фармацевтическая композиция для терапии острых токсических состояний

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для терапии острых токсических состояний, содержащая белок - лактоферрин человека, отличающаяся тем, что дополнительно содержит нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гена лактоферрина человека и формулирующий буфер при следующем соотношении компонентов на дозу:

лактоферрин человека от 50 до 100 мг;

нереплицирующиеся наночастицы - 7·10¹¹ физических частиц;

формулирующий буфер - остальное, мл.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что доза препарата составляет 3 мл.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что лактоферрин человека - лактоферрин донорского женского молока.

4. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что лактоферрин человека - любой лактоферрин человека.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности нанотехнологии и токсикологии, и может быть использовано для профилактики и терапии токсических состояний различной этиологии, в том числе острых.

Известен способ лечения послеоперационных осложнений при помощи препаратов, содержащих белковые антиоксиданты (Патент РФ 2199337). В данном патенте лечение послеоперационных осложнений с явлениями полиорганной недостаточности осуществляют путем сочетанного введения в организм больного лекарственного препарата, содержащего лактоферрин человека, и лекарственного препарата, содержащего церулоплазмин человека, причем препараты, содержащие лактоферрин человека и церулоплазмин человека вводят системно ежедневно внутривенно капельно в изотоническом растворе глюкозы или хлорида натрия. Кроме того, препарат, содержащий церулоплазмин человека, вводят системно ежедневно внутривенно капельно, а раствором препарата, содержащего лактоферрин человека, ежедневно промывают гнойные раны, полости, и/или орошают дыхательные пути.

Лактоферрин - одноцепочечный металлсвязывающий протеин. Общеизвестно, что этот природный белок обладает рядом лечебных свойств, в том числе бактерицидной и бактериостатической активностью, принимает участие в регуляции клеточных и гуморальных иммунологических реакций, противовоспалительных и других процессов.

Недостатком является тот факт, что заявленный препарат хотя и действует сразу после введения, но только первые сутки, после чего выводится из организма, что является существенным недостатком при терапии, так как необходимо частое введение препарата для осуществления терапии

Известен антибактериальный, антиоксидантный, детоксицирующий, иммуномодулирующий и антиканцерогенный препарат по патенту РФ № 2165769, содержащий лактоферрин человека в качестве основного действующего вещества и фармацевтически приемлемые добавки, при этом препарат содержит в масс. процентах: лактоферрин человека - 10,0-90,0; фармацевтически приемлемые добавки - остальное. Заявленное лекарственное средство может быть выполнено в форме раствора для внутреннего введения, в форме раствора для внутриполостного или внутрипузырного введения, в форме раствора для перорального введения, в форме раствора для обработки раневых поверхностей, в форме глазных капель, в форме раствора для интраназального применения, в форме мази, в форме болюсов для перорального применения, в форме суппозиториев для ректального или интравагинального применения, в форме таблетки.

Данный патент выбран авторами за прототип.

Недостатком является также то, что заявленный препарат хотя и действует сразу после введения, но только первые сутки, после чего выводится из организма, что является существенным недостатком при терапии, так как необходимо частое введение препарата для осуществления терапии.

Общими недостатками указанных композиций и препаратов, а также способов лечения являются:

1) затруднения в достижении стойкого терапевтического эффекта при их применении из-за наличия в качестве активных компонентов выделенного и очищенного белка - лактоферрина, который при любых способах введения быстро выводится из организма больного;

2) для поддержания терапевтически эффективной концентрации в организме необходимость многократного введения фармацевтических композиций, содержащих лактоферрин;

3) затраты больших количеств препарата, медицинского инструментария и времени медицинского персонала для достижения требуемого результата лечения;

4) для композиций и препаратов, в состав которых входит лактоферрин, получаемый из женского молока, уникальность и дефицитность данного вида сырья серьезно ограничивает масштабирование производства и, соответственно, возможность его применения в требуемых количествах при медицинских показаниях.

Известен также рекомбинантный лактоферрин, получаемый в различных системах, в том числе вирусных векторах, несущих ген лактоферрина человека, который по своим физическим, биохимическим и биологическим свойствам сходен с нативным лактоферрином (Conzalez-Chavez S. А. et al., Lactoferrin: structure, function and applications, Int. J. of Antimicrobial Agents, 2009, № 33, с.301-308. - Лактоферрин-структура, функции и применение).

Известен эффективный способ лечения индуцированных опухолей молочной железы у мышей с помощью введения в ткани опухоли рекомбинантного аденовируса, несущего ген лактоферрина человека. Данная композиция имела пролонгированное действие и водилась один раз в две недели (Wang J. et al., Inhibition of tumor growth by recombinant adenovirus containing human lactoferrin through inducing tumor cell apoptosis in mice bearing emt6 breast cancer, Arch.Pharm.Res., 2011, № 34 (6), 987-995 - Торможение роста опухоли с помощью рекомбинантного аденовируса несущего ген лактоферрина человека путем апоптоза опухолевых клеток у мышей, страдающих от рака молочной железы ЕМТ6).

Недостатком такой композиции является следующее. Экспрессия целевого белка лактоферрина с помощью аденовекторной конструкции в организме начинается не с момента введения, а только через несколько часов, что является существенным недостатком в отношении лечения острых токсических явлений, хотя наработка лактоферрина продолжается после однократного введения длительное время, что дает преимущества при лечении хронических токсикозов, но не может быть использовано для лечения острых токсических явлений.

Техническая задача заявляемого изобретения направлена на создание фармацевтической композиции с быстро наступающим и пролонгированным антитоксическим действием на основе наноструктуры, продуцирующей непосредственно в организме лактоферрин человека, и пригодной для лечения острых токсических состояний различного генеза.

Указанная задача решается за счет того, что фармацевтическая композиция для терапии острых токсических состояний, содержащая белок - лактоферрин человека дополнительно содержит нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гена лактоферрина человека, и формулирующий буфер. При этом доза препарата составляет 3 мл. Доза препарата заявляемой фармацевтической композиции содержит:

лактоферрин человека от 50 до 100 мг;

нереплицирующиеся наночастицы - 7×10¹¹ физических частиц;

формулирующий буфер - остальное, мл.

При этом в качестве лактоферрина человека используют лактоферрин донорского женского молока либо любой лактоферрин человека

Раскрытие изобретения

Техническое решение реализовано в заявке за счет того, что использовано сочетание свойств препаратов нативного человеческого лактоферрина, получаемого из донорского женского молока, и лактоферрина человека, экспрессируемого нереплицирующимися наночастицами на основе генома аденовируса 5-го серотипа, со вставкой экзогенной ДНК, включающей ген, кодирующий белок - человеческий лактоферрин в одной фармацевтичекой композиции, что позволяет осуществлять терапию острых токсических состояний различной этиологии при однократном введении композиции. Композиция также содержит формулирующий буфер в качестве фармацевтически приемлемой добавки. Именно это обеспечивает эффективную работу лактоферрина практически с момента введения и пролонгирует его терапевтическую концентрацию 28-30 дней без осуществления дополнительных инъекций.

Технические, лечебные и экономические результаты при осуществлении заявляемого изобретения достигаются за счет того, что так же, как в известном препарате на основе лактоферрина человека, выделенного из женского молока, основным терапевтическим агентом является лактоферрин человека, уровень которого в организме сразу после введения фармацевтической композиции по изобретению обеспечивается нативным лактферрином, а затем продуцируемым нереплицирующимися наночастицами рекомбинантным лактоферрином.

Фармацевтическая композиция по изобретению выполнена как лекарственная форма в виде

лактоферрина человека от 50 до 100 мг;

нереплицирующиеся наночастицы - 7×10¹¹ физических частиц;

формулирующий буфер - остальное, мл.

и используется в качестве раствора для внутривенного введения.

Фармацевтическая композиция является исходным продуктом для приготовления различных лекарственных форм, применение которых определяется в зависимости от этиопатогенеза токсикоза. Заявляемая фармацевтическая композиция на основе нативного лактоферрина человека и нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена, кодирующего лактоферрин человека, прошла доклинические и клинические испытания по изучению специфической (терапевтической) эффективности и общетоксического действия, которые показали безвредность данной композиции и терапевтическую активность в качестве детоксицирующего вещества при различных токсических состояниях, особенно острых токсикозах, что иллюстрируется следующими примерами.

В нижеприведенных примерах представлено:

- конструирование нереплицирующихся наночастиц и наращивание их в необходимом количестве;

- создание фармацевтической композиции;

- подтверждение наличия быстрого появления лактоферрина в крови и пролонгированного действия фармацевтической композиции;

- доказательство антитоксического действия созданной по заявленному изобретению фармацевтической композиции.

Пример 1

Конструирование нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа со вставкой гена лактоферрина человека.

Для конструирования нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа (размером 70-80 нм) со вставкой гена лактоферрина человека за основу была взята рекомбинантная плазмида pJM17 (Мс Grory W.J., А simple technique for the rescue of early region I mutations into infectious human adenovirus type 5, Virology, № 163 (2), 1988, с.614. - Простая техника для удаления раннего региона 1 в инфекционном аденовирусе человека 5 типа), с делецией в области Е1 аденовирусного генома. Все дальнейшие манипуляции по клонированию проводили с использованием общеизвестных лабораторных методик (например, Сэмбрук Д. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984, стр.205-224, 387-420). Клонирование осуществляли методом гомологичной рекомбинации в клеточной культуре и суть его заключалась в следующем. Искусственно синтезированный кДНК гена лактоферрина человека по выбранным сайтам рестрикции переклонировали в общеизвестную шаттл-плазмиду pRCCMV (Invitrogen, San Diego, CA, № V75020). Далее для взаимной трансформации полученной плазмиды pRcCMV - Lf и векторной плазмиды pJM17 ими трансфецировали клетки 293 (например, CLS, Germany, № 300192) с помощью метода кальциево-фосфатной преципитации (Graham F.L. et al., A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA, Virology, 1973, № 52 (2), с.456-467. - Новая техника метода заражения ДНК аденовируса человека 5 серотипа). В результате получили нереплицирующиеся наночастицы, содержащие экспрессирующую кассету с CMV-промотором, геном лактоферрина человека и сигналом полиаденилирования. Бляшки рекомбинантной частицы образовывались на культуре клеток через несколько дней после трансфекции, их отбирали пастеровской пипеткой, полученный материал размножали на клетках линии 293 до получения титра 3×10¹⁰ ф.ч. (физических частиц)/мл (10 ⁸ ЕД/мл).

Заданное содержание нереплицирующихся наночастиц и нативного лактоферрина в составе фармацевтической композиции определено по фармакокинетике и антитоксическому эффекту в примерах 4 и 5.

Для получения такой фармацевтической композиции клеточную суспензию, наработанную на предыдущем этапе, содержащую нереплицирующиеся наночастицы в титре 3×10 ¹⁰ частиц/мл, использовали для дальнейшего наращивания титров нереплицирующихся наночастиц и приготовления готовой фармацевтической композиции с содержанием не менее 2,33×10¹¹ ф.ч./мл (что соответствует активности не менее 6,7×10⁸ ЕД/мл) и 50-100 мкг нативного лактоферрина (например, указанного в патенте РФ № 2165769) в 3 мл композиции.

Таким образом, далее для наработки необходимых титров нереплицирующихся наночастиц волновой биореактор с 4500 мл суспензии пермиссивной клеточной культуры 293 засевали клеточной суспензией объемом 500 мл, содержащей нереплицирующиеся наночастицы с титром 3×10¹⁰ ф.ч./мл.

Культивировали для наращивания нереплицирующихся наночастиц внутри клеток и достижения их содержания 6×10 ¹⁰ ф.ч./мл (активность 2×10⁸ ЕД/мл), ориентировочно в течение 48 часов. По достижении необходимого содержания наночастиц клеточную массу подавали на очистку, которая состояла из нескольких стадий:

1) Проводили осаждение клеточной массы центрифугированием. Поступающая на очистку суспензия имела не менее 10¹⁴ ф.ч. на 5 л (оценивали при помощи масс-спектрометра, 1 ОЕ (оптическая единица = 10¹² ф.ч.). Центрифугирование проводили при режиме 6000g в течение 15 мин, при этом жидкий надосадок сливали, а оставшуюся твердую часть, содержащую клетки и нереплицирующиеся наночастицы подавали на дальнейшие стадии очистки.

2) Извлечение нереплицирующихся наночастиц из клеточной культуры проводили путем разрушения клеток четырехкратным перемораживанием-оттаиванием. Готовили буферный раствор с рН 8.0: 5 mМТрисНСl, 0.075 MNaCl, 1 mMMgCl₂, 5% сахароза, 1% полисорбат 80. Полученный в предыдущую стадию осадок ресуспендировали в 70 мл буфера (коэффициент содержания ×71). Объем раствора составлял 80 мл.

Замораживание проводили в течение 2 часов в жидком азоте, размораживали на водяной бане (при +37°С), не допуская перегрева.

3) Для облегчения дальнейшего удаления геномной клеточной ДНК проводили дополнительную обработку нуклеазой. Для этого добавляли бензоназу до концентрации в растворе 150 U/мл и ставили на мягкое перемешивание с помощью магнитной мешалки на 3 часа при комнатной температуре (21-23°С).

4) Отделение нереплицирующихся наночастиц от разрушенных клеток осуществляли центрифугированием при 9000 g 10 мин. Отбирали супернатант, содержащий нереплицирующиеся наночастицы.

5) Дальнейшую очистку проводили ультрафильтрацией. Для этого полученный супернатант разводили буфером (50 mM TrisHCl рН 7.5, 1М NaCl, 2 mM MgCl₂, 5% сахароза, рН 7,5) до объема не менее 200 мл, перемешиваем с помощью магнитной мешалки. В процессе фильтрации объем циркулирующего раствора (ретентата) постоянно доводили до исходного (200 мл).

6) Далее очистку производили путем анион-обменной хроматографии.

Ретентат наносили на колонку (AxiChrom 70/300 объемом 400 мл), содержащую анионнообменный сорбент Q Sepharose virus licenced. Нереплицирующиеся наночастицы при этом сорбирались на колонке, в то время как примеси не сорбирались, а вымывались буфером А. После удаления примесей нереплицирующиеся наночастицы десорбировали промывкой буфером Б. Условия хроматографирования: поток 193 мл/мин, буфер А (40 mM TrisHCl, 0,27 М NaCl, 2 mM MgCl₂, 5% Сахароза, 0,1% Полисорбат 80, рН 7.5), проводимость ~ 28-30 mS/cm; буфер Б (40 mM TrisHCl, 0.5М NaCl, 2 mM MgCl₂, 5% сахароза, 0.1% полисорбат 80, рН 7.5) проводимость ~50 mS/cm. Элюат в объеме 200 мл отправляли на следующую стадию.

7) Эксклюзионная хроматогафия

Поученный в предыдущей стадии элюат наносили на колонку (AxiChrom 100/300 объемом 800 мл), содержащую сорбент Q Sepharose 4 FastFlow. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры сорбента, элюировали первым пиком (к ним относятся нереплицирующиеся наночастицы), примеси элюировали после выхода пика нереплицирующихся наночастиц. Условия хроматографирования: поток 130 мл/мин, буфер (10 mMTrisHCl, 75 мMNaCl, 1 mMMgCl ₂,5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, рН 8.0).

К полученномуй элюату (80 мл) добавляли этанол до концентрации 0,5% и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до концентрации 100 мкМ, отправляли на следующую стадию.

8) Нормальная фильтрация.

Для стерилизации полученного препарата проводили фильтрование через систему фильтров с размером пор 22 мкМ. Конечный объем препарата на данной стадии составлял 80 мл и содержал нереплицирующиеся наночастицы в титре 1×10 ¹² ф.ч./мл. Его разбавляли формулирующим буфером (например, 10 mMTrisHCl, 75 mMNaCl, 1 mMMgCl₂, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, 0,5% Этанол, 100 мкм ЭДТА, рН 8.0) до получения содержания 2,33×10¹¹ ф.ч./мл и стерилизовали нормальной фильтрацией.

Пример 2. Получение фармацевтической композиции.

Для получения окончательного состава заявленной фармацевтической композиции, полученный в предыдущей стадии препарат смешивали с концентратом нативного лактоферрина человека из женского молока (Патент РФ № 2165769), находящегося в буфере, применявшемся для формулирования препарата из нереплицирующихся наночастиц в предыдущую стадию (например, 10 мМ Tris, 75 мМ Хлорид натрия, 5% сахароза, 0,05% Твин-80, 1 мМ Магния хлорид, 0,5% Этанол, 100 мкм ЭДТА, рН 8.0). Смешиваемые объемы раствора нереплицирующихся наночастиц и концентрата лактоферрина были таковыми, что в результатае получили заданное содержание нереплицирующихся наночастиц 2,33×10¹¹ ф.ч./мл (что соответствует активности препарата в 6,7×10 ⁸ ЕД/мл) и от 50 мг до 100 мг нативного лактоферрина в 3 мл композиции.

Пример 3.

Стабильность состава фармацевтической композиции.

Полученную в примере 2 фармацевтическую композицию оценили на стабильность состава.

Для этого проводили визуальную оценку при пристальном наблюдении за образцами препарата в течение 3-х минут. Результаты визуальной оценки показали хорошую смешиваемость компонентов препарата и отсутствие образования сгустков.

В таблице 1. Представлено влияние компонентов фармацевтической композиции на стабильность нереплицирующихся наночастиц. Оценку производили после экспозиции фармацевтической композиции в течение 0, 30 и 60 минут с дальнейшей оценкой титров нереплицирующихся наночастиц по стандартной методике.

Таблица 1
Фармацевтическая композиция или контрольное вещество	Время экспозиции, мин
0	30	60
титры, ф.ч./мл
Фармацевтическая композиция	3×108	3×108	3×108
Культуральная среда (контрольное вещество)	3×108	3×108	3×108

Данные таблицы 1 показывают сохранение титров нереплицирующихся наночастиц при экспозиции состава фармацевтической композиции от 0 минут до 1 часа, что соответствует их сохранности в контрольном веществе.

Таким образом, полученные результаты показывают стабильность полученной фармацевтической композиции.

Пример 4

Подбор доз нативного лактоферрина человека и нереплицирующихся наночастиц, экспрессирующих лактоферрин человека.

Возможность применения фармацевтической композиции для лечения острых токсических состояний оценивали по его фармакокинетике при введении препарата лабораторным животным (крысам) внутривенно в объеме, содержащем дозу нереплицирующихся наночастиц экспрессирующих лактоферрин человека равную 4,3×10 ¹¹ ф.ч./м² и дозу нативного лактоферрина равную 10 мг/кг.

Оценку проводили по наличию и выведению целевого белка - лактоферрина человека в органах. На рисунке представлена фармакокинетическая кривая, представляющая концентрацию лактоферрина человека в сыворотке крови мышей.

На рисунке 1 представлена фармакокинетическая кривая, характеризующая концентрацию лактоферрина человека в сыворотке крови крыс после однократного внутривенного введения фармацевтической композиции в дозе нереплицирующихся наночастиц 4,3×10¹¹ ф.ч./м² и нативного лактоферрина 10 мг/кг.

Анализ изображенных на рисунке данных показал, что концентрация лактоферрина увеличивается двумя пиками. Первый подъем начинается с момента введения фармацевтической композиции, достигает пика через 17 минут при максимальной концентрации C_max=140 мкг/мл и затем начинает падать, вплоть до 12-го часа после введения (данный отрезок кривой отражает динамику нативного лактоферрина композиции). Однако падения концентрации лактоферрина в сыворотке крови до 0 не происходит, так как начиная с 12-го часа после введения композиции наблюдается второй подъем, обусловленный началом наработки рекомбинантного лактоферрина нереплицирующимися наночастицами с пиком на 6,8 сутки и C_max=364 мкг/мл. Далее происходит постепенное падение концентрации и лактоферрин полностью исчезает в крови к 30 дню.

Таким образом, концентрация лактоферрина человека после однократного внутривенного введения в сыворотке крови подопытных крыс непрерывна с момента введения и до 28-30 суток с двумя пиками подъема концентрации лактоферрина.

При раздельном однократном введении нативного лактоферрина в терапевтической дозе 10 мг/кг и препарата с наночастицами в формулирующем буфере в дозе 4,3×10 ¹³ ф.ч./м², как препаратов сравнения, выяснили что первый пик кривой обусловлен нативным лактоферрином, который исчезает к концу первых суток после введения, второй пик соответствует времени экспрессии рекомбинанатного лакоферрина нереплицирующимися наночастицами, которая начинается только с 12 часа после введения и продолжается вплоть до 28-30 суток. Т.е. совместное содержание двух данных препаратов в фармацевтической композиции позволяет поддерживать концентрацию лактоферрина человека в крови начиная с 17 минуты после введения без значимого для дезинтоксикационной терапии падения концентрации лактоферрина человека.

Таким образом, оценка фармакокинетической кривой позволяет рекомендовать фармацевтическую композицию для лечения не только хронических, но и острых токсических состояний, так как терапевтичческое действие, основанное на детоксицирующих свойствах лактоферрина человека начинается с 17 минут после введения и продолжается 28-30 суток.

Пример 5.

Оценка детоксицирующего действия фармацевтической композиции.

Изучали на модели токсикоза у животных, индуцированного четыреххлористым углеродом (CCL₄).

Токсикоз, который возникает при введении CCl₄ в организм млекопитающего, обусловлен следующими процессами: ССЦ подвергается метаболическому превращению в мембранах эндоплазматического ретикулума печени при участии фермента цитохрома Р-450, что приводит к образованию свободнорадикальных метаболитов (типа CCl₃), образующихся в результате разрыва молекул CCl₄. В результате усиления перекисного окисления липидных комплексов внутриклеточных мембран нарушается активность ферментов, ряд функций клетки (синтез белков, обмен -липопротеидов, метаболизм лекарств), возникает деструкция нуклеотидов и т.д. Предполагают, что основным местом образования свободнорадикальных метаболитов являются эндоплазматическая сеть и микросомы клетки, что приводит к снижению активности и деградации цитохрома Р-450- ключевого фермента системы микросомального окисления. Вследствии этого снижается скорость метаболизма эндогенных и экзогенных соединений и ослабляется антитоксическая функция печени. Оценку детоксицирующей функции печени проводили в тиопенталовом тесте, который позволяет по продолжительности наркотического сна животных оценить скорость метаболизма тиопентала, осуществляемого цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системой гепатоцитов.

Животным вводили 75%-ный масляный раствор CCl ₄ подкожно (п/к) однократно в дозе 2 мл/кг. Одновременно подопытным мышам вводили фармацевтическую композицию однократно внутривенно в дозе 4,3×10¹¹ ф.ч./м² и 10 мг/кг нативного лактоферрина человека. Контрольным группам однократно внутривенно вводили препарат, содержащий только наночастицы экспрессирующие лактоферрина человека в дозе 4,3×10 ¹¹ ф.ч./м² или 0,9% хлористый натрий. Тиопентал вводили на 6-е сутки после введения CCl₄ внутрибрюшинно (в/б) однократно в дозе 55 мг/кг и регистрировали продолжительность сна экспериментальных животных, как критерий оценки степени токсического поражения печени.

На рисунке 2 представлены данные по продолжительности тиопенталового сна у животных, затравленных CCl₄. Столбики обозначают продолжительность сна у групп животных, которым вводили:

1 - CCl₄ ;

2 - 0,9% раствором хлористого натрия;

3 - нативный лактоферрин человека;

4 - препарат, содержащий только нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гена лактоферрина;

5 - фармацевтическая композиция.

Из представленных на рисунке данных видно, что введение CCl₄ вызывает увеличение продолжительности сна животных по сравнению с продолжительностью сна у контрольных животных, получавших физ. раствор (41±15 мин и 5±2 мин, соответственно), что свидетельствует о снижении скорости метаболизма тиопентала в печени и, соответственно, об ослаблении антитоксической функции печени.

Соответственно, представленные результаты свидетельствуют о том, что продолжительность тиопенталового сна в опытной группе (20±6 мин), была значительно меньше по сравнению с контрольной группой мышей (41±15 мин), обработанных CCl₄, но не получивших фармацевтическую композицию, что означает наличие детоксицирующих свойств у заявленной фармацевтической композиции. Кроме того, сон у животных, получивших только нативный лактоферрин человека или только препарат, содержащий нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гена лактоферрина сокращался по сравнению с группой CCl₄ до 23±8 мин, но при этом был чуть дольше в сравнении с опытной группой, что означает наличие лучших детоксицирующих свойств у заявленной композиции.

Таким образом, однократное внутривенное введение фармацевтической композиции в период наступления острой стадии токсикоза, вызванного введением CCl₄ оказывает значительное детоксицирую шее действие на организм, которое сильнее, чем при раздельном введении в сравнимых количествах препаратов нативного лактоферрина и нереплицирующихся наночастиц экспрессирующих лактоферрин.

Далее, в клинических примерах дозы, полученные во время доклинических исследований и измеряемые на м² поверхности тела, были переведены на человека, т.к. являются эквивалентными (средняя площадь поверхности тела человека равна 1,62 м²). (Хабриев Р.У., Руководство по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ, 2000, с.98), (Guidance for Industry. Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Pharmacology and Toxicology, США, 2005, с.7, 19. - Руководство для промышленности. Оценка максимальной безопасной стартовой дозы в начальных клинических испытаниях для терапии у взрослых здоровых добровольцев).

Пример 6

Больной П. Поступил с клинической картиной острого токсического гастроэнтерита. Основные симптомы - слюнотечение, рвота, диарея, схваткообразные боли в животе в течение нескольких часов. Было осуществлено промывание желудка, введение диуретика и внутривенное вливание солевого раствора, лечение было дополнено введением заявленной фармацевтической композиции однократно внутривенно в объеме 3 мл, что соответствует введению нереплицирующихся наночастиц экспрессирующих лактоферрин равному в дозе 7×10¹¹ ф.ч. и нативному лактоферрину в дозе 50 мг на человека. В течение часа после оказания неотложной помощи прошло слюнотечение и рвота, ослабились боли и диарея. Состояние больного улучшилось. К концу первых суток после оказания помощи клинические симптомы полностью прошли, токсикоз был купирован.

Пример 7.

Больной В. Острое отравление этиловым спиртом. Основные клинические симптомы - холодная липкая кожа, гиперемия лица и конъюнктивы, снижение температуры тела, рвота, непроизвольное выделение мочи и кала, зрачки сужены, а при нарастании расстройств дыхания расширяются, дыхание замедленное, пульс частый, слабый. На фоне стандартной инфузионной терапии проводилось снятие токсического шока введением 3 мл заявленной фармацевтической композиции однократно внутривенно в объеме 3 мл, что соответствует введению нереплицирующихся наночастиц экспрессирующих лактоферрин равному в дозе 7×10¹¹ ф.ч. и нативному лактоферрину в дозе 100 мг на человека. Состояние больного после осуществления противотоксической терапии стало значительно улучшаться, дыхание и пульс восстановились, поверхность кожи и слизистых, а также зрачки. К концу первых суток лечения клинические симптомы полностью исчезли, общее состояние больного значительно улучшилось.

Пример 8.

Больной С. Диагноз: рак ободочной кишки, состояние после хирургического и химиотерапевтического лечения. В послеоперационном периоде у больного развился токсический гепатит. После введения 3 мл заявленной фармацевтической композиции однократно внутривенно в объеме 3 мл, что соответствует введению наночастиц экспрессирующих лактоферрин равному в дозе 7×10¹¹ ф.ч. и нативного лактоферрина в дозе 50 мг на человека. Выявлено: снижение уровня общего и прямого билирубина в сыворотке крови 105/80 мкмоль/л 8,4/3,9 мкмоль/л. Токсический гепатит купирован.

Использование в фармацевтической и клинической практике заявляемой фармацевтической композиции позволяет достичь нескольких технических, лечебных и экономических результатов:

- заявляемая фармацевтическая композиция биосовместима с организмом человека и терапевтически высокоэффективна;

- фармацевтическая композиция удобна для применения, так как вводится однократно и затем, начиная с 17-й минуты после введения, и в течение в течение 28-30 дней длительно продуцирует в организме человека лактоферрин человека, создавая в крови концентрацию, в десятки раз превышающую нормальный уровень, и требуемую для достижения стойкого терапевтического эффекта;

- применение фармацевтической композиции экономически оправдано, поскольку однократное введение лекарственного средства обеспечивает быстрый и пролонгированный лечебный эффект;

- снижение трудовых затрат медицинского персонала, медицинского инструментария, и соответственно трудоемкости и стоимости лечения, так как нативный лактоферрин требует частого введения, это устраняется путем введения в состав нереплицирующихся наночастиц, которые вырабатывают большие количества лактоферрина прямо в организме человека после одного введения;

- снижение потребности в нативном лактоферрине, так как донорское женское молоко является дефицитным.

Приведенные примеры показывают, что получена фармацевтическая композиция, позволяющая после однократного внутривенного введения получать эффективное антитоксическое действие начиная с 17-й минуты после ее введения, заканчивая 28-30 днями после введения, что позволяет осуществлять терапию различных токсических состояний, в частности острых. Таким образом, поставленная техническая задача выполнена.