применение матриксной металлопротеиназы-10 (ммр-10) для тромболитической терапии

Формула изобретения

1. Применение матриксной металлопротеиназы-10 ММР-10 для приготовления лекарственного средства, пригодного для тромболитической терапии.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что упомянутое лекарственное средство содержит также активатор плазминогена.

3. Применение по п.2, отличающееся тем, что активатор плазминогена выбирают из тканевого активатора плазминогена tPA, урокиназного активатора uPA и производного или фрагмента указанных активаторов плазминогена, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

4. Применение по п.3, отличающееся тем, что активатор плазминогена выбирают из tPA и производного или фрагмента tPA, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

5. Применение по п.4, отличающееся тем, что активатором плазминогена является tPA.

6. Применение по п.3, отличающееся тем, что активатор плазминогена выбирают из: uPA и производного или фрагмента uPA, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что активатором плазминогена является uPA.

8. Фармацевтическая комбинация для одновременного, раздельного или последовательного введения, отличающаяся тем, что она включает матриксную металлопротеиназу-10 ММР-10 и активатор плазминогена, смешанные с фармацевтически приемлемыми экципиентами или наполнителями.

9. Фармацевтическая комбинация по п.8, отличающаяся тем, что активатор плазминогена выбирают из тканевого активатора плазминогена tPA, урокиназного активатора uPA и производного или фрагмента указанных активаторов плазминогена, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

10. Фармацевтическая комбинация по п.9, отличающаяся тем, что активатор плазминогена выбирают из tPA и производного или фрагмента tPA, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

11. Фармацевтическая комбинация по п.9, отличающаяся тем, что активатор плазминогена выбирают из uPA и производного или фрагмента uРА, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

12. Набор для тромболитической терапии, характеризующийся тем, что он включает матриксную металлопротеиназу-10 ММР-10 и активатор плазминогена в качестве фармацевтической комбинации для их одновременного, раздельного или последовательного введения.

13. Набор по п.12, отличающийся тем, что активатор плазминогена выбирают из тканевого активатора плазминогена tPA, урокиназного активатора uPA и производного или фрагмента указанных активаторов плазминогена, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

14. Набор по п.13, отличающийся тем, что активатор плазминогена выбирают из tPA и производного или фрагмента tPA, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

15. Набор по п.13, отличающийся тем, что активатор плазминогена выбирают из uPA и производного или фрагмента uPA, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

16. Фармацевтическая комбинация по любому из пп.8-11 для тромболитической терапии.

17. Способ тромболитической терапии, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества матриксной металлопротеиназы-10 ММР-10.

18. Способ по п.17, который дополнительно включает введение пациенту терапевтически эффективного количества активатора плазминогена.

19. Способ по п.18, в котором матриксная металлопротеиназа-10 ММР-10 и активатор плазминогена являются пригодными для одновременного, раздельного или последовательного введения.

20. Способ по п.18, в котором активатор плазминогена выбирают из тканевого активатора плазминогена tPA, урокиназного активатора uPA производного или фрагмента указанных активаторов плазминогена, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

21. Способ по п.20, в котором активатор плазминогена выбирают из tPA и производного или фрагмента tPA, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

22. Способ по п.20, в котором активатор плазминогена выбирают из uPA и производного или фрагмента uPA, которые сохраняют способность активировать плазминоген.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат матриксную металлопротеиназу-10 (ММР-10), и, более конкретно, к комбинации ММР-10 и активатора плазминогена, а также к их применению для тромболитической терапии и лечению.

Предшествующий уровень техники

Гемостатическая система представляет собой систему для поддержания циркуляционного потока и предотвращения кровотечения в ответ на сосудистое поражение. Физиологический гемостаз контролируется как механизмами, которые активируют коагуляцию, так и образование фибрина, а также механизмами, которые способствуют их деградации или фибринолизису. Избыточная активация коагуляции или нарушение фибринолизиса приводит к увеличению образования сгустков, которые блокируют кровеносные сосуды (интраваскулярный тромбоз), вызывая ишемию и некроз. Однако общая обстановка при гиперфибринолизисе будет благоприятствовать наступлению кровотечений.

Сердечно-сосудистые заболевания атеротромбозной природы являются сегодня главной причиной смертности от заболеваний. В этой группе заболеваний тромболитические процессы являются главным механизмом, увеличивающим острые сердечно сосудистые события главной клинической значимости, такие как острый инфаркт миокарда (MI) или инсульт («удар»).

Поэтому все стратегии лечения инсультов и случаев тромбоза в целом обязательно должны активировать быстрое изменение направления артериального протока, блокированного сгустком, чтобы восстановить кровоток к тканям и, таким образом, предотвратить любое крупное повреждение. Это то, что общеизвестно как тромболитическая терапия.

Так как известно, что фибринолизис лежит в основе биохимического процесса тромболизиса, тромболитическая терапия стремится, прежде всего, способствовать деградации фибриновой сети, которая удерживает сгусток как целое.

Так как известно, что плазмин является ферментом, который катализирует лизис и деградацию фибрина, первой целью в достижении быстрого растворения сгустка является максимизация производства плазмина.

С этой целью с 1980 г. вводилось применение активаторов плазминогена, способных активировать конверсию плазминогена (неактивного профермента) в активный плазмин: тканевый активатор плазминогена (tPA), урокиназный активатор плазминогена (uPA) или другие подобные агенты.

У Baker [Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 8, 2002, сс.291-314] приводится обзор состояния знаний в области тромболитической терапии и применяемых и разрабатываемых тромболитических средств, их клинического применения, а также преимущества и недостатки. В этой работе Baker также излагает характеристики, которыми должно обладать идеальное тромболитическое средство: 1) быстродействующий тромболизис, для быстрого восстановления артериального или венозного кровотока; 2) специфичность к фибрину так, чтобы фибринолизис ограничивался областями острого тромбоза с уменьшенным системным фибринолизисом; 3) сохранение действия во времени; 4) специфичность к сгустку, чтобы предотвратить воздействия на фибриноген, другие протеины, вовлеченные в коагуляцию, и не изменять первичный гемостаз; 5) отсутствие побочных эффектов; и 6) низкая стоимость.

В случае острого инфаркта миокарда и острой цереброваскулярной ишемии («удара») успех тромболитической терапии ведет к увеличению выживаемости пациентов и лучшему восстановлению функции ишемической ткани [White H.D. и др.; N. Engl. J. Med., 317, 1987; сс.850-855]; [Suwanwela N. и Koroshetz W.J.; Annu. Rev. Med., 58, 2007; сс.89-106]. К сожалению, тромболитическая терапия имеет неудачи и побочные эффекты.

Почти 40% пациентов с острым инфарктом миокарда не поддаются фибринолитической терапии и не достигают оптимального изменения направления артерии, блокированной тромбом [Armstrong PW и Collen D; Circulation, 103, 2001; сс.2862-2866].

Для решения этой проблемы в настоящее время вместо фармакологического тромболизиса используется первичная чрескожная ангиопластика в качестве реперфузионной терапии, более эффективной, чем тромболитическая терапия, с точки зрения уменьшения показателя смертности, повторных инфарктов и кровоизлияний. Однако во многих случаях использовать ангиопластику невозможно (отсутствует доступная лаборатория гемодинамики или географическое расстояние не позволяет), и тогда осуществляется тромболитическая терапия. Поэтому, желательно, чтобы разрабатывались новые стратегии лечения, которые позволяют улучшить эффективность тромболитической терапии, например, доклиническая тробмолитическая терапия, новые тромболитические средства (тенектеплаза) или новые фармакологические комбинации (а именно, уменьшение тромболитических средств до половины дозы и добавление блокатора GP IIb/IIIa рецептора тромбоцитов [Brouwer МА и др., Heart, 90, 2004; сс.581-588]. Имеет место также значительный показатель смертности, связанный с фибринолитическим лечением из-за геморрагических осложнений; особенно кровоизлияний в центральной нервной системе и обширных кровоизлияний, в 2%-14% случаев.

В случае острой цереброваскулярной ишемии, тромботическая терапия рекомбинантным tPA в течение первых трех часов с последующим появлением симптомов является лишь схемой, которая сама по себе показывает, что есть какой-то эффект. К сожалению, в 25%-30% случаев, лечение неэффективно, сгусток не лизируется, и блокированная артерия не становится проходимой. Кроме того, лечение с помощью tPA имеет высокий процент геморрагических осложнений (вызывает до 5% симптоматических кровоизлияний), и многие терапевты боятся этих осложнений. По этой причине, большая часть пациентов, которая могла бы получить выгоду от этого лечения, не получает его. Другой проблемой, связанной с введением tPA, потенциально более серьезной, чем риск кровоизлияний, является токсическое действие на центральную нервную систему, которое во многих случаях ответственно за неудачу терапии [Cheng Т. и др., Nat. Med., 12, 2006; сс.1278-1285]. Поэтому, уменьшение риска кровоизлияния при введении tPA, могло бы изменить осознание безопасности этого лекарственного средства и расширить его применение. Таким образом, все еще сохраняется необходимость отбора терапевтических средств и их комбинаций, которые делают возможным уменьшение токсичности tPA, прямо или опосредованно, посредством снижения дозы, необходимой для лечения инсульта.

Зная, что существуют ферменты, отличные от плазмина, которые могут непосредственно разрушать фибриноген и фибрин, проводилось также исследование по их потенциальному применению для тромболитического лечения. Эти ферменты включают эндогенные протеазы лейкоцитов (эластаза и катепсин G), змеиный яд или протеазы пиявок, или протеазы из некоторых бактерий.

В ЕР 1060747 описывается применение фибринолитических матриксных металлопротеиназ, которые обнаруживают значительную активность в протеолитическом расщеплении и деградации фибрина и фибриногена. Эти фибринолитические металлопротеиназы включают ММР-2 (желатиназа А), ММР-3 (стромелизин 1), ММР-7 (матрилизин), ММР-9 и, в особенности, матриксную металлопротеиназу мембранного типа ММР-МТ1. Спустя несколько месяцев Bini и др. привели результаты дополнительных исследований по этим ферментам [Biochemistry, 38, 1999; сс.13928-13936]. Однако ни в этих, ни в других, более поздних работах не приводились данные, касающиеся эффективности этих фибринолитиков, являющихся матриксными металлопротеиназами, в лизисе и деградации фибрина, который образует тромбы, или в достижении более быстрого растворения сгустка, или, скорее, в обеспечении большей селективности в деградации фибрина в сгустке относительно системного фибриногена.

Целью настоящего изобретения является обеспечение альтернативных терапевтических композиций и комбинаций для тромболитической терапии, которые способствуют лизису сгустков посредством селективной деградации фибрина и которые помогают в минимизации неблагоприятных последствий, связанных с другим тромболитическим лечением (кровоизлияние, токсичность и т.д.).

Краткое описание фигур чертежей

На фиг.1 показаны данные теста плотности затвердевающей плазмы, выраженные как величины поглощения при 405 нм относительно времени эксперимента, длящегося в минутах. А: график показывает различие в образовании сгустка (максимальное поглощение) плазмы отдельно (контроль) или в присутствии ММР-10 (200 нМ) или ММР-3 (200 нМ). В: график показывает образование и лизис фибринового сгустка затвердевающей плазмы в присутствии tPA активатора плазминогена (30 ед/мл) и uPA (135 ед/мл) отдельно или в комбинации с ММР-10 (200 нМ), а также в присутствии эквивалентной дозы ММР-3 (200 нМ) в комбинации с tPA (30 ед/мл).

На фиг.2 приведено изображение чашки с полимеризованным фибрином, показывающей области лизиса, вызванные tPA (1 ед/мл) и ММР-10 (200 нМ) по отдельности или при добавлении комбинации одного с другим.

На фиг.3 изображен тест плотности, показывающий различие во времени лизиса фибринового сгустка при разных дозах tPA (20, 25 и 30 ед/мл). Комбинация ММР-10 (200 нМ) и tPA (20 ед/мл) сокращает время лизиса по сравнению с активатором как таковым.

На фиг.4 показан тест активности ММР-10 (200 нМ) плазмы с флуоресцентным стромелизиновым субстратом. Концентрацию моноклональных антител (MAb), которая ингибирует активность ММР-10 плазмы, определяли посредством уменьшения на спаде образования субстрата. В качестве контроля использовали контрольное антитело IgG-изотипа.

На фиг.5 показан тест плотности плазмы, затвердевающей с помощью ММР-10 (200 нМ) в присутствии или в отсутствие моноклонального антитела (MAb), которое ингибирует активность ММР-10, и контрольного антитела IgG-изотипа.

На фиг.6 показана чашка с фибрином, иллюстрирующая различия в площади лизиза, вызываемого с помощью tPA (1 ед/мл) и ММР-10 (200 нМ) в присутствии или в отсутствие моноклонального антитела, которое ингибирует активность ММР-10, и изотипа контрольного антитела (IgG).

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится, прежде всего, к применению или использованию матриксной металлопротеиназы-10 (ММР-10) для приготовления лекарственного средства для тромболитической терапии и лечения.

ММР-10, или стромелизин-2, локализован на хромосоме 11 и экспрессируется различными типами клеток, такими как эндотелиальные клетки, моноциты и фибробласты [Madlener М. и Werner S.; Gene, 202, 1997; cc. 75-81]. Известно, что эта экспрессия может активироваться плазмином, калликрейном, триптазой, эластазой и катепсином G и может деградировать широкий спектр субстратов внеклеточного матрикса, таких как аггрекан, эластин, фибронектин, желатин, ламинин, тенасцин-С, витронектин и коллагены типа II, III, IV, IX, Х и XI. Кроме того, ММР-10 может активировать другие матриксные металлопротеиназы, такие как проММР-1, -3, -7, -8 и -9 [Nakamura H. и др., Eur. J. Biochem., 253, 1998; cc.67-75].

Известно также, что ММР-10 вовлечена в различные физиологические процессы, такие как рост костей и заживление ран. Она также обнаруживает сверхэкспрессию в роговице пациентов с диабетической ретинопатией и связана с некоторыми типами карциномы, а также лимфоидными опухолями. Различные исследования in vitro показали, что в культурах кераноцитов экспрессия ММР-10 может быть индуцирована как факторами роста (эпидермальным фактором роста кераноцитов или TGF-бета), так и провоспатительными цитокинами (TNF-альфа, IL-1бета) [Rechardt О. и др., J. Invest. Dermatol., 115, 2000; cc. 778-787]; [Li de Q. и др.; Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44, 2003; cc.2928-2936].

В публикациях до данного изобретения описано также, что ММР-10:

- может быть воспалительным биомаркером сосудистого риска [Montero I. и др.; J. Am. Coll. Cardiol., 47, 2006; cc.1369-1378] [Orbe J. и др.; J. Thromb. Haemost.; 5, 2007; cc.91-97];

- индуцируется в эндотелиальных клетках, которые образуют капилляры в 3D коллагеновых матриксах, и вовлечена в регрессию образования капилляров посредством активации ММР-1 [Saunders W.B. и др.; J. Cell. Sci., 118, 2005; cc.2325-2340]; и что

- она играет фундаментальную роль в поддержании внутриклеточных связей, которые сохраняют сосудистую целостность при ангиогенезе и в процессах реконструкции [Chang S. и др.; Cell, 126, 2006; cc.321-334].

В настоящем изобретении протестировано действие ММР-10 и ММР-3 на образование и лизис сгустков в плазме человека, а также на других моделях деградации полимеризованного фибрина in vitro.

Авторы изобретения смогли доказать, что ММР-10 не обладает какой-либо непосредственной тромболитической активностью и что она сама не способна деградировать фибриноген или фибрин. Неожиданно, они также доказали, что в присутствии тромболизис-активирующих агентов, в частности активаторов плазминогена, ММР-10 способствует растворению фибриновых сгустков и сокращает время лизиса. ММР-10, таким образом, действует как облегчитель или адъювант тромболитического действия других активаторов тромболизиса.

В противоположность этому, фибринолитическая матриксная металлопротеиназа, такая, как ММР-3, которая обладает непосредственной протеолитической активностью по отношению к фибрину и фибриногену, не сокращает время лизиса, которое обеспечивается самими активаторами тромболизиса.

В контексте данного изобретения «тромболитическая терапия» понимается как такая терапия, которая, в клинических ситуациях ишемии тромбозного происхождения, изыскивает реперфузию или восстановление кровотока посредством лизиса или быстрого растворения сгустков, которые блокируют кровообращение и подвергают опасности функционирование органов. Эти клинические ситуации включают, в частности, тромболитическую терапию при острых инфарктах миокарда, при церебральном тромбозе (более конкретно, остром церебральном инфаркте или инсульте), а также других венозных тромбоэмболиях (а именно легочной эмболии или тромбозе глубоко расположенных вен) и периферическом артериальном тромбозе.

Данное изобретение относится, более конкретно, к применению или использованию ММР-10 и активатора плазминогена для приготовления лекарственного средства или фармацевтической композиции для тромболитической терапии и лечения посредством одновременного, раздельного или последовательного введения.

В контексте данного изобретения активатор плазминогена представляет собой соединение, которое активирует конверсию неактивного плазминогена в плазмин посредством расщепления пептидной связи между Arg569 и Val561 плазминогена. В частности, эти активаторы плазминогена включают: урокиназу (uPA), тканевый активатор плазминогена (tPA), стрептокиназу и стафилокиназу.

В одном конкретном воплощении данного изобретения активатором плазминогена является tPA.

В другом конкретном воплощении активатором плазминогена является uPA.

В еще одном конкретном воплощении производное или фрагмент вышеупомянутых активаторов плазминогена могут быть использованы в качестве активатора плазминогена, который сохраняет свою способность расщеплять и активировать плазминоген, в отношении которого действие облегчения ММР-10 является эффективным. Специалист в данной области техники может легко увидеть это действие сам, например, с помощью таких приемов, как образование сгустка in vivo и тестов лизиса, таких как тесты, описанные в примерах 1-4 данного изобретения. У Longstaff и Thelwell [FEBS Letters, 579, 2005; сс.3303-3309] приводится обзор некоторых активаторов плазминогена, использующихся или разрабатываемых в настоящее время, при которых специалист может выбрать, чтобы использовать их в комбинации с ММР-10 согласно настоящему изобретению.

Преимуществом является то, что, не взаимодействуя с находящимся в кровообращении фибриногеном/фибрином и будучи способным облегчать действие активаторов плазминогена, ММР-10 сделал бы возможным уменьшить дозу тромболитика посредством поддержания эффективности лизиса сгустка, но без индуцирования системного фибринолизиса, который влечет за собой большую вероятность связанных с кровоизлияниями осложнений. Аналогично, это дало бы возможность уменьшить токсичность, происходящую от тромболитического лечения такими средствами, как tPA.

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение относится также к фармацевтической комбинации, которая включает, по отдельности или в той же самой композиции, ММР-10 и активатор плазминогена, смешанные с фармацевтически приемлемыми эксципиентами или наполнителями. Активатор плазминогена в комбинации может быть любым из тех, которые упомянуты выше.

Данная комбинация может быть использована для тромболитической терапии и лечения млекопитающих, в частности, в любых вышеупомянутых клинических условиях.

Происхождение ММР-10 и активатора плазминогена в фармацевтической комбинации не является значимым аспектом изобретения. Активные ингредиенты могут быть получены экстракцией и очисткой из биологических жидкостей или тканей с помощью процедур рекомбинантной или генетической инженерии или любой другой традиционной методики.

В зависимости от обстоятельств, определяемых в каждом случае с помощью обычных фармакологических и клинических тестов, активные ингредиенты фармацевтической комбинации могут назначаться одновременно, последовательно или раздельно.

В соответствии с одним воплощением изобретения, активные ингредиенты (ММР-10 и активатор плазминогена) могут содержаться в одной определенной фармацевтической композиции. В других случаях, активные ингредиенты могут содержаться в отдельных фармацевтических композициях, каждая из которых в своем собственном контейнере смешана с фармацевтически приемлемыми эксципиентами или наполнителями.

Фармацевтические композиции с активными ингредиентами, одним или более, могут быть приготовлены как в твердой форме (напр., высушены замораживанием в пробирках, чтобы позже их можно было восстановить в подходящем растворе), так и в жидкой форме.

В одном конкретном воплощении, эти композиции с активными ингредиентами составляют набор для тромболитической терапии или лечения, который может выборочно включать другие компоненты, такие как: контейнеры с растворами для восстановления активных ингредиентов, канюли, сумки для капельного вливания с физиологической сывороткой для внутривенного введения и инструкции для использования, и т.д.

Фармацевтические композиции с активными ингредиентами могут вводиться любым подходящим способом, например, орально, парентерально, ректально или местно, для чего они могут включать фармацевтически приемлемые наполнители или среды, необходимые для приготовления желаемой формы введения.

В одном конкретном воплощении, введение осуществляется парентерально, например, посредством внутривенной инъекции, или локально посредством катетеризации для введения in situ в область, прилегающую к сгустку.

Когда фармацевтическая комбинация предназначается для раздельного введения, оба активных ингредиента могут также содержаться в фармацевтических композициях, подходящих для введения разными путями.

Количества ММР-10 и активатора плазминогена, которые могут присутствовать в композициях фармацевтической комбинации, обеспечиваемой данным изобретение, могут изменяться в широком интервале, но всегда в терапевтически эффективных значениях.

Дозировка для каждого протокола тромболитического лечения с помощью композиций фармацевтической комбинации согласно данному изобретению будет зависеть от многочисленных факторов, включая возраст пациента, состояние, тяжесть клинического состояния, которое требует лечения, способ и частота введения и активатор плазминогена, который предстоит вводить в каждом случае.

В одном типичном воплощении, количества и дозы активатора плазминогена будут меньше, чем те, которые использовались бы для того же самого активатора плазминогена, когда ММР-10 не включен в терапевтическую комбинацию. С другой стороны, количества ММР-10 могут регулироваться с точки зрения эффекта, которого требуется достичь: большая тромболитическая эффективность посредством поддержания дозы активатора плазминогена; или уменьшение дозы активатора плазминогена, поддерживая тромболитическую эффективность.

В другом аспекте, данное изобретение относится к фармацевтической комбинации или набору согласно изобретению, как уже описано, для тромболитической терапии.

В дополнительном аспекте, изобретение также относится к способу тромболитического лечения и терапии, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества ММР-10. В одном конкретном воплощении, упомянутый метод также включает введение активатора плазминогена посредством одновременного, раздельного или последовательного введения. Любые из вышеупомянутых фармацевтических композиций и комбинаций могут быть использованы в этом способе.

Следующие примеры иллюстрируют данное изобретение и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

Примеры

Данные примеры иллюстрируют эффекты по фибринолитической и тромболитической активности ММР-10 и ММР-3 матриксных металлопротеиназ, непосредственно или в комбинации с некоторыми активаторами плазминогена: урокиназой (uPA) и тканевым активатором плазминогена (tPA).

В качестве примеров приводится следующее:

- Рекомбинатная ММР-10, полученная в виде 58 кДа фермента с 20%-30% зрелого 48 кДа фермента (R&D Systems, 910-MP, Абингдон, Великобритания), которая была восстановлена с помощью TCNB буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 10 нМ CaCl₂, 150 мМ NaCl. 0,05% Brij35).

- Рекомбинантная ММР-3, полученная в виде 52 кДа фермента (R&D Systems, 513-MP, Абингдон, Великобритания), представленная в растворе с 12,5 нМ Tris, 5 нМ CaCl₂, 0,025% Brij35 и 50% глицеролом).

- Урокиназа (uPA) (Vedim Pharma SA; 628602, Барселона, Испания).

- Рекомбинантный тканевый активатор плазминогена (tPA) (Boerhinger Ingelheim; 985937 Actilyse®, Ингельхайм, Германия).

Для оценки тромболитической активности был использован метод помутнения для слежения за формированием и лизисом фибринового сгустка в образцах плазмы в соответствии с протоколом, ранее описанным von dern Borne и др. [Blood, 86, 1995; сс.3035-3042].

С другой стороны, для оценки активности лизиса фибрина были проведены чашечные тесты с фибрином, следуя процедуре, описанной Edward [J. Clin. Path., 25, 1972; cc.335-337].

Пример 1: Действие ММР-10 и ММР-3 на образование и лизис сгустка

Как уже упоминалось выше, с помощью процедуры, описанной von dern Borne и др., проводилась оценка действия ММР-10 и ММР-3 на гемостатическую систему. В этом методе изменения в помутнении/поглощении во время образования и лизиса сгустков оценивались как индикатор длительности обоих этих процессов. Помутнение измерялось считыванием поглощения при 405 нм во время фаз образования и лизиса сгустков, используя фотометрический считыватель, который в нашем случае представлял собой ELISA-считыватель (Fluostar Optima, BMG Labtech). Увеличение замутненности/поглощения указывает на образование фибринового сгустка, в то время как уменьшение этого параметра указывает на лизис сгустка.

Для образования сгустка в микропланшетной лунке смешивали 75 мкл цитратной плазмы, 75 мкл HEPES буфера (25 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, 3,5 мМ KCl, 6 мМ CaCl₂, 1,2 мМ MgCl₂ и 0,1% BSA, рН=7,5) и 10 мкл CaCl₂ 150 мМ. Планшет инкубировани до 37°С и измеряли поглощение на 405 нМ в течение 2 часов каждые 30 секунд.

Для исследования действия ММР-10 на образование сгустка, к первоначальной плазме добавляли активированную ММР-10 и HEPES буферную смесь. Перед ее использованием в экспериментах ММР-10 активировали посредством тепловой обработки при 37°С в течение 1 часа.

В параллельных тестах действие на образование сгустка анализировали также с использованием ММР-3 (200 нМ). В этом случае ММР-3 предварительно активировали с помощью 1 мМ ацетата p-аминофенилртути (АРМА, 164610, EMD Biosciences, Ла Йолла, США) при 37°С в течение 24 ч.

Как показано на Фиг.1, ММР-10 не вызывает никаких изменений ни в скорости образования сгустка, ни в максимальной степени помутнения, достигаемой с помощью какой-либо используемой дозы (Таблица 1). Однако, ММР-3 вызывает 50% падение в максимальном поглощении/замутненности образованного сгустка, вероятно, из-за прямого протеолитического действия на фибриноген.

Эти результаты показывают, что ММР-10, в отличие оттого, что описано для ММР-3, не изменяет степени образования сгустка и не показывает какой-либо фибринолитической активности по отношению к фибриногену.

После этого было проведено исследование степени лизиса фибринового сгустка, и по его завершении, как и в разделе, только что приведенном выше, использовали затвердевшую плазму в HEPES буфере, к которой одновременно с ММР-10 (или ММР-3, как возможный случай), добавляли активатор плазминогена, чтобы выбрать либо 30 ед/мл тканевого активатора плазминогена (tPA), либо 135 ед/мл урокиназы (uPA) в начале замутнения.

Концентрации tPA и uPA, которые должны использоваться, определяли в предварительных исследованиях «доза-ответ», где выбранная доза была такой, которая полностью лизировала фибриновый сгусток в течение двухчасового (2 ч) периода времени.

Как показано на Фиг.1В и в Таблице 1, ММР-10 в отсутствие tPA и uPA не вызывал лизиса фибринового сгустка, в то время как в присутствии активаторов tPA и uPA он вызывал значительное увеличение степени лизиса фибринового сгустка. При максимальной протестированной дозе ММР-10 (200 нМ) сокращение времени лизиса (времени, при котором лизировалась половина сгустка) составляло 15 мин (52,9 мин по сравнению 68,3 мин, р<0,05). Это уменьшение времени лизиса означает 20%-ное сокращение в присутствии tPA и 10%-ное сокращение в присутствии uPA.

В противоположность этому, ММР-3 не изменял степень лизиса сгустка в присутствии tPA.

Эти указывает на то, что ММР-10, в отличие от ММР-3, не способен расщеплять фибрин, но увеличивает эффект активаторов плазминогена и фибринолизиса (tPA или uPA). He обладая способностью воздействовать на эндогенный фибринолизис, ММР-10 препятствовал бы или ослаблял возникновение кровоизлияний, что делает его хорошим кандидатом для использования в качестве коадъюванта в тромболитической терапии.

Таблица 1
Время лизиса фибринового сгустка (данное в минутах), в присутствии активаторов плазминогена (tPA или uPA)
	ТРА 30 ед/мл	tPA 20 ед/мл	tPA 15 ед/мл	uPA 135 ед/мл
Контроль	68.3	102.0	125.3	47.5
ММР-10 50 нМ	65.5	-	-	-
ММР-10 100 нМ	61.2	-	-	-
ММР-10 200 нМ	52.9	84.7	108.7	42.0
ММР-3 200 нМ	76.3	-	-	-
Анти-ММР-10 (MAb)	Отсутствие лизиса	-	-	Отсутствие лизиса
(IgG) Изотипный контроль	74.3	-	-	48.3

Пример 2: Действие ММР-10 на деградацию фибрина

В соответствии с упомянутыми выше процедурами Edward было выполнено исследование по воздействию на лизис фибрина с помощью измерения гало или площади лизиса, который вызывается на чашке с полимеризованным фибрином.

Чашки с фибрином приготовляют из 6 мг/мл раствора фибриногена человека (Sigma, F3879, Сент-Луис, Монтана, США) в вероналовом буфере (Bio Whittaker, 12-624E, Кэмбрекс, Мэриленд, США) при 37°С, который фильтруют и к которому добавляют равный объем CaCl ₂ (50 мМ). Этот раствор (6 мл) смешивают с 1 международной единицей (NIH единицы) тромбина (Enzyme Research Lab; HT1200a, Сванси, Великобритания) и оставляют полимеризоваться в течение 6 ч.

Для оценки тромболитической способности tPA (1 ед/мл), ММР-10 (200 нМ) или их комбинацию добавляли к различным чашкам с фибрином.

Как показано на Фиг.2, один ММР-10 не вызывал лизиса полимеризованного фибрина, в то время как tPA вызывал заметное гало. Однако комбинация tPA и ММР-10 значительно увеличивала область лизиса полимеризованного фибрина (186,6%), что является фактом, который подтверждает эффект облегчения фибринолизиса, которым обладает ММР-10 в комбинации с активаторами плазминогена в качестве фибринолитических агентов.

Пример 3: Действие совместного введения ММР-10 и тромболитического агента (tPA и ММР-10) на лизис сгустка

Зная о действии ММР-10 на включенность tPA в лизис, возник вопрос, возможно ли уменьшить дозу tPA (который влечет кровоизлияние и нейрологические проблемы, связанные с токсичностью) и использовать ММР-10 в качестве коадъюванта для достижения такого же самого тромболитического эффекта.

В турбидиметрическом тесте, после которого была использована процедура, описанная выше в Примере 1, мы обнаружили, что присутствие ММР-10 (200 нМ) в комбинации с tPA дает возможность уменьшить дозу tPA до 33% (с 30 до 20 ед/мл), достигая такого же самого времени лизиса сгустка (Фиг.3, таблица 1).

Этот результат указывает, что у субъекта, который нуждается в тромболитической терапии, ММР-10 позволяет увеличить фибринолизис и лизис сгустка при одновременном уменьшении дозы tPA и, следовательно, минимизировать геморрагические и связанные с токсичностью проблемы, вызываемые этим лекарственным средством.

Пример 4: Ингибирование фибринолизиса сгустка и лизиса, вызванного tPA, с помощью антител к ММР-10.

В соответствии с результатами в Примерах 1 и 2 был выполнен анализ специфичности действия ММР-10 на лизис фибрина в сгустке, вызванном tPA при одновременном добавлении различных доз активного ММР-10 в присутствии (отношение 1:2) и в отсутствие моноклонального антитела, которое блокирует его активность (R&D systems, MAB9101, Абингтон, Великобритания), или контрольного антитела IgG2B мышиного изотипа (eBioscience, 16-4732, Сан Диего, Калифорния, США) в такой же концентрации, как и антитело.

Соотношение фермент: антитело, которое блокирует активность фермента, предварительно анализировали в тесте активности для ММР-10 на микрочашке, покрытой антителом к ММР-10 (R&D Systems, Cloni 10343) и используя флуорогенный стромелизиновый субстрат (MCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys-[DNP]-NH ₂) (R&D Systems; ES002, Абингтон, Великобритания) [Lombard et al.; Biochimie, 87, 2005; сс.265-272). Флуоресценцию (320 нм излучения и 405 нм поглощения) измеряли на спектрофлуориметре (SpectraMAX GeminiXS, Molecular Devices, Калифорния, США) в течение 1 часа, обнаружив, что соотношение 1:2 полностью ингибирует концентрацию активного фермента (Фиг.4).

Результаты показывают, что коадъювантное действие на фиринолизис является ММР-10-специфичным, учитывая то, что оно инвертируется в присутствии антитела к ММР-10. Этот эффект довольно заметен, когда упомянутое антитело добавляют, чтобы блокировать эндогенную активность ММР-10 в плазме (Фиг.5). Результаты показывают, что отсутствие ММР-10 в плазме предотвращает лизис фибринового сгустка даже в присутствии tPA или uPA (Таблица 1).

Эти результаты подтверждались в чашечных тестах с полимеризованным фибрином. Как показано на Фиг.6, в присутствии антитела к ММР-10, область лизиса, вызываемого комбинацией tPA: MMP-1, уменьшена (91,2% против 188,6%), в то время как контрольное антитело не имеет никакого действия (184,6%). Эти данные подтверждают, что использование ММР-10 ингибиторного антитела блокирует фармакологическое растворение фибриновых сгустков.