авирулентная адъювантная живая вакцина против mycoplasma hyopneumoniae

Формула изобретения

1. Композиция для индукции иммунного ответа против Mycoplasma hyopneumoniae у животного, содержащая иммунологически эффективное количество живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae, представляющего собой штамм, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 90%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J Mycoplasma hyopneumoniae, имеющего номер доступа АТСС 25934 (номер доступа в GenBank AE017243), и биологически приемлемый адъювант SP-масло.

2. Композиция по п.1, где указанное SP-масло присутствует в концентрации от примерно 1% до примерно 25%.

3. Композиция по п.2, где указанное SP-масло присутствует в концентрации примерно 10%.

4. Композиция по п.1, дополнительно содержащая одну или более живых бактерий, бактерии и/или один или более чем один очищенный анатоксин, выбранный из группы, состоящей из Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae и бактерий лептоспира.

5. Композиция по п.1, дополнительно содержащая один или более чем один вирусный антиген, выбранный из группы, состоящей из антигена вируса свиного гриппа (SIV), антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), поксвируса енота, экспрессирующего PRRS или другие антигены, TGEV (вирус трансмиссивного гастроэнтерита), экспрессирующего PRRS или другие антигены, и антигена свиного цирковируса (PCV).

6. Композиция по п.5, где указанный один или более чем один вирусный антиген представляет собой химеру свиного цирковируса типа 1-типа 2 (cPCV 1-2).

7. Композиция по п.1, где иммунный ответ, вызванный живым авирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae, защищает животное от инфекции или уменьшает тяжесть по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией вирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae.

8. Композиция по п.1, представляющая собой иммуногенную композицию.

9. Способ индукции иммунного ответа против Mycoplasma hyopneumoniae, защиты животного против заболевания, ассоциированного с вирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae, или предупреждения или уменьшения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с указанным заболеванием, включающий стадию введения указанному животному композиции по любому из пп.1-7.

10. Способ по п.9, где стадию введения осуществляют посредством парентерального введения.

11. Способ по п.9, где стадию парентерального введения осуществляют посредством внутримышечной инъекции.

12. Способ по п.9, где стадию введения осуществляют посредством перорального введения.

13. Способ по п.12, где стадию перорального введения осуществляют посредством ручной подачи и массового применения.

14. Способ по п.9, где стадию введения осуществляют посредством ннтраназального введения.

15. Способ по п.9, где указанное животное представляет собой свинью.

16. Способ предупреждения или смягчения вспышки Mycoplasma hyopneumoniae, включающий стадию введения животному композиции по п.1.

17. Способ усиления иммунного ответа на Mycoplasma hyopneumoniae, включающий стадию введения однократной или многократных доз композиции животному по любому из пп.3-6 или 8.

18. Способ усиления иммунного ответа на Mycoplasma hyopneumoniae, включающий стадии:

а) сначала введение животному первой дозы композиции по любому из пп.1-6;

б) затем введение животному второй дозы композиции по любому из пп.1-6.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в основном к областям иммунологии и ветеринарной медицины. Более конкретно, в настоящем изобретении предложены адъювантные живые авирулентные композиции М. hyopneumoniae на основе штамма. J М.hyopneumoniae, включая иммуногенные и вакцинные композиции, которые способствуют снижению тяжести и/или предупреждению заболевания, вызванного одним или более чем одним вирулентным штаммом М.hyopneumoniae. Также предложены адъювантные живые авирулентные композиции М.hyopneumoniae, включая иммуногенные или вакцинные композиции, дополнительно содержащие химерную модифицированную живую вакцину против свиного цирковируса типа 1-типа 2 (cPCV1-2). Введение животному одной или двух доз адъювантной живой авирулентной композиции М.hyopneumoniae, раскрытой в данной заявке, является эффективным в обеспечении иммунитета, включая клеточный иммунитет и/или гуморальный иммунитет против заражения вирулентным штаммом М.hyopneumoniae.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Mycoplasma hyopneumoniae (также называемая М.hyopneumoniae) является возбудителем микоплазменной пневмонии свиней. Заболевание вызывает хронический кашель, тусклый цвет щетины, замедленный рост и болезненный вид в течение нескольких недель. У зараженных животных наблюдаются характерные поражения в виде участков уплотнения от красного до серого цвета, в частности, в вентральной апикальной и сердечной долях. Хотя заболевание вызывает незначительную смертность, пораженная свинья зачастую склонна к вторичным инфекциям, вызванным условно-патогенными микроорганизмами, приводящим к гибели или стрессу. (R.F. Ross, Mycoplasmal diseases, pp.436-444, в A.D. Laman, et at., (eds.) Diseases of Swine, Iowa State University Press, 1986).

Это заболевание считается одной из наиболее важных причин ассоциированной с заболеванием гибели свиней (Whittlestone, pp.133-176, in Tully and Whitcomb (eds.), The Mycoplasma Vol 2: Human and Animal Mycoplasmas, New York, Academic Press, (1979)). Заболевание обычно приводит к неэффективному приросту массы и появлению чахлых и болезненных животных. Кроме того, пораженная свинья часто склонна к вторичной инфекции, вызванной условно-патогенными организмами (Burch, Pig America pp.26-27, December, 1982). Экономические последствия этого заболевания являются значительными. Только экономические потери были оценены в 200-250 миллионов долларов ежегодно.

Mycoplasma hyopneumoniae является медленно растущей, прихотливой бактерией, лишенной клеточной стенки. Ее часто бывает трудно выделить из дыхательных путей из-за Mycoplasma hyorhinis, общего вторичного агента, также локализованного в дыхательных путях. Заболевание распространяется в виде аэрозоля, продуцируемого при кашле, и при непосредственном контакте с пораженной свиньей или свиньей-бактерионосителем в стадии выздоровления. Смешивание зараженных и незараженных животных приводит к раннему и частому повторному заражению. Инфекция часто начинается с заражения поросят свиноматками-носителями во время опороса.

Из-за методов содержания стада инфекция может быть обнаружена только в конце жизни. Дополнительное заражение обычно наблюдают после отъема, когда поросят объединяют. Явное заболевание обычно наблюдают у поросят в возрасте шести недель или старше. Скорости роста и скорости конверсии корма значительно снижены у пораженных животных. Существующее лечение с использованием антибиотиков является дорогостоящим и требует длительного применения. Остается проблемой повторное заражение животных.

Таким образом, вакцины в настоящее время являются наиболее эффективным способом предупреждения инфекций и их последствий. Были предприняты многочисленные попытки создания вакцины для защиты свиней от заражения Mycoplasma hyopneumoniae. Некоторые исследователи описали вакцины, содержащие полученные рекомбинантным путем поверхностные антигены Mycoplasma hyopneumoniae, Schaller с совет., патент США № 4894332, выданный 16 января 1990 г.; европейская патентная публикация № 283840, опубликованная 28 сентября 1988 г. В публикации РСТ № WO 86/00019, опубликованной 3 января 1986 г., раскрыта вакцина против Mycoplasma hyopneumoniae, содержащая исключительно плазматические мембраны Mycoplasma hyopneumoniae, свободные от других клеточных компонентов. Etheridge с совет., Res. Vet. Sci. 33:188 (1982), обнаружил неполную защиту против колонизации легких Mycoplasma hyopneumoniae при введении живой вакцины внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно. Kristensen с coaem., Am. J. Vet. Res. 42:784 (1981), не обнаружил защиты свиней от микоплазменной пневмонии после инъекции инактивированной нагреванием Mycoplasma hyopneumoniae. Ross с соавт., Am. J. Vet. Res. 45:1899 (1984), обнаружил, что применение экстрактов Mycoplasma hyopneumoniae, приготовленных посредством процедуры замораживания-оттаивания для иммунизации свиней, обеспечивало только непостоянную защиту, и в некоторых случаях у иммунизированных свиней отмечали повышенное развитие поражений. Эти исследователи также изучали цельно-клеточную вакцину, полученную путем инактивации формалином. Инактивация формалином значительно уменьшает защитную иммуногенность Mycoplasma hyopneumoniae, и такая вакцина не является эффективной. Yoshioka с соавт., патент США № 3917819 (выданный 4 ноября 1975 г.) раскрыл некоторые убитые вакцины против микоплазмы, содержащие микоплазму, инактивированную формалином, включая инактивированную вакцину против Mycoplasma hyopneumoniae. В европейской патентной публикации 571648 Chung-Nan раскрыл вакцину против М.hyopneumoniae, основанную на высоко пролиферативном и антигенном штамме PRIT-5.

Вакцины, основанные на инактивированных вирулентных штаммах Mycoplasma hyopneumoniae, имеются в продаже. Fort Dodge Animal Health (FDAH) продает бактерии Mycoplasma hyopneumoniae под названием Suvaxyn® и Respifend® Mycoplasma hyopneumoniae для применения в качестве вакцины для защиты здоровых свиней против клинических признаков, вызванных Mycoplasma hyopneumoniae. Этот бактерии рекомендуют в качестве двухдозовой вакцины для поросят в возрасте по меньшей мере одной недели, с применением второй дозы через две или три недели после первой вакцинации.

Штамм J М.hyopneumoniae является непатогенным штаммом с ограниченной способностью прикрепляться к ресничкам эпителия свиньи и, следовательно, вызывать заболевание. Castro et at., Veterinary Microbiology 116:258-269 (2006) и Vasconcelos et al., J. Bacteriol. 187(16):5568-5577 (2005) (описывающие полную геномную последовательность штамма J М.hyopneumoniae (ATCC 25934)). Сравнения геномов патогенных и непатогенных штаммов (штамм J) выявили различия в поверхностных белках, включая адгезин ресничек эпителия, который, как считают, является определяющим соответствующие патогенные свойства у штаммов М.hyopneumoniae. Vasconcelos et al. (2006) и Djordjevic et al., Infection and Immunity 72(5):2791-2802 (2004).

М. hyopneumonia экспрессирует на своей клеточной поверхности мембранные липопротеины, в частности, белки Р46, Р65 и Р97, которые несут видоспецифические антигенные детерминанты. Недавно Bouh с соавт. описал моноклональные антитела к Р46 и Р65 живого авирулентного эталонного штамма J М.hyopneumoniae ATCC 25934. Clin. Diag. Lab. Immunology 10(3):459-468 (2003). Blank и Stemke описали физическую и генетическую карту генома штамма J М.hyopneumoniae, Can. J. Microbiol. 46:832-840 (2000), a Wilton с соавт. описал скрининг экспрессирующих библиотек, полученных из непатогенного штамма J М.hyopneumoniae, и скрининг этих библиотек с помощью свиной гипериммунной сыворотки против М.hyopneumoniae.

Существует необходимость в композициях, включая иммуногенные или вакцинные композиции, полученных из живой адъювантной авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, которые обеспечивают эффективность против вирулентных штаммов М.hyopneumoniae. Упоминание какой-либо ссылки в данной заявке не следует рассматривать, как признание факта, что такая ссылка пригодна в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложены композиции, включая иммуногенные композиции или вакцинные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae и биологически приемлемый адъювант. Композиции, раскрытые в данной заявке, вызывают иммунный ответ против Mycoplasma hyopneumoniae, таким образом предупреждая и/или уменьшая тяжесть заболевания, вызванного этим организмом, или облегчая по меньшей мере один симптом, ассоциированный с этим заболеванием.

Соответственно, в одном аспекте изобретения предложена композиция для индукции иммунного ответа против Mycoplasma hyopneumoniae у животного, содержащая иммунологически эффективное количество живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae и биологически приемлемый адъювант.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 90%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 95%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 99%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 70%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 85%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 95%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений процент гомологии живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae, используемого в композиции, описанной в данной заявке, определяют путем сравнения с авирулентным эталонным штаммом J с номером доступа АТСС 25934 (номер доступа в GenBank АЕ 017243) или 27715. В некоторых других воплощениях эталонный штамм может быть вирулентным штаммом, например, имеющим номера доступа АТСС 25617 или 25095.

В одном из воплощений процент полиморфной идентичности живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae, используемого в композициях, описанных в данной заявке, определяют путем сравнения с авирулентным эталонным штаммом J с номером доступа АТСС 25934 или 27715. В некоторых других воплощениях эталонный штамм может быть вирулентным штаммом, например, с номером доступа АТСС 25617 или 25095.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, используемый в композициях, описанных в данной заявке, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 25934 или 27715.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, используемый в композициях, описанных в данной заявке, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 27715.

В одном из воплощений иммунный ответ, вызванный живым авирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae, защищает животное против инфекции или уменьшает тяжесть по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией вирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae.

В одном из воплощений введение животному одной дозы адъювантной живой авирулентной композиции М.hyopneumoniae, раскрытой в данной заявке, является эффективным в обеспечении иммунитета у животного против инфекции Mycoplasma.

В одном из воплощений введение животному двух доз адъювантной живой авирулентной композиции М.hyopneumoniae, раскрытой в данной заявке, является эффективным в обеспечении иммунитета у животного против инфекции Mycoplasma.

Адъювантная живая авирулентная вакцинная композиция против Mycoplasma hyopneumoniae, раскрытая в данной заявке, может быть использована соответственно для применения у свиней против инфекции и заболевания, вызванного Mycoplasma hyopneumoniae, и найдет применение в контроле и/или предупреждении распространения инфекции и заболевания, вызванного Mycoplasma hyopneumoniae, в популяции свиней.

Таким образом, в иммуногенных композициях и вакцинных композициях по настоящему изобретению используют одну или более чем одну живую авирулентную Mycoplasma hyopneumoniae в комбинации с одним или более чем одним адъювантом, таким как биологически приемлемый адъювант.Биологически приемлемый адъювант возможно может представлять собой один или более адъювантов, выбранных из группы, состоящей из SP-масла, SL-CD, полимера акриловой кислоты (такого как Carbopol®, Noveon, Inc., Cleveland, ОН) и смеси метаболизируемого масла, такого как один или более ненасыщенных терпеновых углеводородов, например сквален или сквалан, и полиоксиэтилен-полипропиленового блоксополимера, такого как Pluronic® (BASF, Florham Park, New Jersey).

Концентрация адъюванта, используемого в композиции, описанной в данной заявке, будет зависеть от природы адъюванта. Адъюванты, как правило, находятся в композициях, описанных в данной заявке, в конечной концентрации примерно 1-50% (об./об.) и более типично в конечной концентрации примерно 10%, 15%, 20%, 25% или 30% (об./об.). В композициях, содержащих SP-масло, адъювант типично присутствует в концентрации от примерно 1% до примерно 25% (об./об.), более типично от примерно 5% до примерно 15% (об./об.), такой как, например, примерно 10% (об./об.). В композициях, содержащих полимер акриловой кислоты и смесь метаболизируемого масла, которая содержит один или более терпеновых углеводородов и полиоксиэтилен-полипропиленовый блоксополимер, отношение полимера акриловой кислоты к смеси метаболизируемого масла/полиоксиэтилен-полипропиленового блоксополимера обычно представляет собой соотношение от примерно 1:25 до примерно 1:50 и обычно в конечной концентрации от примерно 1% до примерно 25% (об./об.).

В одном из воплощений биологически приемлемый адъювант содержит SP-масло. В одном из воплощений SP-масло присутствует в концентрации от примерно 1% до примерно 25% об./об. В одном из воплощений SP-масло присутствует в концентрации от примерно 5% до примерно 15% об./об. В одном из воплощений SP-масло присутствует в концентрации примерно 10% об./об.

В некоторых воплощениях композиции, раскрытые в данной заявке, можно использовать в дополнительной комбинации с одной или более другими живыми бактериями, бактерином, анатоксином и/или вирусным антигеном. Таким образом, в некоторых аспектах этих воплощений адъювантная живая авирулентная композиция М.hyopneumoniae может содержать иммунологически эффективное количество живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae и один или более биологически приемлемых адъювантов в дополнительной комбинации с (а) одной или более живыми бактериями; (б) одним или более чем одним бактерином; (в) одним или более чем одним очищенным анатоксином из одного или более патогенов, таких как, например, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae и бактерии лептоспира; и/или (г) одним или более чем одним вирусным антигеном, где вирус выбран из группы, состоящей из вируса свиного гриппа (SIV), вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), поксвируса енота, экспрессирующего PRRS и/или другие антигены, TGEV (вирус трансмиссивного гастроэнтерита), экспрессирующего PRRS и/или другие антигены, и свиного цирковируса (PCV). В некоторых аспектах этих воплощений в качестве примера в данной заявке представлены композиции, включая иммуногенные композиции или вакцинные композиции, в которых используют в дополнительной комбинации химерную модифицированную живую вакцину против свиного цирковируса типа 1-типа 2 (cPCV1-2). В рамках этих или альтернативных воплощений композиции, включая иммуногенные или вакцинные композиции, могут дополнительно или возможно включать консервант и стабилизатор, такой как, например, SGGK, тимеросал и/или EDTA.

Концентрация таких других живых бактерий, бактерина, анатоксина и/или вирусного антигена, используемых в композиции, описанной в данной заявке, будет зависеть от природы живых бактерий, бактерина, анатоксина и/или вирусного антигена и, как правило, присутствуют в композициях, описанных в данной заявке. Для таких композиций, где другой антиген является бактериальным, бактерии, как правило, присутствуют в конечной концентрации от примерно 0,5×10 ⁵ до 0,5×10¹⁰ на миллилитр. Альтернативно, бактерии присутствуют в конечной концентрации от примерно 0,5×10 ⁶ до 0,5×10⁹ на миллилитр или в конечной концентрации от примерно 0,5×10⁷ до 0,5×10 ⁸ на миллилитр.

Во втором аспекте изобретения предложены способы индукции иммунного ответа на Mycoplasma hyopneumoniae или защиты животного от заболевания, вызванного Mycoplasma hyopneumoniae, и/или предупреждения или смягчения вспышки такого заболевания среди популяций животных путем введения адъювантной живой авирулентной композиции Mycoplasma hyopneumoniae, как описано в данной заявке. В родственном аспекте в настоящем изобретении также предложены способы усиления имунного ответа на Mycoplasma hyopneumoniae. Такие способы включают стадии введения животному, такому как свинья, одной или двух доз композиции, содержащей один или более адъювантный живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую примерно 90%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую примерно 95%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую примерно 99%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 70%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 85%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 95%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, используемый в способах по изобретению, как описано в данной заявке, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 25934 или 27715.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, используемый в способах по изобретению, как описано в данной заявке, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 27715.

В одном из воплощений в изобретении предложен способ усиления иммунного ответа на Mycoplasma hyopneumoniae, включающий стадии:

а) сначала введение животному первой иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae с добавлением биологически приемлемого адъювантного материала; и

б) затем введение животному второй иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae с добавлением в качестве адъюванта биологически приемлемого адъювантного материала.

В некоторых воплощениях, в зависимости от точного предполагаемого применения, композиции могут быть введены парентерально, например, посредством внутримышечной, подкожной или внутрибрюшинной инъекции или местного нанесения крема. Альтернативно, композиции могут быть введены посредством аэрозоля, интраназальным или пероральным путями, такими как интраназальный спрей или пероральное введение посредством ручной подачи или массового применения.

В третьем аспекте изобретения предложено применение штаммов Mycoplasma hyopneumoniae, описанных в данной заявке, и композиций, содержащих эти штаммы, для изготовления лекарственного средства для лечения животного, страдающего от заражения Mycoplasma hyopneumoniae или страдающего по меньшей мере от одного симптома, ассоциированного с заражением Mycoplasma hyopneumoniae.

Эти и другие воплощения, признаки и преимущества изобретения станут очевидными из подробного описания и прилагаемой формулы изобретения, изложенной в данной заявке ниже. Все патенты, заявки на патенты и другая литература, упомянутые в данной заявке, таким образом включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае несоответствия настоящее изобретение будет иметь приоритетное значение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Прежде чем способы по настоящему изобретению и методология лечения будут описаны, следует понять, что это изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в данной заявке, предназначена только для описания конкретных воплощений и не является исчерпывающей.

Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя множественные значения, если контекст ясно не указывает на иное. Таким образом, например, ссылки на "способ" включают один или более способов, и/или стадий типа, описанного в данной заявке, и/или которые будут очевидны для специалистов в данной области техники при чтении этого описания и так далее.

Соответственно, в настоящей заявке могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК в пределах данной области техники. Такие методы исчерпывающе описаны в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (здесь "Sambrook et al., 1989"); DAM Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); В. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Хотя какие-либо способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данной заявке, могут быть использованы на практике при тестировании изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Все публикации, упомянутые в данной заявке, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термины, используемые в данной заявке, имеют значения, узнаваемые и известные специалистам в данной области техники, однако, для удобства и полноты конкретные термины и их значения приведены ниже.

Термин "примерно" или "приблизительно" означает статистически значимый диапазон значения. Такой диапазон может находиться в пределах порядка величины, типично 50%, более типично 20%, еще более типично 10% и еще более типично 5% от заданного значения или диапазона. Допустимое изменение, подпадающее под термин "примерно" или "приблизительно", зависит от конкретной системы при исследовании и может быть легко оценено средним специалистом в данной области техники.

"Адъювант" означает композицию, состоящую из одного или более веществ, которые усиливают антигенность живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae в композиции, как правило, в вакцинной композиции. Адъювант может служить в качестве депо в ткани, которое медленно высвобождает антиген, а также в качестве активатора лимфоидной системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood et al., Immunology, Second Ed., Menio Park, CA: Benjamin/Cummings, 1984. p.384). Часто первичная вакцинация одним антигеном, в отсутствие адъюванта, не будет вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ.Адъюванты включают, но не ограничиваются этим, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидрат окиси алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, pluronic полиолы, полианионы, пептиды, масляные или углеводородные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки и потенциально полезные человеческие адъюванты, такие как N-ацетил-мурамил-1--треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-1_-аланил-D-изоглутамин, N-ацетил-мурамил-1--аланил-D-изоглутаминил-1--аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин, BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Предпочтительно, адъювант является биологически приемлемым.

Адъюванты, используемые в композициях, описанных в данной заявке, являются, как правило, "биологически приемлемыми адъювантами" и, таким образом, могут быть использованы в комбинации с живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, так что полученные композиции могут быть введены животному in vivo без сопутствующей токсичности. В данной заявке в качестве примера приведены композиции, содержащие живую авирулентную Mycoplasma hyopneumoniae в комбинации с одним или более чем одним биологически приемлемлемым адъювантом, выбранным из группы, состоящей из SP-масла, SL-CD, карбопола и смеси метаболизируемого масла, такого как один или более ненасыщенных терпеновых углеводородов, например сквален или сквалан, и полиоксиэтилен-полипропиленового блоксополимера, такого как Pluronic®.

Живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae или молекула из него являются "антигенными", когда они способны специфически взаимодействовать с антигенраспознающей молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или Т-клеточный антигенный рецептор. Как правило, антигенная молекула представляют собой полипептид или его вариант, который содержит "эпитоп" из по меньшей мере примерно пяти и, как правило по меньшей мере из примерно 10 аминокислот.Антигенная область полипептида, также названная в данной заявке "эпитопом", может представлять собой такую область, которая является иммунодоминантной для распознавания антителом или Т-клеточным рецептором, или она может представлять собой область, используемую для образования антитела к молекуле посредством конъюгирования антигенной области с полипептидом-носителем для иммунизации. Молекуле, которая является антигенной, не нужно самой быть иммуногенной, т.е. способной вызывать иммунный ответ без носителя.

Термин "по меньшей мере" означает не менее чем.

Как использовано в данной заявке, "бактерии" представляет собой бактериальный сбор, который был инактивирован и который, в комбинации с некоторыми адъювантами, может вызывать защитный иммунитет для защиты против заболевания или инфекции при введении животным.

Полимеры акриловой кислоты представляют собой, как правило, карбомеры. Карбомеры имеются в продаже под товарным знаком "Карбопол" и описаны, например, в патентах США № № 2909462 и 3790665, каждый из которых включен в данную заявку посредством ссылки.

Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту, стабилизатору, консерванту и/или наполнителю, с которым вводят соединение или композицию. Такие носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая вазелин, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода или водные солевые растворы, например, забуференный фосфатами физиологический раствор, растворы Рингера и водные растворы глюкозы и глицерина, часто используют в качестве носителей, в частности, для инъецируемых растворов. Носитель или разбавитель не должны быть токсичными и не должны влиять на биологическую активность антигена/иммуногена. Другие дополнительные вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, поверхностно-активные вещества, pH буферные вещества и тому подобные, также могут быть использованы в композициях по изобретению. Консерванты могут включать, например, тимеросал и/или EDTA. Подходящие фармацевтические носители описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" E.W. Martin, 18^е издание. Широкое разнообразие носителей хорошо известно в данной области техники, и выбор конкретных носителей находится в пределах квалификации специалистов в данной области техники.

Термин "колониеобразующая единица" или "КОЕ" представляет собой единицу измерения, используемую для указания числа организмов, способных реплицироваться в данном образце. Это основано на теории, что колония образуется в результате репликации пары/кластера или одиночной клетки бактерии.

"Иммунологически эффективное количество" представляет собой количество живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, которое будет вызывать иммунный ответ против Mycoplasma hyopneumoniae. "Иммунологически эффективное количество" будет зависеть от вида, породы, возраста, размера, состояния здоровья животного-реципиента и будет находиться под влиянием предварительной экспозиции животного с одним или более чем одним штаммом Mycoplasma hyopneumoniae, независимо от того является ли этот один или более чем один штамм вирулентным штаммом или авирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae. Как использовано в данной заявке, "Иммунологически эффективное количество" живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, при использовании в комбинации с подходящим адъювантом, представляет собой такое количество Mycoplasma hyopneumoniae, которое является достаточным для того, чтобы усилить иммуногенность живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, и, таким образом, обеспечивает защитный иммунитет против контрольного заражения вирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae. В одном из воплощений Иммунологически эффективное количество представляет собой минимум примерно 1×10 ³ организмов. В одном из воплощений Иммунологически эффективное количество варьирует в диапазоне от примерно 1×10³ колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл) до примерно 1×10 ¹¹ КОЕ/мл. В одном из воплощений Иммунологически эффективное количество составляет примерно 5×10 ⁷ КОЕ/мл.

Как использовано в данной заявке, термин "иммуногенный" означает, что живая авирулентная Mycoplasma hyopneumoniae способна вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ. Иммуногенный штамм также является антигенным. Иммуногенная композиция представляет собой композицию, которая вызывает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ при введении животному.

Термин "иммуногенная композиция" относится к любой фармацевтической композиции, содержащей антиген, например микроорганизм, которая может быть использована для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Иммунный ответ может включать Т-клеточный ответ, В-клеточный ответ, или как Т-клеточный, так и В-клеточный ответ.Композиция может способствовать сенсибилизации млекопитающего посредством презентации антигена, ассоциированного с молекулами МНС на клеточной поверхности. Кроме того, антигенспецифические Т-лимфоциты или антитела могут быть получены для обеспечения будущей защиты иммунизированного хозяина. "Иммуногенная композиция" может содержать живую, ослабленную или убитую/инактивированную вакцину, содержащую целый микроорганизм или полученную из него иммуногенную область, которая индуцирует либо клеточно-опосредованный (Т-клеточный) иммунный ответ или антитело-опосредованный (В-клеточный) иммунный ответ, или и тот и другой, и может защищать животное от одного или более симптомов, ассоциированных с инфекцией микроорганизмом, или может защищать животное от смерти, вызванной инфекцией микроорганизмом.

Как использовано в данной заявке, термин "выделенный" означает, что упомянутый материал удален из его природного окружения. Таким образом, выделенный биологический материал может быть свободен от некоторых или всех клеточных компонентов, т.е. компонентов клеток, в которых природный материал встречается естественным образом (например, цитоплазматический или мембранный компонент). Материал является выделенным, если он присутствует в клеточном экстракте или супернатанте. Выделенный белок может быть ассоциирован с другими белками или нуклеиновыми кислотами, или и теми и другими, с которыми он ассоциирован в клетке, или с клеточными мембранами, если он является мембраносвязанным белком. Выделенную органеллу, клетку или ткань удаляют из участка локализации, в котором она обнаруживается в организме. Выделенный материал может быть, но не обязательно, очищен.

Как использовано в данной заявке, термин "MHDCE" означает клеточные эквиваленты ДНК Mycoplasma hyopneumoniae и определяется как единица измерения, используемая для определения приблизительного количества организмов Mycoplasma hyopneumoniae, присутствующих в данном образце.

Термин "парентеральное введение", как использовано в данной заявке, означает введение посредством некоторых других способов, а не через желудочно-кишечный тракт, в частности, посредством введения веществ в организм внутривенным, подкожным, внутримышечным путем, или посредством интрамедуллярной инъекции, а также другие непероральные и неинтраназальные пути введения, такие как внутрибрюшинная инъекция и метеное применение.

Термин "полиморфная идентичность с эталонным штаммом J" относится к сходству между профилем белковой экспрессии одного не-J штамма Mycoplasma hyopneumoniae с эталонным штаммом J Mycoplasma hyopneumoniae. Полиморфная идентичность может быть основана на одной или более характеристиках одного или более белков, включая, но не ограничиваясь этим, например, количество или размер одного или более белков исследуемого микроорганизма Mycoplasma hyopneumoniae, скорость седиментации одного или более белков, или изменения физических или биохимических характеристик одного или более белков. Данный термин также может включать сходство между нуклеотидными последовательностями, которые кодируют любые один или более белов одного не-J штамма Mycoplasma hyopneumoniae и эталонного штамма J Mycoplasma hyopneumoniae, и включает любые мутации в этих последовательностях, включая делеции или замены. Изменение в нуклеотидной и аминокислотной последовательности представляет собой изменение, которое обеспечивает сохранение авирулентной природы организма Mycoplasma hyopneumoniae. В данной области техники хорошо известен широкий спектр анализов для наблюдения за перестройками в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях. Например, размер и структуру нуклеиновокислотной или аминокислотной последовательностей исследуют с помощью нозерн-, саузерн-, вестерн-, SDS-PAGE (полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия) ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) профилирования, протоколов ПЦР и секвенирования ДНК, хорошо известных специалистам в данной области техники (см., например, Calus, D. et al. Veterinary Microbiology, Vol.120, Issues 3-4, March 10, 2007, pages 284-291; Scarman, AL, et al. Microbiology (1997), Vol.143: 663-673). Кроме того, другие методы наблюдения за перестройками в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, такие как анализ однонитевого конфирмационного полиморфизма, хорошо известны в данной области техники (см., например, патент США № 5382510, опубликованный 7 сентября 1999 г., и патент США № 5952170, опубликованный 17 января 1995 г.).

Термин "очищенный", как использовано в данной заявке, относится к веществу, который был выделен при условиях, которые уменьшают или устраняют присутствие чужеродных веществ, т.е., загрязняющих веществ, включая природные вещества, из которых данное вещество получено. Например, очищенные бактерии или белок, как правило, по существу, свободны от клеток хозяина или культуральных компонентов, включая тканевую культуру или яичные белки, неспецифические патогены и тому подобное. Как использовано в данной заявке, термин "по существу свободный" используют в порядке и в контексте аналитического тестирования материала. Как правило, очищенный материал, по существу свободный от загрязняющих веществ, является по меньшей мере на 50% чистым; более типично по меньшей мере на 90% чистым и еще более типично по меньшей мере на 99% чистым. Чистота может быть оценена посредством хроматографии, гель-электрофореза, иммуноанализа, анализа состава, биологического анализа и других способов, известных в данной области техники. Способы очистки хорошо известны в данной области техники. Термин "по существу чистый" указывает на самую высокую степень чистоты, которая может быть достигнута при использовании стандартных методов очистки, известных в данной области техники.

"Эталонный штамм" относится к штамму микроорганизма, например, Mycoplasma hyopneumoniae, который получен из надежного источника и который может быть использован в качестве контрольного штамма, с которым можно сравнивать другие неустановленные или неизвестные культуры. В настоящем изобретении эталонные штаммы Mycoplasma hyopneumoniae могут представлять собой авирулентные штаммы J, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС) и получившие номера доступа АТСС 25934 и 27715. В настоящем изобретении эти "эталонные штаммы", имеющие номера доступа АТСС 25934 или 27715, также использовали для получения иммуногенных композиций по изобретению. В некоторых других воплощениях настоящего изобретения эталонные штаммы Mycoplasma hyopneumoniae могут быть получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС) и обозначены под номерами доступа АТСС 25617 и 25095.

Термин "SL-CD" относится к сульфолипо-циклодекстрину, который входит в семейство циклодекстриновых адъювантов, описанных в патентах США № № 6610310 и 6165995. Как правило, SL-CD готовят в виде смеси с метаболизируемым маслом, таким как один или более ненасыщенных терпеновых углеводородов, например сквалан, и предпочтительно с неионным поверхностно-активным веществом, таким как полиоксиэтиленсорбитан моноолеат.

Термин "SP-масло" относится к адъюванту, который представляет собой масляную эмульсию, содержащую: от 1% до 3% об./об. полиоксиэтилен-полиоксипропиленового блоксополимера; от 2% до 6% об./об. сквалана; от 0,1% до 0,5% об./об. полиоксиэтиленсорбитана моноолеата; и забуференный раствор соли.

Термины "вакцина" или "вакцинная композиция", которые используются взаимозаменяемо, относятся к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одну иммуногенную композицию, которая индуцирует иммунный ответ у животного. Вакцина или вакцинная композиция может защищать животное от заболевания или возможной смерти вследствие инфекции и может включать или не включать один или более дополнительных компонентов, которые усиливают иммунологическую активность активного компонента. Вакцина или вакцинная композиция также может включать дополнительные компоненты, типичные для фармацевтических композиций. Вакцина или вакцинная композиция также может включать дополнительные компоненты, типичные для вакцин или вакцинных композиций, включая, например, адъювант или иммуномодулятор. Иммуногенно активный компонент вакцины может содержать целые живые организмы либо в их первоначальной форме, либо в виде ослабленных организмов в модифицированной живой вакцине, либо организмов, инактивированных соответствующими способами в убитой или инактивированной вакцине, либо субъединичные вакцины, содержащие один или более иммуногенных компонентов вируса, или генетически сконструированные, мутантные или клонированные вакцины, полученные способами, известными специалистам в данной области техники. Вакцина или вакцинная композиция может содержать один или одновременно более чем один из элементов, описанных выше.

Как использовано в данной заявке, "вирулентный" относится к способности штамма Mycoplasma hyopneumoniae вызывать заболевание, ассоциированное с инфекцией Mycoplasma hyopneumoniae. Вирулентность может быть оценена путем, наблюдения за развитием заболевания у животного. Примером "вирулентного" штамма Mycoplasma hyopneumoniae является штамм, приведенный в качестве примера штамма для контрольного заражения Mycoplasma hyopneumoniae, как описано и использовано в настоящем изобретении. Другие вирулентные штаммы Mycoplasma hyopneumoniae доступны из Американской коллекции типовых культур (АТСС), обозначенные как штамм № 25617 или 25095. Термин "авирулентный" относится к штаммам Mycoplasma hyopneumoniae, которые лишены вирулентности. То есть, авирулентные штаммы, изоляты или конструкции являются непатогенными и не способны вызывать заболевание. Как использовано в данной заявке, термин "авирулентный" используют как синоним термина "невирулентный". В качестве примера в данной заявке приведены композиции, в которых используют авирулентную живую культуру штамма J M. hyopneumoniae (РСХ3-Линия 1, который доступен из Американской коллекции типовых культур (АТСС) в виде штамма № 27715). Другой "авирулентный" штамм, который также доступен из АТСС, обозначен как штамм № 25934. Штамм J с номером доступа АТСС 27715 клонировали из родительского штамма J с номером доступа АТСС 25934, как описано в каталоге АТСС.

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что однодозовый или двухдозовый режимы введения композиции Mycoplasma hyopneumoniae, включая иммуногенную композицию или вакцинную композицию, с использованием одной или более живых авирулентных Mycoplasma hyopneumoniae, таких как, например, штамм J (РСХ3-Линия 1; номер доступа в АТСС № 27715) и одного или более чем одного адъюванта, как правило биологически приемлемого адъюванта, являются эффективным в защите против и/или предупреждении или смягчении заболевания, ассоциированного с инфекцией вирулентной Mycoplasma hyopneumoniae.

В одном из воплощений другие живые авирулентные штаммы Mycoplasma hyopneumoniae, включая, но не ограничиваясь этим, штаммы J, геном которых содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 90%-ную гомологию, или по меньшей мере примерно 95%-ную гомологию, или по меньшей мере 99%-ную гомологию с эталонным штаммом J, предусмотрены для применения в композициях и способах по настоящему изобретению.

В одном из воплощений другие живые авирулентные штаммы Mycoplasma hyopneumoniae, включая, но не ограничиваясь этим, штаммы J, которые имеют по меньшей мере примерно 70%-ную полиморфную идентичность, или по меньшей мере примерно 85%-ную полиморфную идентичность, или по меньшей мере примерно 95%-ную полиморфную идентичность с этим параметром у эталонного штамма J, предусмотрены для применения в композициях и способах по настоящему изобретению.

Эталонный штамм J может быть выбран из штаммов Mycoplasma hyopneumoniae с номером доступа АТСС 25934 или 27715.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм J, используемый в композициях и способах по настоящему изобретению, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 25934 или 27715.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм J, используемый в композициях и способах по настоящему изобретению, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 27715.

В данной заявке раскрыто, что композиции, включая вакцинные композиции, в которых используют один или более живых авирулентных штаммов Mycoplasma hyopneumoniae в дополнительной комбинации с химерной модифицированной живой вакциной против свиного цирковируса типа 1-типа 2 (cPCV1-2) (см. патентную публикацию США № 2003/0170270 и № 2004/0253270), также являются эффективными в защите против и/или предупреждении или смягчении заболевания, ассоциированного с инфекцией вирулентной Mycoplasma hyopneumoniae и/или инфекцией вирулентным свиным цирковирусом.

В некоторых воплощениях композиции по изобретению дополнительно содержат одну или более живых бактерий, бактерин и/или один или более чем один очищенный анатоксин, выбранный из группы, состоящей из Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae и бактерий лептоспира.

В некоторых воплощениях композиции по изобретению дополнительно содержат один или более чем один вирусный антиген, выбранный из группы, состоящей из антигена вируса свиного гриппа (SIV), антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), поксвируса енота, экспрессирующего PRRS или другие антигены, TGEV, экспрессирующего PRRS или другие антигены, и антигена свиного цирковируса (PCV).

В некоторых воплощениях настоящее изобретение описано ниже со ссылкой на защиту от инфекции гомогенатом легких, обозначенным как LI-34, содержащим вирулентный штамм 11 Mycoplasma hyopneumoniae (См. J. Clin. Microbiol. 1999 Mar; 37(3):620-7. Однако предполагается, что композиции, раскрытые в данной заявке, будут эффективны в защите и/или предупреждении или смягчении заболевания или по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с заболеванием, которые ассоциированы с широким спектром вирулентных инфекций Mycoplasma hyopneumoniae. Многочисленные вирулентные изоляты Mycoplasma hyopneumoniae известны в данной области техники и доступны из различных источников, включая Американскую коллекцию типовых культур, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852. Примеры этих вирулентных штаммов включают, но не ограничиваются этим, номера доступа АТСС 25095, 27714 и 25617.

Композиции, в частности, иммуногенные композиции или вакцинные композиции по настоящему изобретению, могут быть получены из лиофилизированных или свежеполученных культур живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae посредством одного или более способов, которые легко доступны в данной области техники. В качестве примера в данной заявке приведены композиции, содержащие живой авирулентный штамм J М.hyopneumoniae (РСХ3-линия 1), который доступен под номером доступа АТСС 27715 (профильтрованный и клонированный 3 раза изолят под номером АТСС 25934).

Живую авирулентную Mycoplasma hyopneumoniae можно культивирована соглано методике, описанной в патентах США № № 5338543 и 5565205, каждый из которых включен в данную заявку во всей своей полноте. Более конкретно, Mycoplasma hyopneumoniae может быть размножена в культуральной среде, такой как полная среда PPLO (плевропневмония-подобный организм) (Difco; Becton Dickinson and Company, San Jose, California). Рост организма контролируют стандартными методами, такими как определение единиц изменения цвета (CCU), и собирают клетки при достижении достаточно высокого титра. Концентраты могут быть дополнительно концентрированы или лиофилизированы стандартными способами перед включением в препараты. Также могут быть использованы другие методы, описанные в Thomas et al., Agri-Practice 7(5):26-30.

Условия, при которых выращивают изолят Mycoplasma hyopneumoniae, могут варьироваться в зависимости от определенной композиции среды и конкретного выращиваемого изолята. Изоляты Mycoplasma hyopneumoniae, как правило, выращивают в течение от примерно 48 часов до примерно 144 часов, как измерено от времени начала инкубации до времени сбора.

В зависимости от определенной композиции, подлежащей приготовлению в виде препарата, Mycoplasma hyopneumoniae может быть сконцентрирована, например, путем ультрацентрифугирования или ультрафильтрации. Концентрированная Mycoplasma hyopneumoniae может быть восстановлена посредством способа, известного в данной области техники, и может быть смешана с подходящим физиологически приемлемым носителем, типично водной средой, такой как, например, забуференный фосфатами физиологический раствор (PBS), минимальная поддерживающая среда (MEM) или MEM с буфером HEPES. Она может быть дополнительно объединена с соответствующим адъювантом для обеспечении желаемой концентрация из расчета объема на объем (об./об.). Композиции также могут содержать один или более чем один хелатирующий агент, например EDTA, как правило, в концентрации от примерно 0,05% до примерно 0,20% (масс./об.). Альтернативно, штамм Mycoplasma hyopneumoniae, используемый в иммуногенной или вакцинной композициях может быть сконцентрирован, как описано выше, или лиофилицирован и ресуспендирован в соответствующем адъюванте при желаемой концентрации из расчета массы на объем (масс./об.).

Как указано выше, композиции, включая иммуногенные композиции или вакцинные композиции по настоящему изобретению, обычно содержат живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae в комбинации с одним или более чем одним адъювантом, как правило, биологически приемлемым адъювантом.

При однодозовом введении композиции могут содержать количество живой авирулентной Mycoplasma pneunomoniae, соответствующее примерно 1×10⁸-3×10¹¹ MHDCE/мл. Альтернативно, композиции могут содержать количество живой авирулентной Mycoplasma pneunomoniae, соответствующее примерно 1×10⁹-3×10 ⁹ MHDCE/мл. Композиции приготовлены в виде препаратов таким образом, чтобы каждая вводимая доза находилась в пределах от примерно одного (1) мл до примерно пяти (5) мл или в пределах от примерно двух (2) мл на животное при внутримышечном, подкожном или внутрибрюшинном введении и в пределах от примерно одного (1) до примерно десяти (10) мл или от примерно двух (2) до примерно пяти (5) мл при пероральном или интраназальном введении.

При двухдозовом введении композиции типично содержат количество живой авирулентной Mycoplasma pneunomoniae от примерно 1×10 ⁸ до примерно 3×10¹¹ MHDCE/мл, более типично от примерно 1×10⁹ до примерно 3×10⁹ MHDCE/мл. В некоторых воплощениях для двухдозового введения композиции могут содержать количество живой авирулентной Mycoplasma pneunomoniae, содержащее от примерно 10 ³ КОЕ/мл до 10¹¹ КОЕ/мл. Композиции приготовлены в виде препаратов таким образом, что каждая вводимая доза будет находиться в пределах от примерно одного (1) мл до примерно пяти (5) мл, предпочтительно примерно двух (2) мл на животное при внутримышечном, подкожном или внутрибрюшинном введении и от примерно одного (1) до примерно десяти (10) мл, типично от примерно двух (2) до примерно пяти (5) мл при пероральном или интраназальном введении.

Адъювантная смесь для применения в иммуногенных композициях и вакцинных композициях по настоящему изобретению усиливает иммунный ответ путем стимуляции клеточно-опосредованного и/или локального (секреторный IgA) иммунных ответов. Биологически приемлемый адъювант может представлять собой, например, один или более чем один адъювант, выбранный из группы, состоящей из SP-масла, SL-CD, полимера акриловой кислоты (такого как карбопол) и смеси метаболизируемого масла, такого как один или более ненасыщенных терпеновых углеводородов, например сквален или сквалан, и полиоксиэтилен-полипропиленового блоксополимера, такого как Pluronic®. Адъюванты также могут быть выбраны из цитокинов, таких как IL-12 и IL-18; гидрата окиси алюминия; сополимера этилена и малеиновой кислоты; DEAE декстрана; адъюванта, происходящего из стенок микобактерий, и тому подобного.

Концентрация адъюванта, используемого в композиции, описанной в данной заявке, зависит от природы адъюванта. Адъюванты обычно присутствуют в композиции, описанной в данной заявке, в конечной концентрации примерно 1-50% и более типично в конечной концентрации примерно 10%, 15%, 20%, 25% или 30%. Концентрация антигена в адъюванте может быть получена из расчета массы на объем (масс./об.) или из расчета объема на объем (об./об.). Например, антиген, доставляемый в композициях по изобретению, может быть получен в лиофилизированной форме, с последующим растворением в адъюванте с тем, чтобы непосредственно получить указанные концентрации из расчета массы на объем. Альтернативно, антиген может быть сначала растворен в соответствующем разбавителе (например, буфере), к которому затем добавляют адъювант в объеме, достаточном для достижения конечной желаемой концентрации как антигена, так и адъюванта из расчета объема на объем, как описано выше.

В некоторых воплощениях адъювант может быть введен вместе с антигеном/иммуногеном в виде единой композиции или может быть введен до, одновременно или после введения антигена/иммуногена.

Выбор адъюванта зависит от стабильности антигена/иммуногена, содержащего адъювант, способа введения, режима дозирования, эффективности адъюванта для вакцинируемых видов и также должен быть одобрен для применения на животных и людях соответствующими регулирующими органами.

В композициях, содержащих SP-масло, адъювант типично присутствует в пределах от примерно 1% до примерно 25% (об./об.), более типично от примерно 5% до примерно 15% (об./об.), например, примерно 10% (об./об.); в композициях, содержащих полимер акриловой кислоты и смесь метаболизируемого масла, которая содержит один или более терпеновых углеводородов и полиоксиэтилен-полипропиленовый блок-сополимер, отношение полимера акриловой кислоты к смеси метаболизируемого масла/полиоксиэтилен-полипропиленового блок-сополимера типично составляет от примерно 1:25 до примерно 1:50. Метаболизируемое масло, полиоксиэтилен-полипропиленовый блок-сополимер и полимер акриловой кислоты могут быть использованы в форме эмульсии масло-в-воде, где полимеры акриловой кислоты типично используют в концентрации от примерно 0,5 г/л до примерно 10 г/л; метаболизируемые масла типично используют в концентрации от примерно 2 мл/л до примерно 6 мл/л; и полиоксиэтилен-пропиленовые блок-сополимеры типично используют в концентрации от примерно 1 мл/л до примерно 3 мл/л.

Типичные подходящие адъювантные смеси включают, но не ограничиваются этим, смеси одного или более полимеров акриловой кислоты со смесью метаболизируемого масла, например, ненасыщенного терпенового углеводорода или его продукта гидрогенизации, предпочтительно сквалана (2,3,10,15,19,23-гексаметилтетракозан) или сквалена, и полиоксиэтилен-полиоксипропиленового блок-сополимера. Такой полимер акриловой кислоты может быть гомополимером или сополимером.

Полимеры акриловой кислоты представляют собой типично карбомеры. Карбомеры имеется в продаже под товарным знаком Карбопол и описаны, например, в патентах США № № 2909462 и 3790665, каждый из которых включен в данную заявку посредством ссылки.

Полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые блок-сополимеры представляют собой поверхностно-активные вещества, как правило, жидкие поверхностно-активные вещества, которые способствуют суспендированию твердых и жидких компонентов. Поверностно-активные вещества имеются в продаже в виде полимеров под товарным знаком Pluronic®. Поверхностно-активное вещество полоксамер 401 имеется в продаже под товарным знаком Pluronic® L121.

Адъювантная смесь может содержать метаболизируемое масло, полимер акриловой кислоты и полиоксиэтилен-полиоксипропиленовый блок-сополимер, приготовленный в виде эмульсии в водной среде. В некоторых воплощениях адъювантная смесь может включать метаболизируемое масло и полиоксиэтилен-полиоксипропиленовый блок-сополимер, такой как смесь сквалана и Pluronic® L121 (полоксамер 401), которая может присутствовать в количестве от примерно 50 мл/л до примерно 100 мл/л, а карбоксиполиметилен может представлять собой Карбопол 934Р (Карбамер 934Р), который может присутствовать в количестве примерно 2 мл/л.

Предпочтительные полимеры акриловой кислоты представляют собой полимеры, продаваемые В. F Goodrich в виде Карбопола 934 Р NF и 941 NF, которые представляют собой полимеры акриловой кислоты, поперечно сшитые с полиаллилсахарозой и имеющие химическую формулу (CH₂CHOOOH)_n . Эти полимеры образуют водные гели, которые подходят для приготовления препаратов с водными носителями. Полиоксиэтилен-полипропиленовые блок-сополимеры могут представлять собой неионные поверностно-активные вещества, продаваемые BASF в виде Pluronic® L121, L61, L81 или L101.

В некоторых воплощениях композиции, раскрытые в данной заявке, можно использовать в дополнительной комбинации с одной или более другими живыми бактериями, бактерином, анатоксином и/или вирусным антигеном. Таким образом, в некоторых аспектах этих воплощений адъювантная живая авирулентная композиция М.hyopneumoniae может содержать иммунизирующее количество живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae и один или более чем один биологически приемлемлемый адъювант в дополнительной комбинации с (а) одной или более живыми бактериями, такими как, например, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae и бактерии лептоспира; (б) одним или более чем одним бактерином; (в) одним или более чем одним очищенным анатоксином из одного или более патогенов, таких как, например, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae и бактерии лептоспира; и/или (г) одним или более чем одним вирусным антигеном, где вирус выбран из группы, состоящей из вируса свиного гриппа (SIV; такого как штаммы H1N1, H1N2 и H3N2 SIV), вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), поксвируса енота, экспрессирующего PRRS и/или другие антигены, TGEV, экспрессирующего PRRS и/или другие антигены, и свиного цирковируса (PCV). В качестве примера в данной заявке приведены композиции, включая вакцинные композиции, в которых используют один или более чем один живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae в дополнительной комбинации с химерной модифицированной живой вакциной против свиного цирковируса типа 1-типа 2 (cPCV1-2) (См. патентные публикации США 2003/0170270 и 2004/0253270).

В соответствии с этими или альтернативными воплощениями композиции, включая вакцинные композиции, могут дополнительно или возможно включать консервант, такой как, например, тимеросал и/или EDTA. См. также патентные публикации США № № 2002/0131980 и 2003/0017171, каждая из которых включена в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте.

Концентрация таких других живых бактерий, бактерина, анатоксина и/или вирусного антигена, используемых в композиции, описанной в данной заявке, будет зависеть от природы бактерина, анатоксина и/или вирусного антигена, и типично они присутствуют в композиции, описанной в данной заявке, в конечной концентрации от примерно 0,5×10⁵ до 0,5×10¹⁰ на мл. Альтерантивно, бактерии присутствуют в конечной концентрации от примерно 0,5×10⁶ до 0,5×10⁹ на мл или от примерно 0,5×10⁷ до 0,5×10 ⁸ на мл.

Композиции по настоящему изобретению найдут применение в способах защиты животных против заболевания, вызванного Mycoplasma hyopneumoniae, и/или предупреждения или ослабления вспышки такого рода заболевания в популяциях животных посредством введения адъювантной живой авирулентной композиции Mycoplasma hyopneumoniae, как описано в данной заявке. Композиции, описанные в данной заявке, также могут быть предпочтительно использованы в способах усиления у животного иммунного ответа, такого как клеточно-опосредованный и/или гуморальный иммунный ответ на Mycoplasma hyopneumoniae. Такие способы включают стадии введения животному, обычно свинье, одной или двух доз композиции, содержащей один или более чем один адъювантный живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae. В зависимости от конкретного предполагаемого применения композиции могут быть введены внутримышечно, подкожно, перорально, посредством аэрозоля или интраназально.

В соответствии со способами по настоящему изобретению желаемый режим дозирования включает введение одной или более доз желаемой вакцинной композиции свинье. Как правило, когда животному вводят две дозы, указанные дозы вводят с интервалом от примерно одной (1) недели до примерно четырех (4) недель, более типично с интервалом от примерно двух (2) недель до примерно трех (3) недель.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение будет легче понять со ссылкой на следующие неограничивающие примеры:

ПРИМЕР 1: Получение авирулентной адъювантной живой вакцины М.hyopneumoniae

В этом примере раскрыто получение типичной адъювантной живой авирулентной композиции М.hyopneumoniae в соответствии с настоящим изобретением.

Mycoplasma hyopneumoniae может быть получена из ряда легко доступных источников. В одном из воплощений, описанных в данной заявке, авирулентный живой культивируемый штамм J М.hyopneumoniae (РСХ3-Линия 1) был получен из Американской коллекции типовых культур (АТСС; Manassas, VA) в виде штамма АТСС № 27715. Любой другой авирулентный штамм М.hyopneumoniae может быть использован для получения композиций, таких как, например, родительский штамм J с номером доступа АТСС 25934. В некоторых других воплощениях предполагается, что любой живой вирулентный штамм Mycoplasma pneumoniae может быть изменен, ослаблен или подвергут мутациям до тех пор, пока не будет получена авирулентная культура, как определено тестированием in vitro или in vivo с использованием процедур, известных специалистам в данной области техники. Полная геномная последовательность штамма J АТСС 25934 была опубликована Vasconcelos с соавт. (J. Bacteriol. (2005), 187(16): 5568-5577) и получила номер доступа GenBank AE017243. Некоторые из последовательностей, ассоциированных с АТСС штаммом 25934, могут быть найдены в PubMed и имеют номера доступа GenBank AY737012 (ген рибосомальной РНК 16S), AY512905 (ген адгезина), AF013714 (ген пролипопротеина р65), U02538 (ген рРНК 23S) и U02537 (гомологичные гены белка множественной лекарственной устойчивости).

Каждую вакцинную композицию для бактерицидного анализа получали из одного флакона лиофилизированной культуры М.Hyopneumoniae, регидратированной с помощью 20 мл стандартного физиологического раствора. Вакцинные композиции включали комбинацию 5 мл регидратированной культуры и адъюванта, достаточного для получения указанной концентрации адъюванта в конечном объеме 10 мл. Контрольную композицию также получали путем объединения 5 мл регидратированной культуры с 5 мл стандартного физиологического раствора. Все композиции смешивали за 5 минут до начала отбора образцов. Образцы брали из всех композиций через 5 минут (0 часов), 3 часа и 7 часов после смешивания. Жизнеспособность каждой вакцины определяли с помощью колониеобразующих единиц (КОЕ) в каждой точке отбора образцов (см. Таблицу 1).

ТАБЛИЦА 1
	КОЕ/мл			MPN/мл
Адъювант	0 часов	3 часа	7 часов		0 часов	3 часа	7 часов
30% SL-CD	1,44Е+07	0	0		1,15Е+07	0	0
10%SL-CD	1.48Е+07	6,40Е+05	5,2Е+03		2.87Е+07	8,42Е+05	0,00Е+00
контроль	8,30Е+07	1,06Е+08	9,0Е+07		3,62Е+07	6,22Е+07	3,62Е+07
5% SP-масло	9,46Е+07	7,60Е+07	2,55Е+07		4,67Е+07	9.40Е+07	6.22Е+06
5% SP-масло /0,2%	1.50Е+08	5,61Е+07	4,53Е+07		4.27Е+08	7,74Е+07	2.84Е+06
контроль	2,17Е+08	1.41Е+08	9.86Е+07		1.91Е+08	8.42Е+07	4.67Е+07
10% SP-масло	1.09Е+07	1,07Е+07	7,13Е+06		3,40Е+06	7,74Е+06	3.62Е+06
контроль	3,50Е+07	4.75Е+07	7.20Е+07		1,03Е+07	8.42Е+07	3,14Е+07
10% SP-масло +0,2% карбопол	5.20Е+07	1,30Е+07	8.13Е+06		5,50Е+07	1.91Е+07	2.26Е+06
0,2% карбопол	6.80Е+07	6.67Е+07	6,60Е+07		1.63Е+08	1.38Е+08	4.45Е+07
контроль	2.90Е+07	Не тест.	5.54Е+07		1,23Е+08	Не тест.	1.38Е+07

Среднюю жизнеспособность исходной культуры определяли путем усреднения всех контрольных жизнеспособностей в 0 часов, среднее составило 9,09×10⁷ КОЕ/мл. Для сравнения наиболее вероятное число (MPN), определенное для исходной культуры, составило 1,85×10⁸ MPN/мл. Смешивание вакцины и вакцинация обычно занимает менее 3 часов; поэтому при определении бактерицидного действия адъювантов трехчасовая временная точка является наиболее важной. Изменение для SP-масла при 5% и 10% для трехчасового образца по сравнению с контролем составляет 2-кратную разницу и 4-кратную разницу, соответственно.

Вакцину А получали путем регидратирования лиофилизированной культуры во флаконах разбавителем, содержащим конечную концентрацию SP-масла 10% (об./об.). Плацебо вакцина представляла собой стандартный стерильный физиологический раствор.

ПРИМЕР 2: Эффективность авирулентных адъювантных живых вакцин М.hyopneumoniae у свиней in vivo

Этот пример демонстрирует эффективность типичной адъювантной живой авирулентной вакцинной композиции М.hyopneumoniae in vivo.

В общей сложности 30 свиней в возрасте 4-6-недель были приобретены из стада Fort Dodge Animal Health's SPF в Charles City, Айова. Свиней содержали на корме без антибиотиков или стимуляторов роста и давали воду и пищу без орграничения. Животные, получающие вакцинные композиции и контрольные композиции, были размещены в разных помещениях, и всех свиней содержали в одинаковых условиях во время периодов вакцинации, мониторинга и контрольного заражения.

30 свиней случайным образом распределяли на три (3) следующие группы: одна (1) группа получала вакцинную композицию, одна (1) группа получала плацебо и одна (1) группа служила контролем состояния окружающей среды. Свиньи были сгруппированы, как показано в Таблице 2.

ТАБЛИЦА 2
Группа	Общее число свиней	Вакцина	Свиньи, подвергнутые контрольному заражению
1	13	А	13
2	12	плацебо	12
3	5	не применяли	не применяли

Четырех-шестимесячных свиней вакцинировали внутримышечно дозой 2 мл соответствующей вакцины. Группе 1 вводили вакцину А, группе 2 вводили плацебо. Свиней из группы 3 не вакцинировали и не заражали, и они служили в качестве контролей состояния окружающей среды. Свиней в группе 1 вакцинировали дважды с интервалом в две недели. Через две недели после второй вакцинации всех свиней в группах 1 и 2 подвергали контрольному заражению гомогенатом легких (LI-34), содержащим вирулентный штамм 11 М.hyopneumoniae (J. Clin. Microbiol., 1999 Mar; 37(3):620-7). Через четыре недели после контрольного заражения всех свиней в группах 1-3 вскрывали и оценивали поражения легких.

Получение легочного гомогената (LI-34) для заражения штаммом М.hyopneumoniae

Семь кроссбредных свиней были приобретены в питомниках Spring Prairie Colony Farms (Genetipork) и инокулированы интратрахеально 10 мл 10%-ного неочищенного легочного гомогената (LI31) штамма 11 М.hyopneumoniae, разведенного 1:30. Неочищенный легочный гомогенат LI31 был получен в результате пассирования легочного гомогената, содержащего М.hyopneumoniae, у свободных от специфического патогена свиней и сбора зараженных пневмонией легких на первой промежуточной стадии заболевания. Легочные гомогенаты хранили при -70°С до использования.

Сыворотку собирали по прибытии и при аутопсии от всех свиней и оценивали в ISU ветеринарной диагностической лаборатории (ISU-VDL) на наличие антител к TGE (PRCV (свиной респираторный коронавирус)), SW и PRV (вирус псевдобешенства). Кроме того, осуществляли ELISA для PRRSV и антител против М. Hyopneumaniae, и все образцы были отрицательными в отношении всех вышеуказанных респираторных патогенов.

Всех свиней вскрывали. Пентобарбитал использовали для создания глубокой анестезии у свиней перед обескровливанием. Брюшную стенку грудной клетки вскрывали и области легочных поражений, характерные для М.hyopneumoniae, стерильно извлекали и помещали индивидуально в стерильные контейнеры.

Небольшую часть каждого легкого измельчали и проверяли на чистоту на планшетах с кровяным агаром, бульоном с экстрактом бычьего сердца и питательной средой Фриза. Серийные разведения в пробирке осуществляли в питательной среде Фриза для определения титра М.hyopneumoniae. Оставшиеся кусочки легких замораживали в 50 мл центрифужных пробирках при -70°С до получения результатов по бактериологии и выделению микоплазмы. Легочные доли от 3 из 7 свиней использовали для получения легочногоинокулята М.hyopneumoniae.

Куски доли от свиней #329, 331 и 332 размораживали и измельчали в питательной среде Фриза, не содержащей антибиотиков. Чистоту легочного инокулята подтверждали путем культивирования на экстракте бычьего сердца, кровяном агаре и питательной среде Фриза. Только микрококки, родственные с загрязнением окружающей среды, были обнаружиены на одном планшете. Легочный инокулят титровали для определения уровней М.hyopneumoniae и обнаружили приблизительно 10⁷ CCU/мл. Аликвоту предоставляли в ISU-VDL для анализов на выделение вирусов SN, EMS, энтеровируса, HEV, PRCV, PRRSV, вируса псевдобешенства, TGE, парвовируса и ротавируса. Результаты всех анализов были отрицательными. Конечный объем измельченного легочного инокулята (обозначенный LI 34) составил 1780 мл из 178,1 граммов легочной ткани. Его разделяли на аликвоты, имеющие объемы 100×5 мл и 110×10 мл.

На второй стадии исследования 9 свиней использовали для определения концентрации легочного инокулята, необходимой для индукции в среднем 8% пневмонических легочных поражений минимум у 80% свиней. Всех свиней заражали LI34 штаммом 11 М.hyopneumoniae интратрахеально, как описано выше. Разведения для заражения включали 1:30, 1:100 и 1:500.

Свиней вскрывали. Пентобарбитал использовали для создания глубокой анестезии перед обескровливанием. Легкие удаляли и легочные поражения схематически изображали на стандартных легочных диафрагмах. Собирали сыворотку от всех свиней и анализировали методом ELISA в отношении антител к М.hyopneumoniae. Все свиньи были либо низко положительными, либо серонегативными по М.hyopneumoniae, что предполагает отсутствие предварительной экспозиции с М.hyopneumoniae перед прибытием. Трахеальные мазки собирали асептически от всех свиней. Pasteurella multocida и Haemophilus parasuis выделили из 4 и 3 свиней, соответственно. М.hyopneumoniae выделили из всех зараженных свиней. Схематические изображения легких оценивали с помощью аналитической системы Zeiss Image для того, чтобы определить процент пневмонических легочных поражений.

Выводы

Контрольное заражение свиней было успешным, и разведение 1:100 может быть оптимальным разведением для применения. Средний процент индуцированной пневмонии составлял 10,17+/-6,6, что выше нормы, однако это может быть связано с присутствием Pasteurella multocida и/или parasuis у свиней. Кроме того, 100% свиней, зараженных контрольным инокулятом, имели значительные поражения легких. В целом, эти результаты довольно типичны для того, что авторы наблюдали в исследованиях М.hyopneumoniae, что присутствие других патогенов усиливает пневмонию. Это может быть связано с взаимодействием между патогенами и иммунной системой. Авторы получили 1600 мл легочного инокулята М.hyopneumoniae для применения в экспериментальных исследованиях с контрольным заражением. Инокулят будет вызывать по меньшей мере 8% или более пневмонических легочных поражений минимум у 80% зараженных свиней при интратрахеальном использовании в разведении 1:100.

За сутки до вакцинации вакцину титровали и осуществляли бактерицидные анализы для определения соответствующих адъювантных систем, подлежащих использованию (см. Пример 1). На основании этих данных для дальнейшего исследования выбрали адъювантную систему с 10% SP-маслом. Средняя жизнеспособность исходной культуры во флаконе составила 3,64×10 ⁹ КОЕ/флакон.

В сутки первого введения вакцинную композицию готовили следующим образом: вакцина А - каждый из трех флаконов авирулентной лиофилизированной культуры М hyopneumoniae регидратировали с помощью 10 мл 10%-ного разбавителя SP-масла. Три флакона вакцинной композиции для каждого типа разбавителя объединяли и оставляли перемешиваться в течение 20 минут на магнитной мешалке. Плацебо представляло собой физиологический раствор, разлитый по аликвотам в стерильную бутылку для введения. Композицию оставляли на льду в течение 2 часов курса вакцинации.

В сутки второго введения вакцинную композицию готовили следующим образом: вакцина А - каждый из трех флаконов авирулентной лиофилизированной культуры М.hyopneumoniae регидратировали с помощью 10 мл 10%-ного разбавителя SP-масла. Три флакона регидратированной культуры для каждого типа разбавителя объединяли и оставляли перемешиваться в течение 20 минут на магнитной мешалке. Плацебо представляло собой физиологический раствор, разлитый по аликвотам в стерильную бутылку для введения. Композицию оставляли на льду в течение 2 часов курса вакцинации.

Концентрацию живой М.hyopneumoniae в каждой композиции определяли до и после введения. Жизнеспособность оценивали путем определения колониеобразующих единиц (КОЕ/мл). Лиофилизированную исходную культуру, находящуюся во флаконе, подвергали регидратации с помощью 10 мл физиологического раствора, оставляли перемешиваться в течение 20 минут и использовали в качестве контроля для анализа жизнеспособности. Поскольку жизнеспособность первого контроля была ниже, чем жизнеспособность тестируемой вакцины, во время второго введения два флакона подвергали регидратации и объединяли для получения контроля (см. Таблицу 3 для жизнеспособностей тестируемой вакцины и жизнеспособностей контроля).

ТАБЛИЦА 3
Вакцина	Первая вакцинация КОЕ/мл	Вторая вакцинация КОЕ/мл
Группа 1: Адъювант 10% SP-масло	2,79Е+0,8	2,27Е+0,8
Жизнеспособность контроля	1,29Е+0,8	2,69Е+0,8

Всех свиней наблюдали ежесуточно в отношении температуры и клинических симптомов, начиная за двое суток до каждого введения и продолжая в течение семи суток после каждого введения. У свиней наблюдали клинические симптомы, которые включали, но не ограничивались этим, кашель, чихание, выделения из носа, депрессию, отсутствие аппетита и затрудненное дыхание.

Через четырнадцать суток после второго введения свиней в группе 1 заражали транстрахеально вирулентным штаммом М.hyopneumoniae.

В сутки контрольного заражения вирулентная исходная культура М.hyopneumoniae для контрольного заражения из замороженного (-70°С) гомогената легких (LI-34) быстро размораживали под теплой водой и разбавляли (разведение 1:100). Свиней усыпляли смесью Ксилазин-Кетамин- Телазол , состоящей из 50 мг/мл ксилазина, 50 мг/мл кетамина и 100 мг/мл телазола. Каждой свинье давали 10 мл материала для контрольного заражения транстрахеально. Для обеспечения размещения иглы, в шприц втягивали воздух до введения материала для контрольного заражения. Всех свиней наблюдали ежесуточно в отношении клинических симптомов после контрольного заражения.

У свиней брали кровь на сыворотку в 0-, 14-, 28- и 56-е сутки. Серологическую реакцию свиней на заражение М.hyopneumoniae определяли с помощью ELISA. Через четыре недели после заражения всех свиней из групп 1-3 умерщвляли и извлекали легкие. Тестируемые группы были слепыми и оценивались в отношении общих легочных поражений. Атипичные поражения М.hyopneumoniae фиксировали формалином для последующей гистопатологической оценки. Образцы мазков из пораженных легких собирали для выделения бактерий.

Средняя оценка легочного поражения для свиней в группе 1 (5,9%) была приблизительно на 50% меньше, чем в группе плацебо (14,8%). Когда статистический анализ корректировали на опорос, тогда ограниченная выборка (mitigated fraction) для группы 1 составляла 69,2%-ное уменьшение тяжести легочных поражений при сравнении с контролями. Эти данные просуммированы в Таблице 4. Все свиньи были серонегативными в сутки первого введения, что указывало на то, что свиньи были чувствительными к инфекции М.hyopneumoniae. За исключением одной (1) свиньи в группе SP-масло, свиньи не становились сероконверсивными после первой вакцинации. У всех свиней, получающих адъювантную вакцинную композицию SP-масло, развивался гуморальный ответ после второй вакцинации. Серологический ответ показывает, что индуцировался иммунный ответ на М.hyopneumoniae. (См. Таблицу 9 серологических результатов).

ТАБЛИЦА 4
Вакцина	Описание	Уменьшение поражений по сравнению с контролем для ограниченной выборки	Уменьшение нижнего уровня достоверности для ограниченной выборки
Вакцина А	Авирулентная М.hyopneumoniae живая с 10% SP-маслом	69,2	40,2
Контроль	Плацебо	Не анализировали		Не анализировали

Статистический анализ данных должен соответствовать критериям для ограниченной выборки (<50% с более низким доверительным уровнем >30%) для уменьшения легочных поражений для вакцины, которую считают эффективной в отношении М.hyopneumoniae. В целом, эти данные демонстрируют, что живая авирулентная адъювантная М.hyopneumoniae может быть предпочтительно использована для индукции защитного иммунного ответа при введении животному in vivo.

Хотя изобретение было описано в каждом из его различных воплощений, ожидается, что некоторые модификации в нем могут быть предприняты и осуществлены специалистом в данной области техники без отклонения от сущности и объема изобретения, как изложено в предыдущем описании и как дополнительно воплощено в следующей формуле изобретения. Настоящее изобретение не ограничено объемом конкретных воплощений, описанных в данной заявке. Действительно, различные модификации настоящего изобретения, в дополнение к описанным в данной заявке, будут очевидны специалистам в данной области техники из вышеизложенного описания и сопровождающих фигур. Предполагается, что такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, следует понимать, что все значения являются приблизительными и предназначены для описания. Все патенты и патентные заявки, процитированные в данной заявке, включены в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРИМЕР 3: Предварительные исследования иммуногенности фракции Mycoplasma hyopneumoniae из живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae - химерной модифицированной живой вакцины против свиного цирковируса типа 1-типа 2

Комбинированная вакцина на 3-4-недельных свиньях

В этом примере раскрыта эффективность комбинированной вакцины, содержащей адъювантный живой авирулентный штамм J Mycoplasma hyopneumoniae (РСХ3-линия1) и живую химерную вакцину против свиного цирковируса (PCV) типа 1-типа 2 (cPCV1-2; см. патенты США № № 7279166 и 7276353) при введении внутримышечно (в/м) или интраназально (и/н) 3-4 недельным свиньям. Такая комбинированная вакцина (PCV/MH) подходит для применения при вакцинации здоровых свиней в качестве вспомогательного средства для предупреждения и/или снижения тяжести заболевания, вызванного М.hyopneumoniae и свиным цирковирусом.

Тестируемая вакцина направленного действия должна содержать примерно 4,0 Logio FAID₅₀ (инфекционная доза для 50% клеток в культуре)/доза модифицированного живого вируса CPCV1-2 и 4х10⁸ КОЕ/доза штамма J М.hyopneumoniae (см. King et al, Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29: 85-89 (1965) и патент США № 4824785 для FAID метода). К вакцине добавляли SP-масло в качестве адъюванта до конечной концентрации 10% (об./об.). Вакцина плацебо представляла собой физиологический раствор.

В общей сложности 66 3-4 недельных свиней использовали в данном исследовании. 16 свиньям вводили однократно по 2 мл живой вакцины PCV/MH внутримышечно и заражали их (группа 1); 15 свиньям вводили дважды по 2 мл живой вакцины PCV/MH внутримышечно (с двухнедельным интервалом) и заражали их (группа 2); 15 свиньям вводили дважды по 2 мл (1 мл/ноздря) живой вакцины PCV/MH интраназально (с двухнедельным интервалом) и заражали их (группа 3); 15 свиньям не вводили живую вакцину PCV/MH и не заражали их (группа 4); и 5 свиней служили в качестве контроля окружающей среды (группа 5).

Вакцина, используемая в данном исследовании и раскрытая в данной заявке, представляла собой комбинацию лиофилизированного живого антигена МН (партия #1744-56) и разбавителя, содержащего живую вакцину PCV (партия С108-56). В сутки вакцинации лиофилизированный остаток живой МН регидратировали с помощью разбавителя, содержащего живой вирус PCV (4,0 Log₁₀FAID₅₀/мл с добавленем 10% SP-масла в качестве адъюванта). Конечную вакцину обозначили как партия #2315-30. Жизнеспособность фракции МН определяли до и после вакцинации, 3,18×10⁸ КОЕ/мл (до) и 1,65×10 ⁸ КОЕ/мл (после), соответственно. Титр PCV для вакцины до и после вакцинации составлял 4,09 Log₁₀ FAID ₅₀ и 3,7 Log₁₀ FAID₅₀, соответственно. Вакцину для второй вакцинации готовили, как описано выше, и обозначили как партию #2315-32. Жизнеспособность фракции МН составляла 1,24×10 ⁸ КОЕ/мл и 1,5×10⁸ КОЕ/мл до и после вакцинации, соответственно. Жизнеспособность фракции PCV составляла 4,36 Log₁₀ FAID₅₀ и 3,83 Log₁₀ FAID ₅₀, соответственно.

За свиньями наблюдали в течение 7 суток после вакцинации в отношении любых отрицательных реакций на вакцину. Три свиньи погибли во время периода наблюдения после вакцинации вследствие причин, не связанных с МН или PCV. Краткий обзор клинических наблюдений за период после вакцинации приводится в таблице 5.

Таблица 5
Группа	Кол-во свиней	Обработка	Способ введения	Доза	Наблюдение после вакцинации
1	16	Вакцинация	в/м	1 доза	Одна свинья, как было отмечено, имела повышенную темп.(105,1-106,2°F) (40,6-41,2°С) в течение 7 суток подряд, начиная с 15 суток после первой вакцинации. Другая свинья, как было отмечено, имела повышенную темп., плохой аппетит и депрессию в течение 4 суток подряд, начиная с 18 суток после первой вакцинации.
2	15	Вакцинация	в/м	2 дозы	Одна свинья погибла за сутки до второй вакцинации из-за возможных HPS (хантавирусный легочный синдром) или инфекции S. suis. Клинические признаки депрессии и худобы были отмечены до вакцинации. Одна свинья имела повышенную темп.(105,0-106,7°F) (40,6-41,5°С) в течение 3 суток подряд,начиная с 5 суток после вакцинации.
3	15	Вакцинация	ИН	2 дозы	За двое суток до второй вакцинации одна свинья погибла из-за прободения кишечника. Две свиньи имели опухшие суставы и кашель в течение 8 суток подряд,
					которые возникли до первой вакцинации. Две других свиньи, как было отмечено, за сутки до второй вакцинации имели распухшие скакательные суставы в течение 7 суток подряд, в течение которых у одной развился абсцесс, а другая выздоровела.
4	15	Физиологический раствор.	в/м	2 дозы	Одна свинья, как было отмечено, имела распухшие скакательные суставы на протяжении всего исследования до первой вакцинации. Другая свинья также имела распухшие скакательные суставы в течение нескольких суток во время исследования. Одна свинья имела двое суток подряд повышенную темп.105,1°Р(40,6°С)и 106,5°F (41,4°С), начиная с 6 суток после второй вакцинации.
5	5	Без вакцинации	NA	NA	Размещали со свиньями группы #4 во время вакцинации. Не отмечено отрицательных реакций.

NA: неприменимо

и/н:интраназально

в/м: внутримышечно

Всех свиней в группах 1-4 заражали вирулентным штаммом М.hyopneumoniae (гомогенат легких свиньи, содержащий вирулентный МН (LI-34)). Свиней из группы 1 заражали через четыре недели после первой вакцинации. Свиней из групп 2-4 заражали через две недели после второй вакцинации. Через четыре недели после заражения всех свиней в группах 1-5 умерщвляли и оценивали легочные поражения.

Вакцину титровали за сутки до вакцинации. Лиофилизированную культуру авирулентной М.hyopneumoniae регидратировали в сутки вакцинации. Концентрация организмов М.hyopneumoniae в вакцине составляла приблизительно 2×10⁸ КОЕ/мл. Образец вакцины сохраняли, и анализ жизнеспособности проводили до и после вакцинации для подтверждения фактического значения КОЕ/мл. Вакцину выдерживали на льду во время курса вакцинации.

Всех свиней наблюдали ежесуточно в отношении температуры и клинических признаков, начиная за двое суток до каждой вакцинации и продолжая в течение семи суток после вакцинации. Свиней наблюдали в отношении клинических симптомов, которые включали, но не ограничивались этим, кашель, чихание, выделения из носа, депрессию, плохой аппетит и затрудненное дыхание. Через 14 суток после второй вакцинации свиней в группах 1-4 заражали транстрахеально вирулентным штаммом М.hyopneumoniae.

В сутки контрольного заражения исходный раствор вирулентного М. Hyopneumoniae, замороженный (-70°C) гомогенат легких (LI-34) быстро размораживали под теплой водой и разбавляли (разведение 1:100) с использованием стерильной ростовой среды для М.hyopneumoniae. Свиней усыпляли смесью Ксилазин-Кетамин-Телазол , содержащей 50 мг/мл ксилазина, 50 мг/мл кетамина и 100 мг/мл телазола. Каждой свинье давали 10 мл материала для контрольного заражения транстрахеально. Для обеспечения размещения иглы, в шприц втягивали воздух до введения материала для контрольного заражения.

Всех свиней наблюдали в отношении клинических признаков после контрольного заражения. Наблюдение проводили ежесуточно в отношении аномального клинического признака. У свиней брали кровь на сыворотку (не более 13 мл цельной крови) в 0-, 14-, 28- и 56-е сутки исследования. Сыворотку собирали, но не оценивали. ELISA можно проводить для оценки серологического ответа свиней при использовании сыворотки, собранной во время периода исследования в будущем.

Через четыре недели после контрольного заражения всех свиней из групп 1-5 умерщвляли и извлекали легкие. Атипичные поражения М. hyopneumoniae фиксировали формалином, и образцы изучали в отношении гистопатологии. Образцы мазков из пораженных легких собирали для выделения бактерий. Свиней, которые погибли после контрольного заражения, вскрывали, и образцы собирали, как описано выше. Эффективность вакцины определяли в виде комбинированной средней оценки легочных поражений у вакцинированных животных, которая была на 50% меньше, чем средняя комбинированная оценка легочных поражений в контролях.

В сутки вскрытия всех свиней умерщвляли, легочные поражения оценивали и брали мазок для выделения бактерий. Бактерии, выделенные из мазков, состояли из следующего: Staphylococcus heamolyticus, Streptococcus suis (P322), Staphylococcus epidermis, A. pyogenes, виды аэрококков, S. uberis, Bordetella bronchiseptica (P344) и Microbacterium. Статистический анализ результатов легочных поражения представлен в Таблице 6.

Таблица 6
Группа	Коэфф-т защиты	Скорректир. на опорос для MF	Нижний доверительный уровень для MF	Оценка процента легочных поражений, скорректир. на опорос	Оценка легочных поражений (LCL)	Стандартное отклонение легочных поражений	Средний процентиль для поражений
Вакцинир. в/м одна доза	1/15	52,9%	19,6%	6,30%	3,86%	4,41	0,37
Вакцинир. в/м двойная доза	3/15	63,8%	33,8%	5,03%	2,39%	4,59	0,31
Вакцинир. и/н двойная доза	0/14	-8,6%	-51,8%	12,86%	8,59%	7,38	0,65
Контроль	0/15	NA	NA	11,46%	8,41%	5,5	0,62

LCL=нижний доверительный уровень

MF=ограниченная выборка

Статистический анализ данных отвечает критериям для ограниченной выборки (<50%, для LCL>30%) в отношении уменьшения легочных поражений. Этот пример демонстрирует (а) эффективность MH/PCV вакцины для МН фракции при в/м введении двух доз по 2 мл, при 3,18×10⁸ КОЕ/мл и (б) безопасность MH/PCV вакцины вследствие отсутствия клинических признаков, связанных с МН или PCV после вакцинации.

ПРИМЕР 4: Исследование иммуногенности Mycoplasma hyopneumoniae фракции из комбинированной вакцины, содержащий живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae и химерную модифицированную живую вакцину против свиного цирковируса типа 1-типа, на 3-4 недельных свиньях

В этом примере описано исследование иммуногенности, которое подтверждает результаты исследования, представленного в Примере 4, и подтверждает эффективность М.hyopneumoniae фракции комбинированной вакцины, содержащей живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae и химерную модифицированную живую вакцину против свиного цирковируса типа 1-типа 2 (MH/PCV), при внутримышечном введении. MH/PCV вакцина, раскрытая в данной заявке, может быть пригодна для применения в вакцинации здоровых свиней в качестве средства для предупреждения и/или минимизации тяжести заболевания, вызванного М.hyopneumoniae и свиным цирковирусом.

Свиньи, используемые в настоящем исследовании, были серонегативными к М.hyopneumoniae, как определено с помощью ELISA.

В общей сложности 79 трех-четырех недельных свиней делили случайным образом на четыре группы. 24 свиньи из группы 1 вакцинировали однократной дозой комбинированной живой вакцины PCV/MH. 24 свиньи из группы 2 вакцинировали комбинированной вакциной дважды с интервалом в две недели. 24 свиньи из группы 3 вакцинировали физиологическим раствором дважды с интервалом в две недели в качестве контроля заражения. Все вакцины вводили внутримышечно. Четырех свиней из группы 4 ни вакцинировали, ни заражали, и они служили в качестве контроля окружающей среды.

Вакцина, используемая в исследовании, представляла собой комбинацию МН лиофилизированного живого антигена (партия 1744-66) и разбавителя, содержащего живую вакцину против PCV (cPCV1-2 партия С108-56). В сутки вакцинации лиофилизированный остаток живой МН регидратировали разбавителем, содержащим живой вирус PCV (3,5 Log₁₀FAID₅₀ /Mn с добавлением 10% SP-масла в качестве адъюванта). Конечную вакцину обозначили как партия 2315-40. Жизнеспособность МН фракции, определенная до и после вакцинации, составляла 2,09×10 ⁸ КОЕ/мл и 1,56×10⁸ КОЕ/мл, соответственно. Вакцина плацебо представляла собой стерильный физиологический раствор.

Вакцину для второй вакцинации готовили, как описано выше, и обозначили как партия #2315-42. Жизнеспособность для МН фракции составляла 1,05×10⁸ КОЕ/мл и 6,72×10 ⁷ КОЕ/мл до и после вакцинации, соответственно. Жизнеспособность для разбавителя фракции PCV составляла 3,44 Log₁₀ FAID₅₀.

Вакцину титровали за сутки до вакцинации. Лиофилизированную культуру авирулентной М.hyopneumoniae регидратировали в сутки вакцинации. Образец вакцины сохраняли, и анализ жизнеспособности выполняли до и после вакцинации для определения КОЕ/мл. Вакцину хранили на льду во время курса вакцинации.

Всех свиней ежесуточно наблюдали в отношении температуры и клинических симптомов, начиная с двух суток до каждой вакцинации и продолжая в течение семи суток после каждой вакцинации. Свиней наблюдали в отношении клинических симптомов, которые включали, но не ограничивались этим, кашель, чихание, выделения из носа, депрессию, отсутствие аппетита и затрудненное дыхание.

Свиней наблюдали в течение 7 суток после вакцинации в отношении любых отрицательных реакций на вакцину. Три свиньи погибли во время периода наблюдения после вакцинации вследствие причин, не связанных с МН или PCV. Краткий обзор клинических наблюдений за период после вакцинации приведен в таблице 7.

Таблица 7
Группа	Кол-во свиней	Обработка	Доза	Наблюдения после вакцинации
1	24	Вакцинация	1 доза	Никаких отрицательных реакций не было отмечено вследствие вакцинации.
2	24	Вакцинация	2 дозы	Одна свинья погибла в этой группе из-за прободения кишечника. На 5-е сутки после первой вакцинации отметили, что одна свинья имела темп.105,5°F(40,8°C)и затрудненное дыхание в течение одних суток.
3	24	Вакцинация физиологическим раствором	NA	На 6-е сутки после первой вакцинации отметили, что одна свинья имела затрудненное дыхание в течение одних суток.
4	4	Без вакцинации	NA	Помещали со свиньями из группы 3 во время вакцинации. Отрицательных реакций не отмечено.

NA: неприменимо

Всех свиней в группах 1-3 заражали вирулентным штаммом М. Hyopneumoniae в возрасте приблизительно 7 недель. Свиней из группы 1 заражали через четыре недели после первой вакцинации. Свиней в группах 2 и 3 заражали через две недели после второй вакцинации. Исходный раствор вирулентного М.hyopneumoniae для контрольного заражения, замороженный (-70°C) гомогенат легких (LI-34) быстро размораживали под теплой водой и разбавляли (разведение 1:100) с использованием стерильной ростовой среды для М.hyopneumoniae. Свиней усыпляли смесью Ксилазин-Кетамин-Телазол , содержащей 50 мг/мл ксилазина, 50 мг/мл кетамина и 100 мг/мл телазола. Каждой свинье давали 10 мл материала для контрольного заражения транстрахеально.

У свиней брали кровь на сыворотку в 0-, 14-, 28- и 56-е сутки исследования. Образцы сывороток, собранные в данном исследовании, можно тестировать для оценки серологической реакции животного на М.hyopneumoniae и PCV2 с использованием методов ELISA, хорошо известных в данной области техники. Образцы сыворотки, собранные в нулевые сутки после вакцинации (ODPV) и нулевой сутки после контрольного заражения (ODPC), могут быть протестированы на антитела к М.hyopneumoniae, свиному гриппу (H1N1) и репродуктивно-респираторному синдрому свиней (PRRS) с использованием коммерчески доступных ELISA наборов для анализа.

Через четыре недели (28 DPC) после контрольного заражения всех свиней из групп 1-4 умерщвляли и извлекали легкие. Оценки легочных поражений регистрировали и типичные поражения М.hyopneumoniae фиксировали формалином. Образцы исследовали в отношении гистопатологии.

Образцы мазков из одной пораженной доли М.hyopneumoniae собирали для выделения бактерий для определения вторичных инфекций. Кроме того, собирали бронхоальвеолярный лаваж. Легкие промывали забуференным фосфатами физиологическим раствором, и полученную жидкость делили на аликвоты для тестирования методом ПЦР.

Для оценки снижения тяжести легочных поражений оценивали статистическую ограниченную выборку (MF). Ограниченную выборку рассчитывали по формуле:

где W₁ = критерий суммы рангов Уилкоксона

n_c = число субъектов в контрольной группе

n = число субъектов в вакцинированной группе

95% доверительный интервал рассчитывали для ограниченной выборки.

В соответствии с требованием снижения тяжести легочных поражений:

H_O: M_v=M _c

H_A: M_V M_c

где M_v = Медиана оценки легочных поражений в группе вакцинированных животных

М _с = Медиана оценки легочных поражений в группе контрольных животных

Распределение частоты непрерывных переменных выхода оценивали с использованием PROC UNIVARIATE, которая осуществляет параметрический и непараметрический анализ образца из одной популяции (SAS Institute Inc., Cary NC). Log трансформации титров антител использовали для соответствия допущению о нормальном распределении, необходимому для параметрических тестов. Фоновые оценки для определения сравнимости групп по опоросу и размещению будут сделаны с помощью хи-квадрата. Тяжесть легочных поражений сравнивали между каждой вакцинированной группой и контрольной группой с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона (PROC NPAR1WAY) с оценкой легочных поражений в качестве зависимой переменной и лечения в качестве независимой переменной. PROC NPAR1WAY осуществляла непараметрические тесты для локализации и масштабирования различий посредством однопараметрической классификации. PROC NPAR1WAY также обеспечивает стандартный анализ вариаций исходных данных и статистики, основанных на эмпирической функции распределения. (SAS Institute Inc., Cary NC).

Весь статистический анализ будут проводить с использованием системы SAS. В случаях, когда преобразование не улучшало распределения остатков для любых преобразованных переменных, как определено с помощью критерия W нормальности, непараметрические тесты выполняли по мере необходимости. Уровень значимости будет установлен на p<0,05.

В сутки вскрытия всех свиней умерщвляли, оценивали легочные поражения и брали мазки для выделения бактерий. Также собирали бронхоальвеолярные лаважи (БАЛ). Бактерии, выделенные из мазков, состояли из следующего: Actinobacillus species, Moraxella osloensis, Streptococcus sanguinis, A. pyogenes и Bordetella bronchiseptica. Образцы БАЛ тестировали в отношении МН посредством метода ПЦР; регистрировали два образца из группы контроля состояния окружающей среды с поражениями и два образца с низкими оценками поражений в вакцинированной и контрольной группе. Образцы БАЛ для обеих свиней из группы контроля состояния окружающей среды с поражениями были отрицательными, и обе свиньи с низким уровнем поражений в вакцинированной группе были положительными. Статистический анализ оценок легочных поражений представлен в Таблице 8.

Таблица 8
Группа	Коэфф-т защиты	Скорректир. на опорос для MF	Нижний доверительный уровень для MF	Оценка процента легочных поражений, скорректир. на опорос	Оценка легочных поражений (LCL)	Стандартное отклонение легочных поражений	Средний процентиль для поражений
Вакцинир. в/м одна доза	1/23	58,4%	31%	8,84%	6,68%	4,99	0,38
Вакцинир. в/м две дозы	4/19	71,2%	48,7%	6,62%	4,37%	4,67	0,3
Контроль	0/23	NA	NA	19,27%	14,62%	10,76	0,69

LCL=нижний уровень достоверности

MF=ограниченная выборка

Статистический анализ данных должен соответствовать критериям для ограниченной выборки (<50% с более низким доверительным уровнем >30%) для уменьшения числа легочных поражений. Вакцина считается эффективной для МН фракции при введении дозы в 2 мл внутримышечно, как при одной, так и при двух дозах, при 2,09×10⁸ КОЕ/мл. Кроме того, вакцина считается безопасной вследствие отсутствия клинических признаков, связанных с МН или PCV, после вакцинации.

ТАБЛИЦА 9
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДЛЯ ПРИМЕРА 2
№ свиньи	Группа	ODPV1	ODPV2	ODPC	Аутопсия	Оценка легких
730	1	<50	100	400	400	9,5
733	1	<50	<50	100	>400	35,5
735	1	<50	<50	100	200	5,5
740	1	<50	<50	200	400	5,5
742	1	<50	<50	200	200	0,5
745	1	<50	<50	200	100	0,9
754	1	<50	<50	400	400	6,8
755	1	<50	<50	400	>400	0,0
761	1	<50	<50	200	200	4,5
762	1	<50	<50	>400	200	0,5
763	1	<50	<50	400	200	2,7
771	1	<50	<50	>400	>400	5,5
774	1	<50	<50	>400	>400	0,0
732	2	<50	<50	<50	<50	1,8
738	2	<50	<50	<50	<50	5,9
739	2	<50	<50	<50	50	18,2
743	2	<50	<50	<50	50	19,1
747	2	<50	<50	<50	200	0,5
749	2	<50	<50	<50	50	21,4
752	2	<50	<50	<50	<50	9,5
759	2	<50	<50	<50	<50	15,9
764	2	<50	<50	<50	<50	26,4
768	2	<50	<50	<50	<50	31,8
769	2	<50	<50	<50	<50	16,8
773	2	<50	<50	<50	<50	10,0
726	3	<50	<50	<50	<50	0,0
744	3	<50	<50	<50	<50	0,0
750	3	<50	<50	<50	<50	0,0
767	3	<50	<50	<50	<50	1,4
770	3	<50	<50	<50	<50	0,5

Группа 1: SP-масло вакцина (вакцинированные и зараженные)

Группа 2: Контроль/контрольное заражение (невакцинированные и незараженные)

Группа 3: Незараженный контроль (невакцинированные и незараженные) ODPV1 и ODPV2: Числа показывают наибольшее разведение, которое было положительным в ELISA тесте после первой дозы вакцины (ODPV1) или после второй дозы вакцины (ODPV2).

ODPC: Числа показывают результаты ELISA после контрольного заражения. Большее число указывает на сероконверсию.

Оценка легких: Число показывает процент поражений в легких животных.

Большее число указывает на большее количество поражений в легких вследствие отсутствия защитного иммунитета. Меньшее число указывает на более здоровых свиней с меньшим количеством поражений вследствие индукции защитного иммунного ответа.