способ получения днк из молок лососевых рыб
Классы МПК: | C12P19/34 полинуклеотиды, например нуклеиновые кислоты, олигорибонуклеотиды C07H21/04 с дезоксирибозилом в качестве сахаридного радикала |
Автор(ы): | Албулов Алексей Иванович (RU), Фролова Марина Алексеевна (RU), Самуйленко Анатолий Яковлевич (RU), Васильченко Ольга Михайловна (RU), Шинкарев Сергей Михайлович (RU), Гринь Андрей Владимирович (RU), Рогов Роман Васильевич (RU), Немцев Дмитрий Сергеевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-01-20 публикация патента:
27.07.2013 |
Изобретение относится к области биохимии. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выделяют из молок лососевых рыб. Размораживают и измельчают используемое сырье. Обрабатывают его водным раствором трипсина в течение 3 ч при 45°С при содержании компонентов (масс.%): молоки лососевых рыб - 40,0, трипсин - 0,02-0,22, вода - остальное. Центрифугируют полученный гидролизат и фильтруют его через бельтинг-ткань. Проводят лиофильное или распылительное высушивание. Выход готовой продукции из молок лососевых рыб составляет 10,0-18,0% от количества исходного сырья при содержании ДНК в целевом продукте не менее 62-65%. Изобретение позволяет увеличить выход получаемой ДНК в 2,2-2,4 раза. 1 табл., 5 пр.
Формула изобретения
Способ получения ДНК из молок лососевых рыб, включающий размораживание, измельчение используемого сырья, обработку его водным раствором трипсина с последующим центрифугированием полученного гидролизата, фильтрацией через бельтинг-ткань, лиофильным или распылительным высушиванием, при этом обработку водным раствором трипсина проводят в течение 3 ч при 45°С при содержании компонентов, мас.%: молоки лососевых рыб 40,0, трипсин 0,02-0,22, вода остальное.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к технологии получения биологически активных веществ и может быть использовано в биотехнологии, а полученный продукт - в пищевой промышленности в качестве сырья при производстве биологически активных добавок к пище и специализированных пищевых продуктов, в парфюмерно-косметической промышленности в качестве биологически активной добавки в составе кремов, масок, лосьонов и других косметических средств, в научно-исследовательской практике.
Известен способ получения порошка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок рыб (1), предусматривающий гомогенизацию молок рыб, отделение осадка, обработку детергентом и концентрированным солевым раствором, воздействие ультразвуком с использованием при этом типового озвучивающего оборудования и условий, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой от 0,6×105 до 1,5×105 Да, отделение белка и детергента либо фильтрованием через кизельгур и последующей тонкой фильтрацией, либо микрофильтрацией через фильтры с диаметром пор от 0,4 до 1,2 мкм, концентрирование фильтрата на ультрафильтрационном модуле при давлении 0,1-0,8 атм, его диафильтрацию и повторную обработку ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с молекулярной массой от 2,5×105 до 6,0×10 5 Да, осаждение ДНК из раствора этиловым спиртом и высушивание осадка до постоянного веса.
Описан также способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот (2), включающий адсорбцию дезоксирибонуклеиновых кислот на силикатном сорбенте в присутствии хаотропного агента, отделение и промывку сорбента с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента.
Известен способ получения нуклеопротеинового комплекса (3) который включает измельчение рыбных молок, обработку его 7-10%-ным раствором хлорида натрия в течение 2,5-3,5 часов при температуре кипения, отделение экстракта ДНК от плотной части, ультрафильтрацию с концентрированием экстракта до содержания сухих веществ 1,8-3%, сушку препарата, обработку его этанолом при 40-50°С, сушку на воздухе. Выход ДНК составляет 4,5-6,0%, содержание ДНК в препарате - не менее 65%.
Известен способ выделения натриевой соли ДНК из тканей животного происхождения (4). Способ включает измельчение и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе (ССЦ), трехкратную промывку ядерного материала ССЦ. Затем отмытый ядерный материал помещают в реактор с ССЦ и 6% раствором додецилсульфата натрия в 45% этиловом спирте, нагревают до 60°С, добавляют равный объем 5М хлористого натрия, перемешивают, охлаждают до 12-16°С, обрабатывают реакционную массу ультразвуком, отделяют раствор ДНК от осадка балластных веществ фильтрацией реакционной массы через кизельгур на нутч-фильтре; концентрируют фильтрат на мембране с размером пор 0,45 мкм (потери ДНК при этом 3%), отмывают концентрат диафильтрацией на этой же мембране до отрицательной реакции на белок в пермеате.
Основным недостатком известных способов является то, что они предполагают использование этанола, являющегося социально опасным продуктом, требуют использования оборудования, в пожаро- и взрывобезопасном исполнении, а также наличия лицензии у производителя, на осуществление работ с применением этанола.
В качестве прототипа выбран способ производства натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из животного сырья и установка для его осуществления (5), включающий измельчение животного сырья (молоки осетровых рыб, селезенка, эритроциты цыпленка и т.д.) и гомогенизацию в цитратно-солевом растворе, обработку гомогената детергентом и концентрированным раствором хлористого натрия при повышенной температуре, обработку реакционной смеси после предварительного формирования из нее слоя определенной толщины в течение 10-80 минут ультразвуком с частотой 8-35 кГц и интенсивностью 0,2-2,0 Вт/см2, смешивание «озвученной» массы с кизельгуром в соотношении соответственно 5:1-25:1 (объем/масс), отделение жидкой фазы фильтрованием и концентрирование барофильтрацией, осаждение Na-соли ДНК из концентрата этиловым спиртом, высушивание осадка при 20-60°С. Масштабирование процесса осуществляется благодаря созданию и использованию новой промышленной установки.
Недостатком известного способа является трудоемкость и продолжительность технологического процесса выделения ДНК, наличие двух этапов обработки ультразвуком в вертикальной герметичной ячейке при непрерывном прокачивании раствора перистальтическим насосом, что приводит к значительному снижению производительности процесса и усложнению его масштабирования, а также использование больших количеств необходимых реагентов, в том числе этилового спирта.
Целью заявленного изобретения является разработка способа получения ДНК из молок лососевых рыб, отличающегося увеличением выхода готовой продукции с более высоким содержанием ДНК, снижению стоимости продукта за счет уменьшения количества стадий технологического процесса и возможности его масштабирования за счет использования типового промышленного оборудования.
Для осуществления поставленной задачи производили размораживание сырья из молок лососевых рыб, его измельчение, гидролиз протеолитическим ферментом трипсином, отделение балластных белков и липидов методом центрифугирования, фильтрацию полученной смеси через бельтинг-ткань, лиофилизацию или распылительное высушивание раствора ДНК.
Полученный продукт характеризуется следующими показателями:
внешний вид - аморфный порошок;
цвет - от белого до светло-коричневого;
запах - свойственный данному продукту с рыбным оттенком;
массовая доля влаги, не более - 8%;
массовая доля основного вещества (ДНК), не менее - 65%.
Идентификацию состава получаемого готового продукта и содержание в нем ДНК определяли спектрофотометрическим методом.
Способ осуществляют следующим образом:
Пример 1. Получение ДНК при оптимальном соотношении исходного сырья и трипсина.
40 кг дефростированных молок лососевых рыб измельчают на коллоидной мельнице, обрабатывают водным раствором ферментного препарата трипсина при следующем соотношении компонентов (масс.%): молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,88:0,12 в течение 3 часов при 45°С.
Водородный показатель рН полученной реакционной смеси (измельченные молоки лососевых рыб и вода) соответствовал оптимуму действия трипсина (рН 8-9)
Полученный гидролизат, для удаления балластных белков и липидов, центрифугируют на проточной центрифуге (15000об./мин.), фильтруют через бельтинг-ткань и подвергают лиофильной или распылительной сушке.
Выход готовой продукции составляет 16,0-18,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 65%.
Пример 2. Получение ДНК при минимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с минимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,96:0,04.
Выход готовой продукции составляет 14,0-16,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 64,0%.
Пример 3. Получение ДНК при максимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с максимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,8:0,2.
Выход готовой продукции составляет 17,0-18,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 65,0%.
Пример 4. Получение ДНК при нижеминимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с нижеминимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,98:0,02.
Выход готовой продукции составляет 10,0-14,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 62,0%.
Пример 5. Получение ДНК при вышемаксимальном количественном соотношении исходного сырья и трипсина осуществляется аналогично примеру 1, только с вышемаксимальным количественным соотношением компонентов, а именно молоки лососевых рыб: вода: трипсин, как 40:59,78:0,22.
Выход готовой продукции составляет 17,0-18,0% от количества используемого сырья, при содержании ДНК в готовой продукции не менее 65,0%.
Сравнительные данные по выходу готовой продукции и содержанию в ней основного вещества (ДНК) в зависимости от соотношения компонентов реакционной смеси (молоки лососевых рыб: вода: трипсин) приведены в таблице.
Номер примера | Соотношение компонентов реакционной смеси (молоки лососевых рыб: вода: трипсин) | Выход готовой продукции, %, не менее | Содержание ДНК в готовой продукции, %, не менее |
1. | 40:59,88:0,12 | 16,0-18,0 | 65,0 |
2. | 40:59,96:0,04 | 14,0-16,0 | 64,0 |
3. | 40:59,8:0,20 | 17,0-18,0 | 65,0 |
4. | 40:59,98:0,02 | 10,0-14,0 | 62,0 |
5. | 40:59,78:0,22 | 17,0-18,0 | 65,0 |
Таким образом, увеличение добавления фермента трипсина свыше 0,22 масс.% не приводит к увеличению выхода готовой продукции и содержанию в ней основного вещества и, следовательно, экономически нецелесообразно.
Источники информации, приятные во внимание при экспертизе.
1. Патент RU № 2041885 С1, C07H 21/04, C12N 15/10, 20.08.1995
2. Патент RU № 2232768 С2, C07H 21/04, 20.07.2004
3. Патент RU № 2122856 С1, A61K 35/60, 10.12.1998
4. Патент RU № 2017496, A61K 35/60, C07H 21/04, 15.08.1998
5. Патент RU № 2005724 C1, C07H 21/04, C12P 19/34, C12M 3/00,
15.01.1994 (прототип)
Класс C12P19/34 полинуклеотиды, например нуклеиновые кислоты, олигорибонуклеотиды
Класс C07H21/04 с дезоксирибозилом в качестве сахаридного радикала