штамм rhodococcus fascians, используемый для разложения нефти

Формула изобретения

Штамм Rhodococcus fascians, депонированный в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01140 и используемый для разложения нефти.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть, и которая может быть использована для очистки загрязненных почв.

Известен штамм Rhodococcus erythropolis для разложения нефти и нефтепродуктов (Патент РФ 2257409, МКИ C12N 1/20, В09С 1/10, опубл. 2004). Штамм депонирован как Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1668. Штамм выделен из образца загрязненной нефтью почвы Республики Башкортостан, растет на многих натуральных и синтетических средах и обладает сравнительно высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов.

Следует отметить, что существенным недостатком рассматриваемого штамма является то, что данный микроорганизм не обладает способностью к биологическому окислению «тяжелых» и ароматических углеводородов и других видов вредных химических соединений, таких как спирты, альдегиды, технические масла, жиры и др.

Известен консорциум штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus erythropolis IT BKM Ac-1769 и Pseudomonas fluorescens BKM В-6847 (Патент РФ 2428471, C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, опубл. 2010), входящих в состав экобиопрепарата «Центрум-MMS», предназначенного для очистки от загрязнителей углеводородной природы, в первую очередь от нефти и горючесмазочных веществ и позволяющего повысить эффективность очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов.

Однако недостатком данного изобретения является то, что культивирование микроорганизмов различной таксономической и видовой принадлежности, а также различающихся по скорости роста, субстратной специфичности, температурному оптимуму роста приводит к их конкурентной борьбе и снижает их выживаемость, и как следствие усложняет и делает процесс выращивания более материально и энергозатратным.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств и получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти.

Для достижения поставленной задачи предложен штамм Rhodococcus fascians (4-Г), выделенный из загрязненной мазутом почвы, отобранной с территории котельной, расположенной в поселке Горелово, Ленинградской области. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под номером RCAM01140.

Выделение штамма осуществлялось путем культивирования исходного образца загрязненной мазутом почвы в жидкой минеральной среде с добавлением углеводородов с последующим рассевом на мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определителе бактерий Bergey (Bergey's. Manual of Systematic Bacteriology. 1986. 8 ^th ed V.2. Baltimore-Londone, William & Wilkins), а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК.

Культивирование в лабораторных условиях производилось на питательных средах следующего состава:

1) среда МПА (сахароза - 5,0 г/л; глюкоза - 5,0 г/л; МПА - 50 г/л; агар-агар - 8,0 г/л), рН среды 7,3-7,5 до стерилизации;

2) минеральная среда с С₁₄-С₁₇ для сохранения практической ценности культуры: (K₂HPO₄ - 0,5 г/л; KH₂PO₄ - 0,5 г/л; MgSO ₄ - 0,3 г/л; NH₄H₂PO₄ - 1,0 г/л; пептон - 2,0 г/л; агар-агар - 15,0; после внесения среды в пробирки до стерилизации наслаиваем ~0,8 мл фракции жидких углеводородов С₁₄-С₁₇), рН среды 7,1-7,2 до стерилизации.

Условия выращивания: на среде МПА 96 часов при 28ºС, на минеральной среде с углеводородами 96-120 часов при 28ºС.

Хранение штамма производят при периодическом пересеве на свежеприготовленные среды 1 раз в 3 месяца.

По морфологическим признакам штамм характеризуется как грамположительная палочка с закругленными концами размером (0,6-0,7)×(1-1,5) мкм, спор не образует, неподвижная.

Штамм Rhodococcus fascians 4-Г характеризуется следующими культурально-морфологическими особенностями. Колонии ярко-оранжевые, округлые, непрозрачные, выпуклые, мелкие с ровными краями, растет при 37ºС, растет при рН 5-6, растет в присутствии 1-4% NaCl, 1% лактата натрия, в присутствии LiCl, NaBr, К ₂ТеО₃, обладает уреазой. Строгий аэроб. Реакция Фогеса-Проскауэра - отрицательная.

Данный штамм характеризуется следующими биохимическими характеристиками. Утилизирует стахиозу, D-раффинозу, -D-лактозу, D-мелибиозу, D-фруктозу, D-галактозу, D-серин, D-сорбитол, D-маннитол, D-арабитол, глицерин, пектин, D-глюконовую кислоту, хиннойную кислоту, D-сахарную кислоту, L-молочную кислоту, лимонную кислоту, L-яблочную кислоту, бром-янтарную кислоту, -гидрокси-D,L-масляную кислоту, -кето-масляную кислоту, ацетоуксусную кислоту, пропионовую кислоту, уксусную кислоту, твин-40, является чувствительным к азтреонаму.

Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения почвы нефтью.

Ниже приведены примеры биологического окисления нефти штаммом Rhodococcus fascians 4-Г.

Подготовленная для опытов садово-огородная почва была расфасована по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый.

Загрязнение почвы нефтью осуществлялось непосредственно в стаканах. В качестве загрязнителя была выбрана нафтеново-ароматическая нефть, качественный состав которой приведен в Табл. 1. Навеска нефтяного загрязнителя в почву вносилась весовым методом и составляла ~30 г, или ~2,0 вес.% на почву. Стаканы с нефтезагрязненной почвой выдерживались в условиях лаборатории с периодическим рыхлением. Это способствовало более равномерному распределению нефтяного загрязнителя в почве и, по возможности, испарению его легких фракций.

В Табл.1 представлены результаты химико-битуминологического анализа средней пробы почв, загрязненных нефтью, вес.%. Нефть - нафтеново-ароматическая тяжелая нефть месторождения «Русское».

Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть и дизельное топливо проводилась в лабораторных условиях. В подготовленные почвенные образцы, предварительно расфасованные по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый, и загрязненные нефтью вносили культуру микроорганизмов с титром 10⁵-10⁸ кл/мл.

Маточную культуру бактерий Rhodococcus fascians 4-Г выращивали на качалке (200 об/мин) при 28ºС в течение 48-72 часов в колбах со 100 мл одной из сред следующего состава, вес.%:

1. Пептон-1%

K₂HPO ₄ - 0,15%

MgSO₄ - 0,15%

Глицерин - 1%

Вода водопроводная - остальное до 100%

рН до стерилизации 7,6

2. Мясопептонный бульон с глюкозой (0,5 вес.%) и сахарозой (0,5 вес.%).

рН до стерилизации 7,6.

Опыты проводились при комнатной температуре (в среднем 18-20ºС) в течение 91 суток с периодическим перемешиванием и увлажнением по мере высыхания почвы. Увлажнение производилось стерильной водой; примерно раз в 3 недели увлажнение осуществлялось минеральной средой, содержащей К, Р, N и имеющей рН до стерилизации 7,1-7,2. Почва в контрольных опытах увлажнялась только стерильной водой.

Учет численности живых клеток микроорганизмов в эксперименте проводился общепринятым методом предельных разведении на элективных средах.

Мониторинг происходящих процессов очистки нефтезагрязненной почвы выполнялся по следующим параметрам:

- содержание нефтепродуктов, мг/кг.

- содержание и качественный состав хлороформенного экстракта.

Периодичность отбора почвы на эти виды анализов составляла, как правило, 2 недели; анализ проводился согласно ГОСТу 17.1.4.01-80 и РД 52.18.575-96.

В Табл.2 приведены результаты проведенного мониторинга - содержание нефтепродуктов (НП), вес.% от первоначального содержания в почве при очистке штаммом загрязнения, состав которого приведен в Табл.1. Дано в вес.% относительно их исходного содержания в нефтезагрязненной почве.

Таблица 2
Содержание нефтепродуктов (НП) в загрязненной почве в процессе очистки штаммом Rhodococcus fascians 4-Г
Загрязнитель	Содержание НП, вес.% от первоначального содержания в почве
	Продолжительность очистки, недели
	0	2	4	6	8	13
	Нефтепродукты
Нефть	0,0	-27,3	-40,0	-48,3	-57,7	-60,5

Согласно данным Табл.2, за 13 недель продолжительности опыта содержание нефтепродуктов в загрязненных образцах почвы снижается на 60,5% от первоначального их содержания. Снижение содержания нефтепродуктов в образцах, загрязненных нефтью, наблюдается со 2 недели от начала постановки опытов.

В Табл.3 приведено содержание и качественный состав ХБА нефтезагрязненной почвы по образцам Табл.1 через 91 сутки от начала опытов очистки штаммом Rhodococcus fascians 4-Г.

Данные качественного состава ХБА - (хлороформенного битумоида ) образцов загрязненной почвы до очистки, представленные в Табл.1, в сравнении с данными по опытным образцам, представленными в Табл. 3, позволяют сделать анализ характера изменения группового и углеводородного состава хлороформенного битумоида в процессе биологического окисления штаммом Rhodococcus fascians 4-Г.

Согласно результатам анализа, содержание ХБА в опытных образцах нефтезагрязненной почвы 1,92% при продолжительности опытов 91 сутки. Резко изменился и качественный состав ХБА опытного образца почвы, по сравнению с доопытным составом ХБА. Через 91 сутки после начала опытов по утилизации нефтяного загрязнения почвы отмечается снижение наиболее доступных для микроорганизмов его фракций. Наиболее доступной для биоокисления в составе нефтяного загрязнения является фракция масел. Содержание масел снизилось до 42,50% отн.

Исходя из представленных выше данных, следует, что штамм Rhodococcus fascians 4-Г RCAM01140 характеризуется высокой эффективностью в процессах утилизации нефти, и как следствие может быть использован для биологической очистки почв от данного загрязнителя.

Также следует отметить, что рассматриваемый штамм Rhodococcus fascians 4-Г RCAM01140 углеводородокисляющего микроорганизма, может быть использован в процессах биологического окисления нефтепродуктов, например дизельного топлива. Основанием для этого заключения является то, что в состав дизельного топлива и других нефтепродуктов, также как и в состав нефтей входят различные классы углеводородов, которые подвергаются биологической деградации микроорганизмами.