилового эфира при 0°С и полученный преципитат отделяли от этилового эфира путем центрифугирования и затем высушивали до получения массы 40 г неочищенного продукта, содержащего гептакозапептид.

1.2 Способ очистки гептакозапептида

1.2.1 Лиофилизованный образец неочищенного продукта, содержащего гептакозапептид растворяли в диметилсульфоксиде, разделяли с использованием системы для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и элюировали по градиенту. Фракции основного пика гептакозапептида собирали, объединяли и подвергали повторной лиофилизации для получения первичного очищенного сырьевого материала гептакозапептида. Лиофилизованный продукт после первоначальной очистки растворяли в 15% ацетонитриле и подвергли вторичной очистке с использованием системы для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Собирали фракции основного пика, при этом удаляли загрязняющие вещества вблизи основного пика, объединяли и подвергали повторной лиофилизации для получения очищенного гептакозапептида.

1.2.2 Условия проведения хроматографии:

оборудование для проведения хроматографии: оборудование для проведения жидкостной хроматографии Varian prepstar и программное обеспечение для управления и проведения анализа;

хроматографическая колонка; хроматографическая колонка C₁₈ (250×50 мм), заполненная Load & Lock;

подвижная фаза А: 0,05% TFA/2% ацетонитрил/вода; В: 90% ацетонитрил/вода; градиент элюции: первоначальная очистка: 8-8-32-57% подвижная фаза B в течение 70 минут, уровень градиента в течение 5 минут; вторичная очистка: 0-0-34-55% подвижная фаза B в течение 70 минут, уровень градиента в течение 5 минут;

длина волны УФ-детектора: 275 нм.

2. Способы синтеза и очистки пантапентаконтапептида

25 г смолы (постоянный заместитель 0,6 ммоль/г) использовали для получения в лабораторном масштабе в следующих этапах. В производственном масштабе использовали 1 кг смолы, пропорционально увеличивали загрузку веществ на входе и увеличивали время реакции.

1. Готовили точную навеску 25 г смолы Fmoc-Val-Wang и помещали внутрь реактора вместимостью 67,63 жидких унций (2 л), затем добавляли дихлорметан, встряхивали и выдерживали в течение 30 минут, промывали соответственно по 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и подвергали вакуум-фильтрованию для удаления растворителя.

2. Добавляли 500 мл 20% пиперидин/диметилформамида, перемешивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой защитной группы Fmoc. После удаления растворителя путем фильтрования с использованием насоса смолу затем промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования.

3. Готовили навески 21,2 г Fmoc-Leu-OH и 22,8 г гексафторфосфат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония и растворяли в 500 мл диметилформамида, затем добавляли 40 мл диизопропилэтиламина и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут при перемешивании. Затем полученную смесь помещали в реактор и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2 часов при встряхивании. После удаления реакционной жидкости путем фильтрования с использованием насоса смолу промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования.

4. Повторяли промывание и удаление защитной группы в Этапах 2 и 3 и данные аминокислоты последовательно вводили до реакции с последней аминокислотой.

5. Добавляли 750 мл смеси 20% пиперидин/ диметилформамида, перемешивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой защитной группы Fmoc. Затем удаляли растворитель путем фильтрования с использованием насоса, смолу затем промывали 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды, и удаляли растворитель путем фильтрования с использованием насоса. Смолу просушивали в вакууме в течение ночи.

6. Высушенную смолу взвешивали: общий вес составил 113 г, прибавка в весе составила 88 г. Смолу затем помещали в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, затем добавляли 8,45 жидких унций (250 мл) смеси трифторуксусная кислота/ТА/1,2-этан дитиол/TIS/Н₂ О/фенол 7:1:1:0,1:0,35/0,5 и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смолу отделяли от фильтрата путем фильтрования с использованием насоса, к фильтрату добавляли 3000 мл этилового эфира при 0°С, полученный осадок отделяли от этилового эфира путем центрифугирования и затем высушивали до веса 85 г неочищенного пантапентаконтапептида.

7. Способ очистки и условия проведения хроматографии были определены со ссылкой на те же этапы, относящиеся к получению гептакозапептида.

3. Способ синтеза и очистки додекапептида.

1-4. Те же этапы, что и при получении пантапентаконтапептида.

5. Добавляли 500 мл смеси 20% пиперидин/диметилформамида, встряхивали при комнатной температуре и проводили реакцию в течение 30 минут для удаления N-концевой защитной группы Fmoc. Затем удаляли растворитель путем фильтрования с использованием насоса, смолу затем промывали по 500 мл дихлорметана, метилового спирта и диметилформамида дважды и удаляли растворитель путем вакуум-фильтрования. Смолу просушивали в вакууме в течение ночи.

6. Высушенную смолу взвешивали: общий вес составил 46 г, прибавка в весе составила 21 г. Смолу помещали в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, затем добавляли 100 мл смеси трифторуксусная кислота/ТА/1,2-этан дитиол/TIS/H₂O 7:1:1:0,1:0,35 и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Смолу отделяли от фильтрата путем фильтрования с использованием насоса, к фильтрату добавляли 1500 мл этилового эфира при 0°С и полученный преципитат отделяли от этилового эфира путем центрифугирования и затем высушивали с получением 0,67 унций (17,0 г) неочищенного продукта, содержащего додекапептид.

7. Способ очистки и условия проведения хроматографии были определены со ссылкой на те же этапы, относящиеся к получению гептакозапептида.

Пример 2. Получение пантапентаконтапептида и гептакозапептида методом генетической инженерии и их очистка

На основании нуклеотидных последовательностей, кодирующих пантапентаконтапептид и гептакозапептид, соответствующие олигонуклеотидные последовательности использовали для конструирования экспрессионных векторов.

Для получения пантапентаконтапептида синтезировали четыре одноцепочечных олигонуклеотида следующим образом:

55-1: 60 п.н.

5' tcgagctccatgggtcgagaattcattctgaagatgttcgtcgactaaacgttctctgca 3'

55-2: 52 п.н.

5' gagaacgtttagtcgacgaacatcttcagaatgaattctcgacccatggagc 3'

55-3: 85 п.н.

5' gaggtcgacctgaacccagacagtgacaaaattatctactcccacttcacgtgtgccacagacaccgagaatatccgctttgtct 3'

55-4: 85 п.н.

5' tagcccggggaccagattgtactccttcaggttcagctggaggatggtgtccttgacggctgcaaagacaaagcggatattctcg 3'

Для получения гептакозапептида два одноцепочечного олигонуклеотида были синтезированы следующим образом:

27-1:

5' catggacaccgagaatatccgctttgtctttgcagccgtcaaggacaccatcctccagctgaacctgaaggagtacaatctggtctaaccc 3'

27-2:

5' gggttagaccagattgtactccttcaggttcagctggaggatggtgtccttgacggctgcaaagacaaagcggatattctcggtgtc 3'

Первый и второй одноцепочечные олигонуклеотиды, синтезированные для получения пантапентаконтапептида, отжигали для получения двуцепочечного фрагмента ДНК с липкими концами, полученный фрагмент ДНК клонировали в прямом направлении между сайтами рестрикции Xho I и Pst I в плазмиде pEGFP-N1 (плазмида предоставлена Факультетом генетики Третьего военного медицинского университета, Цунцин, Китай) и полученную плазмиду назвали pEGFP-A. Поскольку было 20 комплементарных оснований на 3'-концах третьего и четвертого синтезированных олигонуклеотидов, третий и четвертый олигонуклеотиды отжигали и удлиняли с использованием Taq-полимеразы для получения двуцепочечного фрагмента ДНК В. Амплифицированный фрагмент наблюдали в положении 150 п.н. маркера молекулярной массы ДНК при проведении электрофореза в 2,5% агарозном геле. Фрагмент В подвергали двойному расщеплению с использованием Sal I и Sma I и затем в прямом направлении клонировали между сайтами рестрикции Sal I и Sma I в плазмиде pEGFP-A и полученную плазмиду назвали pEGFP-55, которая содержит ген пантапентаконтапептид полностью. Ген пантапентаконтапептид получали путем двойной рестрикции с использованием Xho I и Sma I и вставляли между сайтами рестрикции Xho I и Sma I в плазмиде pIVEX2.3-MCS и полученную плазмиду назвали pIVEX2.3MCS-55. Скрининг нужной плазмиды может быть осуществлен следующим образом: исследуемую плазмиду подвергают двойному расщеплению с использованием Xho I и Sma I, анализируют путем проведения электрофореза в 2,5% агарозном геле и определяют как положительный клон, если в геле имеется полоса, соответствующая приблизительно 180 п.н. маркера молекулярной массы ДНК.

Первый и второй одноцепочечные олигонуклеотиды, синтезированные для получения гептагозапептида, отжигали для получения двуцепочечного фрагмента ДНК с липкими концами для Nco I и Sma I, плазмиду pIVEX2.3 подвергали двойному расщеплению с использованием Nco I и Sma I и подвергали электрофорезу, затем фрагмент плазмиды с липкими концами выделяли с использованием набора для выделения фрагментов ДНК из геля. Ген гептакозапептида в прямом направлении клонировали в плазмиду pIVEX2.3 (приобретена в компании Roche, Швейцария) с использованием Т4 ДНК-лигазы. Положительный клон содержит ген гептакозапептида, и такую плазмиду назвали pIVEX2.3-27. С чашки, содержащей ампициллин, были отобраны шесть колоний с лигированной рекомбинантной плазмидой, помещены в 5 мл среды LB и культивированы в течение ночи; плазмиду выделяли, проводили двойное расщепление с использованием эндокуклеаз рестрикции Nco I и Sma I и исследовали методом электрофореза для идентификации; клон, идентифицированный как положительный, далее подтверждали путем секвенирования. Было установлено, что плазмиды pIVEX2.3MCS-55 и pIVEX2.3-27 были успешно сконструированы. Плазмиды pIVEX2.3MCS-55 и pIVEX2.3-27 были отдельно трансформированы в компетентные клетки BL21 (DE3) pLysE (приобретены в компании Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай), плазмиду выделяли из колонии трансформированных клеток с использованием набора для выделения плазмид и идентифицировали путем рестрикции, и единичные колонии отбирали и культивировали в течение 10 часов в 2 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С при встряхивании 180 об/мин. К полученной бактериальной суспензии (200 мкл) добавляли 250 мл среды LB с ампициллином, культивировали в течение 10 часов при 37°С при встряхивании 180 об/мин, затем добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ, культивировали в течение 4-6 часов при 37°С и затем при 30°С в течение 10 часов. Бактериальные клетки осаждали путем центрифугирования и хранили при -70°С до использования. 1 г влажного бактериального осадка ресуспендировали в 5 мл связывающего буферного раствора, разрушали путем обработки ультразвуком во льду (параметры: продолжительность пульса 6 с, амплитуда 15-20, продолжительность перерыва 8-10 минут) и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 минут. Полученный супернатант отбирали пипеткой для очистки. Очистку проводили с использованием аффинной хроматографии с использованием никель-хелатирующей смолы в денатурирующих условиях. Колонку с никель-хелатирующей смолой сначала уравновешивали 5 мл денатурирующего связывающего буфера. Супернатант, полученный после обработки ресуспендированного бактериального осадка ультразвуком, пропускали через колонку с контролируемой скоростью потока, не превышающей 10 м/ч и собирали элюат. На колонку помещали 5 мл денатурирующего отмывочного буфера А и собирали элюат. Смешивали 1 мл полученной жидкости с неденатурирующим отмывочным буфером В и денатурирующим отмывочным буфером В в отношении 0:1, 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 и 1:0. Затем элюировали содержимое колонки с использованием вышеописанных буферных растворов и затем 2 мл неденатурирующего буфера В для промывки (общая продолжительность процедуры должна быть не меньше 2-3 часов) и собирали элюат. Элюирующий буфер А (3 мл) пропускали через колонку для элюирования белка и собирали элюат. Элюирующий буфер А (2×3 мл) пропускали через колонку для элюирования белка и собирали элюат. Чистоту полученного белка определяли методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле. Было показано, что бактериальные клетки BL21 (DE3) экспрессируют нужный полипептид, количество экспрессируемого полипептида составляет приблизительно 10% общего белка в бактериальных клетках, и выход данного полипептида из 250 мл бактериальной суспензии после очистки на колонке с никель-хелатирующей смолой и ренатурации составляет приблизительно 1,5 мг. Большую часть данного полипептида элюировали раствором 500 мМ имидазола, и данный полипептид формирует одну полосу при проведении электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, чистота продукта, определенная методом денситометрии, составила 98%.

Пример 3. Серия полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, может снижать содержание белка у крыс в модели гипертрофии кардиоцитов, индуцированной норэпинефрином.

1. Исследование проводили на крысах линии Wistar в возрасте 1-3 дня после рождения (приобретены в Центре экспериментальных животных Третьего военного медицинского университета). Крыс умерщвляли путем цервикальной дислокации и фиксировали на секционный стол. Кожу в вентральной части тела дезинфицировали 2% настойкой йода и затем 75% этиловым спиртом. Сердце удаляли, резали на куски размером приблизительно 1-3 мм³, подвергали повторному расщеплению с использованием дигестирующего раствора, содержащего 0,08% трипсина, 0,02% ЭДТА и 0,05% коллагена. Клетки собирали в модифицированную по способу Дульбекко культуральную среду Игла, содержащую 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и культивировали в инкубаторе при 37°С и содержании CO₂ 5%.

2. Кардиоциты культивировали в течение 48 часов и помещали в не содержащую сыворотки модифицированную по способу Дульбекко культуральную среду Игла и затем культивировали в течение 24 часов до добавления лекарственного средства в соответствии со следующим разделением на группы:

нормальная контрольная группа: добавляли 10 мкл фосфатно-солевого буфера;

группа норэпинефрина; норэпинефрин (НОРЭПИНЕФРИН, Serva Corporation, США) добавляли в концентрации 1 мкМ;

группа полипептида: добавляли Н норэпинефрин, в то время как соответствующий полипептид добавляли в концентрации 10 нМ.

3. После добавления лекарственного средства клетки культивировали в течение 24 часов и затем удаляли культуральную среду. Культуру затем промывали с использованием фосфатно-солевого буфера, затем добавляли 0,5 мл 5% трихлоруксусной кислоты на ячейку и выдерживали при 4°С в течение 1 часа. Полученный преципитат растворяли в 1 мл 0,1 М NaOH. Содержание белка определяли методом Лоури.

4. Результат: пантапентаконтапептид, пентатетраконтапептид, пентатриаконтапептид, триаконтапептид, гептакозапептид, пентадикозапептид, дикозапептид, гептадекапептид и пентадекапептид в количестве 10 нмоль/л может существенно снижать содержание белка в гипертрофии кардиоцитов, индуцированной норэпинефрином; додекапептид не обладает явным эффектом (как показано в Таблице 1).

Таблица 1
Влияние серийных полипептидов, описываемых настоящим изобретением, на содержание белка в культуральных кардиоцитах у крыс (n=6, )
Группа	Доза (нмоль/л)	Содержание белка (мкг/10 5 клеток)
Контроль	-	80,5±13,9
Норэпинефрин	1000	121,0±13,2**
Пантапентаконтапептид	10	90,3±10,8 ##
Пентатетраконтапептид	10	92,7±12,3 ##
Пентатриаконтапептид	10	93,4±12,0 ##
Триаконтапептид	10	99,8±9,9 ##
Гептакозапептида	10	89,4±10,7 ##
Пентадикозапептид	10	100,2±11,6 ##
Дикозапептид	10	103,4±11,4 #
Гептадекапептид	10	96,4±10,5 ##
Пентадекапептид	10	104,3±12,6 ##
Додекапептид	10	113,3±11,6
**Р<0,01 по сравнению с контрольной группой; #Р<0,05; ##Р<0,01 по сравнению с группой норэпинефрина.

Пример 4. Серия полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, может снижать содержание белка у крыс в модели гипертрофии кардиоцитов, вызванной ангиотензином II (Ангиотензин II).

1. Кардиоциты культивировали в течение 48 часов так же, как описано выше, затем помещали в не содержащую сыворотки модифицированную по способу Дульбекко культуральную среду Игла и культивировали в течение 24 часов до добавления лекарственного средства в соответствии с разделением на следующие группы: нормальная контрольная группа: добавляли 10 мкл фосфатно-солевого буфера; группа ангиотензина II: ангиотензин II добавляли в концентрации 1 мкМ; группа серии полипептидов: добавляли ангиотензин II, в то время как додекапептид, пентадекапептид, гептакозапептид, пантапентаконтапептид добавляли в концентрации 10 нМ.

2. После добавления лекарственного средства клетки культивировали в течение 24 часов и затем удаляли культуральную среду. Культуру затем промывали с использованием фосфатно-солевого буфера, затем добавляли 0,5 мл 5% трихлоруксусной кислоты на ячейку и выдерживали при 4°С в течение 1 часа. Полученный преципитат растворяли в 1 мл 0,1 М NaOH. Содержание белка определяли методом Лоури.

3. Результат: добавление ангиотензина II в культуральную среду существенно повышает содержание белка в кардиоците (мкг: 143,2±5,49 по сравнению 113,9±7,48, p<0,01) по сравнению с нормальной контрольной группой. По сравнению с ангиотензином II пентадекапептид, гептакозапептид и пантапентаконтапептид могут снижать содержание белка в кардиоците в разной степени, в то время как додекапептид не обладает явным эффектом (см. Таблица 2).

Таблица 2
Влияние серийных полипептидов на содержание белка в гипертрофических кардиоцитах, сформировавшихся под действием ангиотензина II (n=6, )
Группа	Доза (нмоль/л)	Содержание белка (мкг/10 5 клеток)
Контроль	-	113,9±7,48
Ангиотензин II	1000	143,2±5,49**
Додекапептид	10	144,0±11,7
Пентадекапептид	10	130,6±10,79#
Гептакозапептид	10	125,3±9,41 ##
Пантапентаконтапептид	10	127,2±6,33 ##
Примечание: **Р<0,01 по сравнению с контрольной группой; #Р<0,05; ##Р<0,01 по сравнению с группой ангиотензина II.

Пример 5. Полипептиды могут значительно подавлять гипертрофию миокарда у мышей, индуцированную норэпинефрином.

Пятьдесят мышей из использованных при проведении данного эксперимента (приобретены в Центре экспериментальных животных Третьего военного медицинского университета) были разделены на пять групп, содержащих по 10 мышей в группе. Мышам в контрольной группе вводили смесь 0,1% аскорбиновой кислоты, 3 мг % смешанного виннокислого калия-натрия и физиологического раствора натрия хлорида. Мышам в модельной группе вводили смесь 0,1% аскорбиновой кислоты, 6 мг % норэпинефрина битартрата, физиологического раствора натрия хлорида (эквивалент 1,5 мг/кг норэпинефрина). Мышам в трех дозовых группах вводили пентадекапептид, гептакозапептид и пантапентаконтапептид в количестве 30 мкг/кг соответственно, во время введения смеси 0,1% аскорбиновой кислоты, 6 мг % норэпинефрина битартрата и физиологического раствора натрия хлорида. Введение осуществляли последовательно интраперитонеально дважды в день в течение 15 дней. Объемы дозирования для каждой группы составили 50 мл/кг. Затем животных забивали путем цервикальной дислокации, вскрывали грудную клетку, вынимали сердце, промывали от крови охлажденным физиологическим раствором натрия хлорида, промакали фильтровальной бумагой и взвешивали на весах. Осторожно отделяли предсердия и правый желудочек (оставляя межжелудочковую перегородку) и взвешивали левый желудочек.

Полученные результаты показывают, что серия полипептидов может значительным образом предотвращать развитие гипертрофии миокарда у мышей, и различные индикаторы гипертрофии миокарда во всех остальных группах были значительно улучшены, кроме массы сердца в группе пентадекапептида (снижение на 9,9% при Р>0,05) (см. Таблицу 3).

Таблица 3
Влияние серий полипептидов на гипертрофию миокарда у мышей ( )
Группа	N	МТ (г)	МС (мг)	МЛЖ (мг)	СИ (мг/г)	ИЛЖ (мг/г)
Контроль	10	25,1±2,19	98,8±9,68	70,8±8,21	3,95±0,31	2,82±0,27
Норэпинефрин	8	23,2±1,69	112,1±12,1 *	85,6±9,16 **	4,82±0,44 **	3,69±0,36 **
Пентадекапептид	9	23,6±2,51	100,9±12,8	74,7±9,25##	4,27±0,42 ##	3,16±0,39 ##
Гептакозапептида	8	23,1±2,26	95,2±5,79#	67,9±6,30 ##	4,17±0,52 ##	2,98±0,48 ##
Пантапентаконтапептид	8	23,3±2,05	99,0±16,3#	72,9±12,8 ##	4,24±0,59 ##	3,13±0,50 ##
Примечание: МТ - масса тела; МС - масса сердца; МЛЖ - масса левого желудочка; СИ - сердечный индекс; ИЛЖ - индекс левого желудочка или индекс гипертрофии 5 миокарда.
*Р<0,05; **Р<0,01 по сравнению с контрольной группой; #Р<0,05; ##Р<0,01 по сравнению с группой норэпинефрина

Пример 6. Серия полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, значительно подавляет гипертрофию миокарда у крыс, индуцированную норэпинефрином.

Отбирали тридцать из крыс линии Wistar и разделяли на пять групп по 6 животных. Крысам контрольной группы вводили смесь 0,1% аскорбиновой кислоты, 3 мг % смешанного виннокислого калия-натрия и физиологического раствора натрия хлорида; крысам в модельной группе вводили смесь 0,1% аскорбиновой кислоты, 6% мг норэпинефрина битартрата и физиологического раствора натрия хлорида; крысам в трех группах дозирования вводили пентадекапептид, гептакозапептид и пантапентаконтапептид в количестве 15 мкг/кг соответственно, во время введения норэпинефрина. Объем дозирования для каждой группы составил 33 мл/кг, и введение осуществляли последовательно интраперитонеально дважды в день в течение 20 дней. По истечении указанного периода времени сердце и левый желудочек взвешивали.

Полученные результаты показали, что пентадекапептид может существенно снижать индекс левого желудочка, гептакозапептид и пантапентаконтапептид могут существенно снижать массу левого желудочка, сердечный индекс и индекс левого желудочка (см. Таблицу 4).

Таблица 4.
Влияние серийных полипептидов на гипертрофию миокарда у крыс, индуцированную действием норэпинефрина (n=6, )
Группа	МТ (г)	MC (г)	МЛЖ (г)	СИ (г/кг)	ИЛЖ (г/кг)
Контроль	189±15	0,573±0,035	0,408±0,027	3.043±0,178	2.166±0,114
Норэпинефрин	187±5,0	0,690±0,078*	0,555±0,055**	3.674±0,348**	2.954±0,225**
Пентадекапептид	188±12	0,673±0,055	0,490±0,038	3.580±0,226	2.606±0,154 #
Гептакозапептид	200±13	0,622±0,032	0,442±0,017 ##	3.111±0,041 ##	2.213±0,056 ##
Пантапентаконтапептид	190±21	0,630±0,052	0,450±0,036 ##	3.310±0,137 #	2.368±0,166 ##
Примечание: МТ - масса тела; МС - масса сердца; МЛЖ - масса левого желудочка; СИ - сердечный индекс; ИЛЖ - индекс левого желудочка, или индекс гипертрофии 10 миокарда.
*Р<0,05; **Р<0,01 по сравнению с контрольной группой; #Р<0,05; ##Р<0,01 по сравнению с группой норэпинефрина

Пример 7. Полипептиды, которые могут значительным образом развитие гипертрофии миокарда у крыс, индуцированной коарктацией аорты.

Взрослые самцы крыс линии Wistar (приобретены в Центре экспериментальных животных Третьего военного медицинского университета) были случайным образом распределены в следующие группы: группа, которой была проведена имитация операции; группа, которой была проведена модельная операция; и группа, получавшая полипептиды. До проведения операции животных не кормили в течение ночи и предоставляли неограниченный доступ к воде, затем животным была введена анестезия (фенобарбитал натрия) и проведена перитонеотомия. Абдоминальную аорту отделили и вдоль абдоминальной аорты ввели 8 G иглу (внешний диаметр 0,80 мм) поверх правой почечной артерии с использованием шелковой хирургической нити до того, как иглу быстро удалили. Затем живот зашили с использованием шелковой хирургической нити. Крыс из группы имитации операции подвергли той же процедуре, как указано выше, кроме того, что лигатуру из шелковой нити не накладывали. С первого дня после операции крысам в группе имитации операции и в группе модельной операции интраперитонеально вводили физиологический раствор натрия хлорида в количестве 7,5 мл/кг один раз в день; крысам в группе полипептида интраперитонеально вводили пентадекапептид, гептакозапептид и пантапентаконтапептид соответственно, в количестве 15 мкг/кг один раз в день. Крыс разводили в течение 3 недель и затем забивали, вскрывали грудную клетку, вынимали сердце, промывали от крови охлажденным физиологическим раствором натрия хлорида, промакивали фильтровальной бумагой и взвешивали на весах. Взвешивали сердце и левый желудочек.

Результаты показали, что серия полипептидов может значительным образом предотвращать развитие гипертрофии миокарда у крыс; наблюдали существенное снижение показателей МС, МЛЖ, СИ и ИЛЖ (см. Таблицу 5).

Таблица 5
Влияние серийных полипептидов на гипертрофию миокарда у крыс, индуцированную коарктацией аорты ( )
	n	МТ (г)	МС (мг)	МЛЖ (мг)	СИ (мг/г)	ИЛЖ (мг/г)
Группа, которой была проведена имитация операции	6	222±8,2	713±23,3	399±24,9	3,22±0,08	1,80±0,07
Группа, которой была проведена модельная операция	5	204±5,8	813±31,3*	508±26,4 *	3,98±0,09 **	2,48±0,10 **
Пентадекапептид	5	208±5,6	706±30,8#	418±12,3 #	3,39±0,10 ##	2,01±0,06 ##
Гептакозапептида	5	211±6,4	696±30,7##	413±22,1 #	3,30±0,08 ##	1,96±0,08 ##
Пантапентаконтапептид	5	215±8,0	702±31,3##	409±24,6 #	3,27±0,08 ##	1,90±0,07 ##
*Р<0,05; **Р<0,01 по сравнению с группой, которой была проведена имитация операции; # Р<0,05; ##Р<0,01 по сравнению с группой, которой была проведена модельная операция.

Пример 8. Серия полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, могут предотвращать перестройку миокарда у крыс со спонтанной гипертензией.

1. Тридцать крыс в возрасте 13 недель со спонтанной гипертензией (SHR, приобретены в Пекинской лаборатории животных технологий Vital River Co. Ltd., Пекин) были отобраны и случайным образом распределены в пять групп по 6 крыс на группу.

Крысам со спонтанной гипертензией в модельной группе (плацебо) интраперитонеально вводили 0,9% физиологического раствора в количестве 5 мл/кг дважды в день.

В группе положительного контроля (лозартан) крысам ежедневно внутрижелудочно вводили калий лозартан в количестве 6 мг/кг.

В группе пентадекапептида: крысам вводили пентадекапептид в количестве 30 мкг/кг интраперитонеально дважды в день.

В группе гептакозапептида: крысам вводили гептакозапептид в количестве 30 мкг/кг интраперитонеально дважды в день.

В группе пантапентаконтапептида: крысам вводили пантапентаконтапептид в количестве 30 мкг/кг интраперитонеально дважды в день.

Шесть крыс лини WKY (Wistar-Kyoto) (приобретены в Центре экспериментальных животных Третьего военного медицинского университета) были дополнительно отобраны в качестве нормального контроля.

2. Введение лекарственного средства осуществляли последовательно в течение восьми недель (с 14-й недели по 21-ю неделю). Значения массы тела всех тестированных крыс получали один раз в две недели и вводимую дозу корректировали на основании полученных значений массы тела.

3. Полученные результаты позволяют предположить, что:

(1) серия полипептидов обладает некоторым гипотензивным действием и может существенно снижать систолическое кровяное артериальное давление у крыс со спонтанной гипертензией (см. Таблицу 6).

Таблица 6
Влияние серийных полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, на систолическое кровяное давление у крыс со спонтанной гипертензией ( , n=6).
Группа	Доза	Систолическое кровяное артериальное давление (мм рт.ст.)
0 недель	2 недель	4 недель	6 недель	8 недель
WKY		143,8±10,79	144,8±9,03	143,8±8,16	144,4±9,67	142,6±4,82
Плацебо	-	176,9±1,82	207,4±8,80##	225,3±16,24##	238,6±8,09*	248,1±7,27*
Лозартан	6 мг/кг	178,3±2,24	165,1±4,80 **	177,1±8,27 **	178,3±6,23 **	172,6±4,82 **
Пентадекапептид	30 мкг/кг	177,3±6,42	190,4±7,75 **	200,2±4,13 **	217,1±8,82 **	224,1±6,37 **
Гептакозапептида	30 мкг/кг	180,0±3,60	185,2±6,92 **	189,4±6,34 **	211,6±3,97 **	202,3±3,87 **
Пантапентаконтапептид	30 мкг/кг	178,2±4,15	189,8±7,80 **	193,4±5,31 **	216,0±5,55 **	218,3±8,54 **
## Р<0,01 по сравнению с WKY; **Р<0,01 по сравнению с плацебо.

(2) Применение серии полипептидов, предложенных согласно настоящему изобретению, может значительно улучшить состояние при перестройке миокарда у крыс со спонтанной гипертензией, и может привести к значительному снижению МТ, МЛЖ, СИ и ИЛЖ у крыс (Таблица 7), а также толщины задней стенки левого желудочка (ТЗСЛЖ) и толщины межжелудочковой перегородки (ТМЖП) у крыс со спонтанной гипертензией (Таблица 8).

Таблица 7
Влияние серийных полипептидов на гипертрофию миокарда у крыс ( , n=6).
Группа	Доза	МТ (г)	МС (мг)	МЛЖ (мг)	СИ (мг/г)	ИЛЖ (мг/г)
WKY		300±8	876±29	582±20	2,92±0,05	1,94±0,10
Плацебо	-	309±6	1176±39##	950±31 ##	3,80±0,08 ##	3,07±0,13 ##
Лозартан	6 мг/кг	288±9	1003±16**	789±88	3,48±0,05 **	2,74±0,28
Пентадекапептид	30 мкг/кг	307±8	1055±30 **	775±28 **	3,44±0,05 **	2,46±0,04 **
Гептакозапептида	30 мкг/кг	304±10	849±23**	609±99 **	2,80±0,03 **	2,01±0,07 **
Пантапентаконтапептид	30 мкг/кг	291±7	949±28**	705±49 **	3,26±0,05 **	2,30±0,08 **
Примечание: **Р<0,01 по сравнению с плацебо; ##Р<0,01 по сравнению с WKY

(3) Действие серии полипептидов, описываемых в настоящем изобретении, на морфологию сердечной мышечной ткани у крыс со спонтанной гипертензией.

Результаты морфологического анализа позволяют предположить, что в то время как поперечный диаметр (ПД) и площадь поперечного сечения (ППС) кардиоцита крыс из модельной группы существенно снижаются по сравнению с данными параметрами в группе WKY (Р<0,01), площадь поперечного сечения кардиоцита у крыс в группе, получавших серию полипептидов и в группе, получавших Лозартан, существенно снижены по сравнению с данными параметрами в модельной группе (Р<0,01) (см. Таблицу 9).

Таблица 9
Морфологический анализ кардиоцитов крыс ( , n=6)
Группа	Доза	ПД (мкм)	ППС (мкм2)
WKY	-	11,30±2,35	248±26
Плацебо	-	15,5612,94##	375±11##
Лозартан	6 мг/кг	13,83±2,54	335±20**
Пентадекапептид	30 мкг/кг	14,88±2,56	329±24**
Гептакозапептида	30 мкг/кг	12,33±1,84 **	286±22 **
Пантапентаконтапеп тид	30 мкг/кг	14,62±2,36	313±29**
## p<0,01 по сравнению с WKY; **p<0,01; **p<0,01 по сравнению с плацебо.

Под световым микроскопом было видно, что ядро кардиоцита было окрашено в синий цвет, плазма клетки была окрашена в розовый цвет, а коллаген не был окрашен.

В модельной группе у крыс со спонтанной гипертензией (Фиг.1): волокна миокарда утолщались, набухали, имели непрозрачные промежуточные пространства, были изломаны, сливались или беспорядочно располагались, и часть волокон миокарда характеризовалась более выраженной дегенерацией миокарда на обширной площади; кардиоциты были подвергнуты значительной гипертрофии, мутному набуханию, дегенерации по вакуолярному типу; ядра клеток увеличивались или подвергались пикнозу; содержимое клетки становилось гранулярным, изломанным и сливалось, даже присутствовали участки некроза; пятнистые некротические участки и очаговые некротические участки были видны в нескольких полях зрения; стенки сосудов утолщались; клетки гладкой мускулатуры пролиферировали и гипертрофировались; наблюдали интерстициальный фиброз миокарда в нескольких отдельных полях зрения. Но в целом, степень фиброза относительно умеренная и воспалительная ответная реакция относительно острая в модельной группе; очаги некроза наблюдали в нескольких полях зрения.

В группе, получавшей Лозартан (Фиг.2): патологические изменения некоторым образом улучшены и представлены в основном как инфильтрация воспалительных клеток. Можно видеть, что кардиоциты подвергнуты воспалительным изменениям, таким как видимое мутное набухание, гипертрофия и другие изменения, и участки некроза также наблюдают в нескольких полях зрения.

В группе, получавшей гептакозапептид (Фиг.3): по сравнению с модельной группой крыс со спонтанной гипертензией вышеописанные патологические изменения в кардиоцитах значительно облегчены. Улучшения патологических изменений в группе гептакозапептида значительно приближают статус этой группы к нормальной контрольной группе, и воспалительные изменения были видны случайным образом в отдельных полях зрения, такие как незначительное набухание кардиоцитов и другие изменения. Участки некроза не сформированы, и морфология волокон миокарда и стенки сосудов соответствуют норме.

(4) Действие гептакозапептида на ультраструктуру кардиоцита у крыс со спонтанной гипертензией (трансмиссионный электронный микроскоп PHILIPS-TECNI10, Нидерланды).

В модельной группе крыс со спонтанной гипертензией (Фиг.4): объем кардиоцитов увеличен, целостность ядерной мембраны кардиоцитов нарушена, ядро подвергнуто нерегулярным изменениям, таким как гипертрофия, деформация, лизис и другим изменениям; саркоплазматический ретикулум расширен; митохондрии пролиферируют, беспорядочно располагаются и набухшие в разной степени (незначительно, умеренно или остро), внутри которых формируются вакуоли; миофиламенты в основном нормально организованы и подвергаются очаговому лизису в части кардиоцитов; поперечная полосатость с расплывчатыми контурами могут быть видны в отдельных участках и Z-линии в основном соответствуют норме, некоторые из которых беспорядочно располагаются; интерстициальные коллагеновые волокна не характеризуются значительной пролиферацией.

В группе, получавшей Лозартан (Фиг.5): морфология клеточного ядра в основном соответствует норме и некоторым образом нерегулярна; миофиламенты под плазматической мембраной подвергаются очаговому лизису; митохондрии слегка набухшие; саркоплазматический ретикулум расширен и слегка набухший; структура Z-линий и поперечная полосатость в основном соответствуют норме.

В группе, получавшей гептакозапептид (Фиг.6): по сравнению с модельной группой крыс со спонтанной гипертензией, ультраструктура миокарда значительно улучшена. Структура кардиоцитов в-основном соответствует норме: саркомеры кардиоцита и миофиламенты в основном соответствуют норме; поперечные полосы четко видны; интерстициальные коллагеновые волокна не характеризуются значительной пролиферацией; Z-линии располагаются организованно; митохондрии не характеризуются значительной пролиферацией, некоторые митохондрии слегка набухшие; миофиламенты слегка подвергнуты лизису; и эндотелиальные клетки капиллярных сосудов соответствуют норме.

Несмотря на приведенные выше примеры, варианты реализации настоящего изобретения не ограничены вышеупомянутыми примерами; различные вариации вариантов реализации настоящего изобретения могут быть предложены, не выходя за рамки данного изобретения, и в любом случае будут попадать в объем, определяемый формулой настоящего изобретения.

Список литературы

1. Cooper G 4th. Basic determinants of myocardial hypertrophy: a review of molecular mechanisms. Annu Rev Med, 1997, 48:13-23.

2. Aoki H, Sadoshima J, Izumo S. Myosin light chain kinase mediates sarcomere organization during cardiac hypertrophy in vitro. Nat Med 2000, 6(2):183-188.

3. McKinsey ТА, Kass DA. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving bеneаth the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 2007; 6(8):617-635.

4. Mitchell JA, Ventura HO, Mehra MR. Early recognition and treatment of hypertensive heart disease. Curr Opin Cardiol. 2005; 20(4):282-289.

5. Jalili T, Carlstrom J, Kim S, Freeman D, Jin H, Wu TC, Litwin SE, David Symons J. Quercetin-supplemented diets lower blood pressure and attenuate cardiac hypertrophy in rats with aortic constriction. J Cardiovasc Pharmacol. 2006; 47(4):531-541.

6. Carlstrom J, Symons JD, Wu TC, Bruno RS, Litwin SE, Jalili T. A quercetin supplemented diet does not prevent cardiovascular complications in spontaneously hypertensive rats. J Nutr. 2007; 137(3):628-633.

7. Niizeki T, Takeishi Y, Kitahara T, et al. Diacylglycerol Kinase zeta Rescues Galphaq-Induced Heart Failure in Transgenic Mice. Circ J. 2008; 72(2):309-317.

8. Dorn GW 2nd, Tepe NM, Lorenz JN, Koch WJ, Liggett SB. Low- and high-level transgenic expression of ₂-adrenergic receptors differentially affect cardiac hypertrophy and function in G q-overexpressing mice. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96(11):6400-6405.

9. Berenji K, Drazner MH, Rothermel BA, Hill JA. Does load-induced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure? Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005; 289(1):H8-H16.