штамм клубеньковых бактерий bradyrhizobium japonicum 859 для получения удобрения под сою

Формула изобретения

Штамм бактерий Bradyrhizobium japonicum 859, депонированный в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 05.12.2008 г. под регистрационным номером 24117 в группе клубеньковых бактерий, в качестве средства для получения удобрения под сою.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 для получения микробиологического удобрения, повышающего урожайность сои.

В настоящее время для повышения урожайности бобовых культур используют бактериальные удобрения, изготовляемые на основе азотфиксирующих клубеньковых бактерий.

Так, из описания к Авторскому свидетельству СССР № 491695 известен штамм Rhizobium japonicum 646, который используется для изготовления нитрагина. Его недостатком является относительно невысокая азотфиксирующая активность и конкурентная способность.

Из описания к Авторскому свидетельству СССР № 640989 (опубликовано 08.01.1979) известен штамм клубеньковых бактерий сои Rhizobium japonicum 614а, являющийся высокоактивным симбиотическим азотфиксатором. Его недостатком является чувствительность к химическим протравителям семян, поэтому обработку семян бобовых культур требуется проводить непосредственно перед посевом, не совмещая ее с химическим протравливанием.

Из описания к Авторскому свидетельству СССР № 1034358 (приоритет от 04.01.1982 г., опубликовано 07.04.1984 г.) известен также штамм клубеньковых бактерий сои Rhizobium japonicum 634 Б, который используется при промышленном изготовлении бактериального препарата нитрагина под сою. При этом указанный штамм 634 Б активно фиксирует атмосферный азот в симбиозе с соей, способствует активному накоплению протеина растениями. Его недостатком является относительно невысокая эффективность.

Известен штамм бактерий Rhizobium japonicum 24108 (71т), описанный в материалах к Авторскому свидетельству № 939547 (приоритет от 31.07.1990, опубликовано 30.06.1993 г.), позволяющий получать повышенный урожай зеленой массы и зерна сои по сравнению с другими известными на дату приоритета аналогичными штаммами. Его недостатком является низкая конкурентоспособность с местными штаммами клубеньковых бактерий сои.

Известен целый ряд штаммов клубеньковых бактерий для промышленного производства бактериальных препаратов под сою, описанных в украинских патентах, например:

- Bradyrhizobium japonicum М-8 (декларационный патент (UA) на изобретение 39545 А, опубликованный 15.06.2001 г.);

- Bradyrhizobium japonicum КН 10 (декларационный патент (UA) на изобретение 69993 А, опубликованный 15.09.2004 г.);

- Bradyrhizobium japonicum Т66 (патент (UA) на изобретение 83298 С2, опубликованный 25.06.2008 г.);

- Bradyrhizobium japonicum 36 (патент (UA) на полезную модель 36700 U, опубликованный 10.11.2008 г.);

- Bradyrhizobium japonicum 46 (патент (UA) на изобретение 85943 С2, опубликованный 10.03.2009 г.).

Их недостатком является то, что указанные штаммы отбирались и испытывались на сортах сои, культивируемых в Украине, применительно к местным почвенно-климатическим условиям. При этом отсутствуют данные по эффективности этих штаммов в почвенно-климатических условиях основных регионов культивирования сои в России: в Краснодарском, Ставропольском краях, в Ростовской области, на Дальнем Востоке, в Сибири.

Известен также микробиологический препарат Агростим Б, содержащий консорциум штаммов Pseudomonas fluorescens и Azotobacter spp. (см., например, статью «Повышение урожайности зернобобовых культур за счет применения препарата Агростим Б», авторы Кирсанова Е.В., Дарюга К.В. / ФГОУ ВПО Орел ГАУ, Мусалатова Н.Н., Цуканова З.Р., Борзенкова Г.А./ ГНУ ВНИИЗБК/, опубликованную в журнале Вестник Орел ГАУ № 4 за 2008 г. УДК 635. 656: 633.353: 635.655). Указанный препарат может использоваться как для предпосевной обработки семян, так и для опрыскивания почвы и вегетирующих растений. Он обладает ростостимулирующим и подавляющим вредную микрофлору действием. Недостатком является то, что при обработке указанным препаратом на корнях растений не происходит образование клубеньков, фиксирующих необходимый для питания растений атмосферный азот, что не позволяет сильно повысить урожайность сои и приводит к необходимости вводить в почву дополнительно азотистые удобрения.

Известно также микробиологическое удобрение под сою Ризоторфин на основе штамма клубеньковых бактерий сои Rhizobium japonicum 629^а (прототип), описанный в материалах к Авторскому свидетельству № 939547 (приоритет от 05.01.1981 г., опубликовано 30.06.1982 г.), позволяющее получать урожай сои с повышенным содержанием белка в зерне. Указанный штамм 629^а (87) пригоден для промышленного изготовления препаратов клубеньковых бактерий (Ризоторфина). Недостатком является относительно невысокая эффективность на основных производственных сортах сои, выращиваемой на почвах Дальнего Востока.

Задачей заявляемого изобретения является выявление нового штамма бактерий с высокой азотфиксирующей активностью, пригодного для использования в сельском хозяйстве с целью повышения урожайности сои.

Указанная задача решается за счет того, что для удобрения под сою используется штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859.

Штамм бактерий был выделен из клубеньков произрастающей на мощном черноземе Гулькевичского района Краснодарского края сои и был первоначально назван как штамм Bradyrhizobium japonicum М-8, который был депонирован в коллекции ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 05.12.2008 г. под регистрационным номером 24117 в группе клубеньковых бактерий. Затем в результате патентного поиска было выявлено, что в Украине другой штамм был назван Bradyrhizobium japonicum М-8 Kircyner (декларационный патент (UA) на изобретение 39545 А, опубликованный 15.06.2001 г.), после чего, во избежание проблем с нарушением интеллектуальной собственности, выделенный Заявителем штамм был переименован 11.02.2010 г. в штамм Bradyrhizobium japonicum 859.

Штамм Bradyrhizobium japonicum 859 характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки имеют форму правильных палочек с закругленными концами и полярным расположением жгутика. Размер клеток (0,6-0,8)×(1,4-1,9) мкм.

Штамм Bradyrhizobium japonicum 859 не образует спор, отрицательно окрашивается по Граму. Рост в жидкой и полужидкой питательной среде аэробный, метаболизм дыхательный. На маннитно-дрожжевом агаре образует слизистые, выпуклые, круглые, матовые колонии с ровными краями, диаметром 2-5 мм. Оптимальная температура для роста 28°С. При температуре менее 20°С и более 35°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 6,8, рост происходит также при рН от 5,0 до 8,5. Аэроб, требователен к кислороду.

Штамм Bradyrhizobium japonicum 859 не гидролизует казеин, желатину. При росте штамма на лакмусовом молоке наблюдается слабовыраженное кислотообразование с изменением оттенка среды при сравнении с контролем. В качестве единственного источника углерода штамм способен использовать с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, глюкозу, галактозу и фруктозу. Штамм не способен использовать маннит, сахарозу и лактозу.

Для хранения и культивирования штамма Bradyrhizobium japonicum 859 в лабораторных условиях используют маннитно-дрожжевой агар (МДА) при рН=6,8±0,2 следующего состава, г/л:

Маннит	- 10,0
Дрожжевой экстракт	- 0,5
K2HPO4	- 0,5
MgSO 4×7H2O	- 0,2
NaCl	- 0,1
Агар	- 15,0

Как известно, для развития растений требуется азот. Азотфиксация - это биологическое усвоение молекул азота воздуха азотфиксирующими бактериями с образованием соединений азота, доступных для использования другими организмами; является одним из важнейших процессов круговорота азота в природе и показателем плодородия почвы. Азотфиксация осуществляется как свободноживущими азотфиксирующими бактериями - азотобактером, цианобактериями, азоспириллами и другими (несимбиотическая азотфиксация), так и симбиотическими азотфиксаторами, живущими в симбиозе с высшими растениями (например, клубеньковыми бактериями). В связи с этим азотфиксирующая активность штамма является важной характеристикой, оказывающей влияние на стимуляцию роста растений и урожайность.

Выявлено и экспериментально установлено, что бактерии заявленного штамма Bradyrhizobium japonicum 859 образуют на корнях растений клубеньки, обладают хорошими азотфиксирующими свойствами и положительно влияют на полевую всхожесть сои, ее рост и урожайность. При этом концентрация бактерий штамма для его эффективного использования в составе различных биопрепаратов должна составлять не менее 10⁸ КОЕ/мл. Экспериментально установлено также, что оптимальной является концентрация бактерий в диапазоне значений (10⁸-10⁹)КОЕ/мл, т.к. использование штамма в концентрации менее 10⁸ КОЕ /мл ведет к снижению указанного эффекта, а увеличение концентрации свыше 10⁹ КОЕ /мл не приводит к его увеличению.

Способность бактерий заявленного штамма Bradyrhizobium japonicum 859 образовывать на корнях растений клубеньки подтверждается вегетационными опытами, проведенными на опытной базе ГНУ ВНИИСХМ. Сначала подготовили грунт, смешав 80% почвы с опытного поля (дерново-подзолистой) с 20% торфяного грунта марки «Терравита». Затем полученный грунт разложили по 5 кг в вегетационные сосуды объемом по 3 л и полили водопроводной водой по 700 мл на сосуд. После этого произвели закладку семян на проращивание: сначала семена стерилизовали поверхностно 70% этиловым спиртом в течение 2 мин, затем промывали их стерильной водой три раза по 2 мин, после чего стерильные семена проращивали в чашках Петри в физиологическом растворе (0,85%) NaCl) при температуре 28°С в течение 3-х суток, а проростки замачивали в бактериальной суспензии Bradyrhizobium japonicum 629^а и Bradyrhizobium japonicum 859 с титром клеток 5·10⁷ КОЕ/мл в течение 15 мин и высаживали в почву. В конце опыта растения выкапывали вместе с корнями, корни отмывали, подсушивали и взвешивали отдельно надземную и подземную части растений, подсчитывали количество клубеньков. Результаты описанных вегетационных опытов с соей представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Количество клубеньков сои и вес растений в вегетационном опыте с соей
Вариант опыта	Вес растений, г	Количество клубеньков
Контроль - без обработки	2,55	0
Обработка бактериями штамма Bradyrhizobium japonicum 629 а	3,87	18,6
Обработка бактериями штамма Bradyrhizobium japonicum 859	4,55	27,3

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что при обработке семян сои бактериями заявленного штамма Bradyrhizobium japonicum 859 по сравнению с контролем растения сои имеют больший вес и на их корнях образуются клубеньки, причем в большем количестве, чем при обработке бактериями штамма-прототипа Bradyrhizobium japonicum 629^а.

Эффективность штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 проверена в вегетационных и полевых опытах с использованием микробиологического удобрения на его основе, которое заявителем названо БисолбиРиз. При изучении эффективности штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 было установлено, что предпосевная обработка семян сои удобрением БисолбиРиз влияет на их всхожесть и урожайность сои. Этим удобрением непосредственно перед посевом семена сои обрабатывали из расчета 0,3-0,7 литра БисолбиРиз на гектарную норму семян сои, которая зависит от сорта сои и составляет от 70 до 120 кг/га.

В таблице 2 представлены результаты опытов по определению полевой всхожести семян и урожайности сои сорта Ланцетная в зависимости от обработки микробиологическими удобрениями.

Таблица 2.
Влияние микробиологических удобрений, в т.ч. БисолбиРиз, на полевую всхожесть семян и урожайность сои
Вариант опыта	Полевая всхожесть, %	Урожай ность, т/га	Масса 1000 семян, г	Содержание белка в семенах, %
1. Контроль (без обработки)	74	2,07	114	36,6
2. Микробиологический препарат Агростим Б (Pseudomonas fluorescens+Azotobacter spp.). Обработка семян + опрыскивание всходов на 7 день после посева	79	2,47	117	37,0
3. Ризоторфин (Bradyrhizobium japonicum 629а). Обработка семян	77	2,42	115	37,2
4. БисолбиРиз (Bradyrhizobium japonicum 859). Обработка семян	80	2,48	118	37,5

Из данных, представленных в таблице 2, следует, что при обработке семян сои удобрением БисолбиРиз показатель всхожести повысился по сравнению с контролем на 8,1%, а по сравнению с удобрением Ризоторфин - на 3,9%.

За счет применения удобрения БисолбиРиз превышение по длине проростков по сравнению с контролем достигало 14%, корешков - до 18%, а по сравнению с удобрением Ризоторфин - до 4% и 7% соответственно.

Из представленных в таблице 2 данных следует также, что в результате обработки семян сои удобрением БисолбиРиз ее урожайность повысилась по сравнению с контролем на 0,41 т/га или на 19,8%, а по сравнению с удобрением Ризоторфин - на 0,06 т/га или на 2,5%.

Рост урожайности сои за счет применения удобрения БисолбиРиз обусловлен главным образом повышением продуктивности растений, т.е. за счет увеличения по сравнению с контролем количества бобов - до 21%, озерненности боба - до 12%, количества семян с растения - до 24%, массы семян с растения - до 25%.

Кроме того, при обработке семян сои удобрением БисолбиРиз отмечалось повышение качества семян сои в виде увеличения содержания в них белка в среднем на 0,9% по сравнению с контролем, на 0,5% по сравнению с препаратом Агростим Б и на 0,3% по сравнению с удобрением Ризоторфин.

При этом для достижения аналогичных агротехнических показателей (полевой всхожести и урожайности) сои с помощью препарата Агростим Б потребовалось обрабатывать им не только семена, но и опрыскивать всходы на 7-й день после посева, что подтверждает большую эффективность удобрения БисолбиРиз на основе штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 по сравнению с микробиологическим препаратом Агростим Б.

Таким образом, приведенные в таблице 2 данные подтверждают большую эффективность удобрения БисолбиРиз, полученного на основе заявленного штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859, не только по сравнению с препаратом Агростим Б, содержащим консорциум штаммов Pseudomonas fluorescens и Azotobacter spp., но и по сравнению с удобрением Ризоторфин, полученным на основе штамма-прототипа клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 629^а.

То есть из таблицы 2 следует, что заявленный штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859, характеризуется более высокой азотфиксирующей активностью по сравнению с известным штаммом клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 629 ^а, что оказывает положительное влияние на стимуляцию роста растений и урожайность сои, а также на повышение качества семян сои в виде увеличения содержания в них белка.

Все изложенное указывает на возможность использования штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 для изготовления препаратов - удобрений под сою.

Ниже приведен пример получения жидкой формы удобрения на основе заявляемого штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859.

Маточная культура

Для получения маточной культуры штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 использовали жидкую маннитно-дрожжевую среду, которую разливали по 100-150 мл в качалочные колбы объемом 750 мл. Автоклавирование проводили при температуре не менее 121°С в течение 20-30 минут. После этого среду в каждой колбе засевали смывом с одной пробирки со скошенным МДА с чистой культурой бактерий из холодильника, после чего колбы помещали на качалку (220±10 об/мин) на 72±3 часа при температуре 28-30°С. Таким образом в колбах была получена маточная культура с титром бактерий (3-5)·10 ⁹ КОЕ/мл, которую хранили в холодильнике для последующего засева бутылей или ферментеров.

Рабочая культура

Для промышленного культивирования штамма Bradyrhizobium japonicum 859 использовали питательную среду при рН=6,8±0,2 следующего состава (с возможным отклонением на ±5% от указанного количества), г/л: кукурузный экстракт - 7,0; меласса - 5,0; (NH) ₂SO₄ - 1,0; K₂HPO₄ - 0,35; KH₂PO₄ - 0,35; MgSO₄×7H ₂O - 0,2; СаСО₃ - 1,0, которую для обеспечения стерильности подвергли автоклавированию при температуре не менее 131°С в течение не менее 60 минут. Стерильность питательной среды проверяли путем высева стерильно взятой пробы из ферментера на стандартные готовые среды: питательный агар (производитель ООО «Биокомпас-С», Россия) или триптик соевый агар (TSA, производитель компания Сигма, США) и судили о ней по отсутствию бактериального роста в течение 48 часов при температуре 28±1°С. Приготовленную таким образом стерильную питательную среду в ферментере засевали маточной культурой штамма Bradyrhizobium japonicum 859 с титром бактерий (3-5)×10⁹ КОЕ/мл, причем объем посевного материала составлял 5-10% от объема засеваемой питательной среды и проводили культивирование в течение 72±3 часов при температуре 28±1°С и продувке стерильным воздухом из расчета: объем воздуха в минуту на объем питательной среды (с возможным отклонением от этого соотношения ±5%). Стерильность воздуха обеспечивали путем его продувки через установленный на входе ферментера бактериальный фильтр, например, марки Sartorius Stedim Biotech, производитель ЗАО «САРТОГОСМ». При этом перед осуществлением культивирования штамма Bradyrhizobium japonicum 859 проводили проверку степени стерильности подаваемого воздуха путем его продувки через этот бактериальный фильтр на входе ферментера в течение 24 часов с последующим высевом взятой стерильно из ферментера питательной среды на стандартные готовые среды: питательный агар (производитель ООО «Биокомпас-С», Россия) или триптик соевый агар (TSA, производитель компания Сигма, США) и судили о ней по отсутствию бактериального роста в течение 48 часов при температуре 28±1°С.

Полученную культуральную жидкость штамма Bradyrhizobium japonicum 859 микроскопировали и высевали на маннитно-дрожжевой агар (МДА) для подсчета численности клубеньковых бактерий и триптик-соевый агар (TSA) для подсчета численности посторонних микроорганизмов.

Так получали концентрат бактериальной суспензии удобрения на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 с титром не менее 10⁹ КОЕ/мл.

Жидкая форма удобрения БисолбиРиз на основе штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859

Микробиологическое удобрение в жидкой форме на основе штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 получали путем разведения концентрата бактериальной суспензии водой, причем использовали стерильную, дистиллированную воду, полученную, например, при помощи установки по тонкой химической, механической очистке и обеззараживанию воды Гейзер (производитель ЗАО «Эко Гейзер», Россия). Допустимую степень стерильности воды определяли путем ее высева на питательный агар и отсутствия на нем бактериального роста в течение 48 часов при температуре 28±1°С.

При этом для получения удобрения в стерильную воду добавляли следующие ингредиенты из расчета на 1 л воды (с возможным для ингредиентов отклонением на ±5% от указанного количества), г/л:

концентрат бактериальной суспензии	-100,0
K 2HPO4 (гидросульфат калия)	- 1,5
KH 2PO4 (гидроортофосфат калия)	- 1,5
MgSO 4·7H2O (гептогидрат сульфата калия)	- 1,5
лигногуматы (гуминовые удобрения)	- 2,0

Затем определяли и доводили рН полученного удобрения до уровня 6,8-7,2.

Полученное жидкое удобрение выдерживали в течение 3-5 дней при температуре 25-28°С до получения титра бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 в полученном удобрении не менее 10⁸ КОЕ/мл.

После этого жидкое микробиологическое удобрение на основе штамма бактерий Bradyrhizobium japonicum 859, которое заявителем названо БисолбиРиз, было готово для обработки сельскохозяйственных культур, а именно сои.

Строгий контроль и правильное ведение процесса приготовления жидкой формы предопределяют высокое качество удобрения БисолбиРиз и его соответствующую активность при обработке семян сои.

Проверка эффективности удобрения БисолбиРиз на основе штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859

Эффективность микробиологического удобрения БисолбиРиз, полученного на основе штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859, была проверена на производственных опытах в Ульяновской и Амурской областях.

Непосредственно перед посевом одну часть семян сои ничем не обрабатывали (контроль), другую часть семян обрабатывали жидкой формой удобрения Ризоторфин на основе штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 629^а, а последнюю часть обрабатывали удобрением, полученным описанным выше способом, из расчета 0,5 литра БисолбиРиз на гектарную норму семян сои.

Результаты опытов приведены в Таблицах 3 и 4.

Из данных, приведенных в таблицах 3 и 4, видно, что применение жидкого удобрения БисолбиРиз, полученного на основе штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859, повысило урожай сои по сравнению с контролем (без обработки удобрениями) в среднем на 17-30%, что является эффективнее, чем использование известного удобрения Ризоторфин на основе штамма-прототипа клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 629^а .

При этом из таблицы 4 следует, что при применении на Дальнем Востоке - в хозяйствах Амурской области - заявленный штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 859 наиболее эффективен в сравнении со штаммом клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum 629^а - прототипом.