штамм дрожжей yarrowia lipolytica вкпм y-3753 - продуцент янтарной кислоты

Формула изобретения

Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3753 - продуцент янтарной кислоты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к технологии микробиологического синтеза янтарной кислоты.

Янтарная кислота (сукцинат), член семейства С₄-дикарбоновых кислот, является предшественником для получения ряда крупнотоннажных химических продуктов, биодеградируемых полимеров, а также используется в пищевой и фармацевтической промышленности. В настоящее время подавляющая часть янтарной кислоты для промышленного применения вырабатывается с помощью нефтехимического синтеза, что приводит к загрязнению окружающей среды. Поэтому перспективным является развитие конкурентоспособного микробиологического способа производства янтарной кислоты, поскольку он основывается на возобновляемом сырье и является более экологичным.

Известен штамм-продуцент янтарной кислоты Mannheimia succiniciproducens PALK (КСТС 10973 ВР) (ЕР 2054502), анаэробное культивирование которого на глюкозе, в условиях поддержания рН на уровне 6,5 с помощью подачи раствора аммиака, позволяет получить 46 г/л сукцината.

Накопление 99 г/л сукцината штаммом Escherichia coli AFPlll/pTrc99A-pyc осуществляют в процессе двухстадийной ферментации (J Ind Microbiol Biotechnol. 2002, Jun; 28(6):325-32). На первой стадии культуру наращивают аэробно, после чего следует анаэробная стадия, при этом рН культуры поддерживают на уровне 7,0 путем добавления NaOH.

Основным недостатком используемых в настоящее время бактериальных продуцентов является то, что их выращивание требует поддержания рН, близкого к нейтральному, что приводит к образованию в культуральной жидкости солей янтарной кислоты, для превращения которых обратно в янтарную кислоту необходимо использовать сильную неорганическую кислоту.

Затраты, связанные с поддержанием рН культуры и последующего перевода целевого продукта из соли в кислоту, составляют значительную часть себестоимости янтарной кислоты, поэтому в настоящее время актуальна задача разработки продуцентов, устойчивых к янтарной кислоте при низких значениях рН и способных обеспечить получение янтарной кислоты без применения нейтрализующего агента.

В качестве перспективных объектов для разработки таких продуцентов могут быть рассмотрены дрожжи, обладающие способностью приспосабливаться к низким значениям рН среды и технологичные при культивировании.

Известен дикий штамм дрожжей Candida zeylanoides VKM Y-2324, продуцирующий 9,4 г/л янтарной кислоты при культивировании на этаноле в качестве источника углерода, в условиях поддержания рН среды на уровне 5,0 (Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Овчинникова, 2006, т. 2, № 4: 7-19). Однако увеличение продуктивности данного организма ограничивается отсутствием разработанного генно-инженерного инструментария.

Описан рекомбинантный штамм Saccharomyces cerevisiae SUC-194, продуцирующий при росте на среде с глюкозой 19,5 г/л янтарной кислоты (WO 2010/118932). Для получения наибольшего количества биомассы культуру сначала наращивают в течение 24 часов аэробно при рН 5,0, а на второй стадии культивирование осуществляют в течение 90 часов в анаэробных условиях, без регулирования рН, уровень которого в итоге снижается до 3,25.

В работе (RU 2422526) для получения янтарной кислоты предложено использовать штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica со сниженной активностью фермента сукцинатдегидрогеназы, наиболее продуктивный из которых, штамм ВКПМ Y-3314 (с инактивированным геном SDH2), продуцирует около 20 г/л янтарной кислоты при росте на полной питательной среде с глицерином, без добавления веществ, стабилизирующих рН. Однако предложенные штаммы оказались практически не способны расти без рН - статирования на средах с глюкозой (продукция менее 1 г/л культуральной жидкости, табл.), которая является более дешевым углеродсодержащим субстратом.

Технической задачей заявляемого изобретения является расширение ассортимента штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica, способных продуцировать янтарную кислоту.

Поставленная задача решена созданием штамма Yarrowia lipolytica, способного при росте на питательной среде, содержащей глюкозу в качестве расходуемого углеродсодержащего компонента и без добавления веществ, стабилизирующих рН, продуцировать янтарную кислоту в количестве до 60 г/л культуральной жидкости.

Заявляемый штамм получен из штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3314 путем многоступенчатого мутагенеза с использованием нитрозогуанидина и последующей двухэтапной селекции. Первичный отбор мутантов осуществляли по способности к росту на агаризованной среде с глюкозой, в качестве единственного источника углерода, при низких значениях рН, а на втором этапе - по способности к продукции янтарной кислоты в жидкой культуре.

Заявляемый штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) под регистрационным номером ВКПМ Y-3753.

Культурально-морфологические признаки.

На модифицированной полной среде YPD (мас.%: глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, агар - 1,8, вода - остальное) после четырех дней выращивания штамм образует колонии диаметром 1-1,5 мм, с кремовым оттенком. Край колоний неровный, поверхность складчатая, образует подобие воронки, выражен вертикальный рост колоний.

В аналогичной жидкой среде трехдневная культура имеет клетки гетерогенные по размеру: от округлых до сильно удлиненных (2-4,5)×(4-22) мкм, образует истинный и псевдомицелий.

На агаризованной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2%), лейцина (0,01%), карбоната кальция (1%) и фосфатного буфера (50 мМ, рН 6,8), после шести дней выращивания культура образует колонии почти белого цвета, диаметром 1-1,5 мм. Через 3-5 дней поверхность культуры приобретает складчатость, а диаметр отдельно стоящих колоний может достигать 3 мм.

Физиолого-биохимические признаки

Облигатный аэроб. Брожение отсутствует. Утилизирует глюкозу, глицерин. Не растет на этаноле, янтарной и уксусной кислотах, в качестве единственного источника углерода. Ауксотроф по тиамину, лейцину. Не патогенен. Температура роста 28-30°С.

Штамм хранят в виде лиофильно высушенной культуры или в 10% глицерине при -70°С.

Изобретение характеризуется следующим примером.

Пример. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3753. Посевной материал получают высевая культуру, хранящуюся в 10% глицерине при -70°С, на среду, содержащую (мас.%): глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, карбонат кальция - 1, агар - 1,8, вода - остальное. Выращивают в течение 3 суток и для засева одной пробирки используют полную петлю посевного материала.

Культивируют штамм в пробирках при температуре 30°С при 250 об/мин в 5 мл полной питательной среды следующего состава (мас.%): глюкоза - 11; дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, вода - остальное. Время выращивания - 96 часов.

Концентрацию янтарной кислоты в культуральной жидкости определяют методом ВЭЖХ с использованием системы Waters HPLC (Waters, США), колонки с обратной фазой ReproSil-Pur C18-AQ (4mm x 250 mm, 5 mm, Dr. Maisch, Германия) по методу, описанному в (Biotechnology and Bioengineering, 2010, Nov. l07(4): 673-682). Остаточную концентрацию глюкозы определяют спектрофотометрически глюкозооксидазным методом с помощью набора реагентов «Диаком Глюкоза» (Диаком-ВНЦМДЛ, Россия) согласно инструкции производителя.

По окончании культивирования содержание янтарной кислоты в культуральной жидкости составляет 60 г/л, конверсия по глюкозе - 57%, конечное значение рН 3.

Продукция янтарной кислоты штаммом Y. lipolytica ВКПМ Y-3753 при культивировании на среде, содержащей глюкозу в качестве расходуемого углеродсодержащего компонента и без добавления веществ, стабилизирующих рН, приведена в таблице.

Регистрационный номер штамма	№ цикла/ № клона	Продукция янтарной кислоты, г/л
ВКПМ Y-3314	Исходный	0,5
ВКПМ Y-3753	4/6	60

Таким образом, получен высокопродуктивный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющий производить янтарную кислоту путем конверсии глюкозы без добавления титрующих агентов, перспективный для использования в промышленности.