способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (рбп)

Формула изобретения

Способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП), включающий выращивание штамма В. abortus на питательной среде при температуре 37-38°С трое суток, смыв культуры стерильным 0,5%-ным фенолизированным раствором, инактивацию бакмассы в водяной бане, проверку на стерильность, окрашивание микробных клеток бенгальской розовой, суспендирование микробной взвеси в буферном разбавителе, стандартизацию, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют твердые питательные среды для выращивания бруцелл, культивируют вакцинный штамм В. abortus 104M, инактивируют бакмассу при температуре (88±1)°С 30 мин, центрифугируют бактериальную взвесь при 6-7 тыс. об/мин 40 мин, осадок бруцелл ресуспендируют в 0,7%-ным водном растворе бенгальская розовая в соотношении 1:1 и окрашивают микробные клетки при температуре 4°С в течение 48 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве препаратов для диагностики бруцеллеза.

Известен способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) из вакцинного штамма В. abortus, который включает производственное культивирование возбудителя в глубинных условиях на жидкой питательной среде, концентрирование, ультрафильтрацию, инактивацию антигена [RU 2361610 C1, 20.03.2008], однако для осуществления этого способа необходимо дорогостоящее специальное оборудование, инактивацию бакмассы проводят при температуре 70°С, которая является недостаточной для обезвреживания бруцелл.

Наиболее близким по техническому решению является способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы, включающий выращивание штамма В.abortus 19 на печеночно-мартеновском агаре, инактивацию смытой бактериальной массы при температуре 80°С, суспендирование в буферном разбавителе с рН 3,65, титрацию дозы красителя, стандартизацию антигена [см., например, Ветеринарные препараты. Справочник. М., Колос. стр.185-187].

Способ не позволяет получить диагностикум с достаточной активностью, т.к. в антигенной структуре штамма В. abortus 19 допускается содержание R-форм бруцелл, в этой связи штамм склонен к диссоциации, в результате понижается активность, снижается выход конечного продукта из-за выбраковки отдельных партий диагностикума.

Слабая окрашиваемость клеток бруцелл по этому способу также снижает активность антигена, не позволяет эффективно диагностировать больных бруцеллезом животных с наличием специфических агглютининов в сыворотке крови.

Техническим результатом изобретения является повышение активности бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП).

Технический результат достигается тем, что способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) включает выращивание и смыв вакцинного штамма В. abortus, инактивацию бакмассы, проверку на стерильность, окрашивание микробных клеток бенгальской розовой, суспендирование микробной взвеси в буферном разбавителе, стандартизацию, при этом в качестве питательной среды используют твердые питательные среды для выращивания бруцелл, культивируют вакцинный штамм Brucella abortus 104M, инактивируют бакмассу при температуре 88±1°С 30 минут, центрифугируют бактериальную взвесь при 6-7 тыс об/мин 40 минут, осадок бруцелл ресуспендируют в 0,7% водном растворе бенгальская розовая в соотношении объемов 1:1, окрашивают микробные клетки при температуре 4°С в течение 48 часов.

Изобретение характеризуется применением вакцинного штамма В.abortus 104M (штамм находится во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве на базе ФГУ «ВГНКИ» Минсельхоза РФ, регистрационный номер БА 30, Бруцеллез сельскохозяйственных животных / И.А.Косилов и др. - Новосибирск, 1999. 183-190), находящегося в стабильной S-форме, обладающего широким спектром антигенных детерминант и высокими агглютинабильными свойствами, которые необходимы для получения диагностикума с высокой активностью и специфичностью. Штамм В. abortus 104M относится к типичной и стойкой S-форме бруцелл, не продуцирует сероводород, растет на средах с фуксином 1:50000, не имеет роста на средах с тионином 1:50000, агглютинируется сывороткой анти-abortus и не агглютинируется сывороткой анти-melitensis, а также R-бруцеллезными сыворотками, дает отрицательную реакцию с акрифлавином. Для осуществления способа не требуется дорогостоящего промышленного оборудования, т.к. бруцелл культивируют на плотных питательных средах в стеклянных матрацах, инактивацию микробной взвеси производят в водяной бане, осаждают бакмассу на центрифуге, окрашивание микробных клеток осуществляют в холодильнике.

Использование предлагаемого способа обеспечит получение активного, специфичного антигена для РБП, что повысит эффективность диагностики бруцеллеза животных.

Способ осуществляется следующим образом.

Бруцеллы вакцинного штамма В.abortus 104M выращивают трое суток, например, на картофельном агаре, смывают с питательной среды стерильным 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, инактивируют при температуре 88±1°С в течение 30 минут, устанавливают стерильность путем посева на среды, элективные для анаэробов, аэробов, грибов, наблюдение ведут в течение 10 суток. Микробную взвесь центрифугируют при 6-7 тыс об/мин 40 минут, осадок в равных объемах 1:1 ресуспендируют в стерильном 0,7% водном растворе бенгальская розовая и окрашивают 48 часов при температуре 4°С. После окрашивания бактериальную массу ресуспендируют в буферном растворе, имеющем рН 3,65±0,05, состоящим из едкого натрия, фенолизированного физиологического раствора, молочной кислоты, доводят концентрацию бруцелл до 100-110 млрд м.к. в 1 мл.

Стандартизуют антиген путем его титрации в РБП со стандартным образцом сыворотки против Brucella abortus. При этом антиген, изготовленный по предлагаемому способу, имеет четкую реакцию с оценкой 4 креста с сывороткой в разведении 1:10, содержащей 100 ME, 1-2 креста с сывороткой в разведении 1:20 (50 ME), отрицательную реакцию с сывороткой в разведении 1:35 (28,5 ME), т.е. соответствует стандартности. Изготовленный антиген проверяют на стерильность, активность, специфичность.

Результаты изучения агглютинабельных свойств вакцинных штаммов В. abortus 104M и В.abortus 19 представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 следует, что агглютинабельные свойства вакцинного штамма В.abortus 104M выше аналогичных свойств вакцинного штамма В. abortus 19.

Антиген из штамма В. abortus 104M агглютинировался обеими бруцеллезными сыворотками в разведении 1:2560 с оценкой 4 креста, тогда как антиген из штамма В abortus 19 агглютинировался с бруцеллезными гомологичными сыворотками с оценкой 4 креста в разведении 1:1280. Кроме того, характер агглютината отличался: у штамма В. abortus 104M он был более крупным в сравнении со штаммом В.abortus 19.

Результаты испытания активности и специфичности разных антигенов представлены в таблицах 2, 3.

Данные таблиц показывают, что предлагаемый способ позволяет получить антиген для роз-бенгал пробы, обладающий специфичностью, а также более высокой активностью в сравнении с аналогом.

Таким образом, изготовление бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы с использованием вакцинного штамма В. abortus 104M с высокими агглютинабельными свойствами и способа окрашивания микробных клеток бруцелл позволили получить диагностикум с высокой активностью и специфичностью.

Предлагаемый способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы отличается доступностью и может быть применен в условиях лабораторий и биопредприятий.

Таблица 1

Агглютинабельные свойства вакцинных штаммов В. abortus 19 и 104М в РА пробирочной

Антигены, 4 млрд взвесь

Бруцеллезные сыворотки

Физи- ологический раствор

S-агглютинирующая из «Набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл»

стандартная бруцеллезная сыворотка из «Набора компонентов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК и РДСК»

1:80

1:160

1:320

1:640

1:1280

1:1600

1:2560

1:3000

1:80

1:160

1:320

1:640

1:1280

1:1600

1:2560

1:3000

В. abortus 19

++++

++++

++++

++++

++++

+++

-

-

++++

++++

++++

++++

++++

+

-

-

-

В. abortus 104М

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

+

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

-

-

Таблица 2
Результаты сравнительного испытания активности антигенов в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах
Вид животных, эпизоотическая характеристика	Количество проб	Реагировали положительно
PA	РСК	РИД	РНГА	РБП биофаб	РБП аналог (ВГНКИ)	РБП ВНИИ БТЖ
крупный рогатый скот неблагополучных по бруцеллезу гуртов	594	25	42	18	55	39	40	48
овцы неблагополучных по бруцеллезу отар	92	37	55	45	66	59	58	65
Итого:	686	62	97	63	121	98	98	113
	9,0%	14,1%	9,2%	17,6%	14,3%	14,3%	16,5%

Таблица 3
Результаты испытания специфичности бруцеллезных антигенов для РБП, приготовленных различными способами
Вид животных, эпизоотическая характеристика	Количество проб	Результаты в реакциях
РА	РСК	РНГА	РБП с антигенами
биофаб	аналог (ВГНКИ)	ВНИИ БТЖ
крупный рогатый скот из благополучных по бруцеллезу стад	350	-	-	-	-	-	-
овцы из благополучных по бруцеллезу отар	423	-	-	-	-	-	-
здоровые свиньи	295	-	-	-	-	-	-
кролики, иммунизированные вакциной В. abortus 16/4 (R-форма)	16	-	-	-	-	-	-
бараны, инфицированные B. ovis (R-форма)	10	-	-	-	-	-	-
собаки, инфицированные B. canis (R-форма)	25	-	-	-	-	-	-
крупный рогатый скот, больной лейкозом	28	-	-	-	-	-	-
крупный рогатый скот, больной лептоспирозом	49	-	-	-	-	-	-