расширение спектра т клеток для включения субдоминантных эпитопов путем вакцинации с антигенами, доставленными как белковые фрагменты или пептидные коктейли

Формула изобретения

1. Вакцина против хронической болезни, такой как бактериальная или вирусная инфекция, включающая пептидную смесь, содержащую смежные перекрывающиеся пептиды, охватывающие целую аминокислотную последовательность белка, который экспрессирован во время хронической фазы болезни и индуцирует клеточно опосредованный иммунный ответ в случае хронической болезни, также включающая вспомогательное средство, где вспомогательным средством является катионная липосома.

2. Вакцина по п.1, где вспомогательным средством является DDA/TDB.

3. Вакцина по п.1, где один или более из пептидов химически модифицирован путем гликозилирования, образования соединений с липидами, мечения РАМ3Сys или додеканоил хлоридом, или включением простетических групп, или содержанием добавочных аминокислот, или непосредственной конъюгацией с TLR-агонистом.

4. Вакцина по п.1, где смесь пептидов включена в липосомы или каждый пептид включен отдельно в липосомы до получения смеси.

5. Вакцина по п.1, где пептиды имеют длину 10-30 аминокислот, предпочтительно 12-20 аминокислот.

6. Вакцина по п.1, где перекрывание со смежным пептидом составляет 6-20 аминокислот, предпочтительно 10-12 аминокислот.

7. Вакцина по п.1, где белок выбран из бактерии, такой как вирулентная микобактерия, например Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum или Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae или Chlamydia trachomatis, или вируса, такого как вирус гепатита В или С, или паразита, такого как виды Leishmania.

8. Вакцина по п.1, где пептиды происходят от белка, выбранного из М. tuberculosis, такого как ESAT6, Ag85A, Ag85B или ТВ 10.4, или из Chlamydia trachomatis, такого как СТ184, СТ521, СТ443, СТ520, СТ521, СТ375, СТ583, СТ603, СТ610 или СТ681, или из вируса гепатита, или из Plasmodium falciparuman, такого как Msp1, Msp2, Msp3, Amal, GLURP, LSA1, LSА3 или CSP.

9. Способ получения вакцины по любому из пп.1-8, где пептидную смесь готовят протеолитическим расщеплением белка с двумя или более средствами протеолитического расщепления.

10. Способ получения вакцины по п.9, где средство протеолитического расщепления выбирают из протеолитических ферментов, таких как трипсин, V-8 протеаза, AspN или химотрипсин, или выбирают из химических средств, таких как CNBr или BNPS-скатол.

11. Способ профилактики или лечения хронической болезни, такой как бактериальная или вирусная инфекция, у животных, включая человека, при котором вводят животному вакцину по любому из пп.1-8 в количестве от 0,1 мк до 1000 мк.

12. Способ по п.11, где профилактика или лечение усилены введением второй вакцины, включающей полноразмерный белок.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Данное изобретение раскрывает вакцину против хронических болезней, таких как бактериальная, вирусная или паразитная инфекция или рак, включающую пептидную смесь перекрывающихся пептидов, охватывающих полную аминокислотную последовательность белка, которая экспрессирована во время хронической фазы болезней, таких как хроническая инфекция, вызванных бактерией, персистирующим вирусом или паразитом, или белков, экспрессированных в злокачественных опухолях, способ создания таких вакцин, профилактику и лечение хронической болезни.

Предпосылки изобретения

В отличие от ограниченного числа болезней, для которых в настоящее время существуют вакцины, отсутствуют попытки разработки эффективных вакцин для большого числа болезней. Общей характеристикой большинства таких инфекционных болезней, например, рак, является их медленное развитие и проявление как хронических болезней, где болезнь протекает много лет вопреки существующему иммунному ответу хозяина. Это в конечном итоге часто приводит к иммунопатологии, что в некоторых случаях, таких как Clamydia thracomatis, является реальной причиной болезни человека, такой как воспалительное рубцевание маточной трубы, приводящее к бесплодию. Для некоторых болезней, таких как инфекция М. tuberculosis (ТВ), существует вакцина (BCG), но хотя вакцина может предотвратить острые проявления болезни, бактерия не выделена, и поэтому хроническая или латентная болезнь установлена. ТВ протекает фактически по 3 фазам. Во время острой фазы бактерии размножаются в органах, пока иммунный ответ нарастает до точки, при которой он может управлять инфекцией, вследствие чего бактериальная нагрузка достигает пика и начинает уменьшаться. После этого устанавливается хроническая или латентная фаза, где бактериальная нагрузка держится стабильно на низком уровне. На этой фазе М. tuberculosis проходит от активного размножения до состояния медленной или невоспроизводящейся персистентности, которая может длиться многие годы. Однако, в некоторых случаях ТВ инфекция может внезапно возобновиться и привести к открытой болезни. Факторы, приводящие к такому возобновлению главным образом не известны. В других случаях, таких как с Clamydia, инфекция может остаться безсимптомной, но протекающий воспалительный процесс вызывает более поздние клинические проявления, такие как бесплодие.

Иммунный ответ на многие из тяжелых болезней включает компонент и гуморального, и клеточно-опосредованного иммунного (CMI) ответа. CMI ответ направлен на иерархию Т клеточных антигенов и эпитопы из патогена. Эпитопы представляют собой аминокислотные (аа) отрезки из 7-9 аа (МНС I) и 12-15 аа (МНС II) (1). При хронических вирусных и бактериальных болезнях, таких как HIV (вирус иммунодефицита человека), ТВ, а также при раке, иерархия эпитопных ответов меняется с течением времени до нескольких иммунодоминантных эпитопов, которые постепенно составляют большую часть общего Т клеточного ответа, тогда как большое число других эпитопов, все из которых имеют потенциал связывания МНС класса I или II антиген представляющих молекул, являются субдоминантными или даже криптическими, возникая в Т клеточных ответах на уровнях, близких к или ниже уровня определения (2-6). При индуцировании вакцинацией (без конкуренции от доминантных эпитопов) ответы на такие субдоминантные эпитопы, как сообщали, были защитными, например, при ТВ (7), указывая, что эпитопы действительно экспрессированы во время естественной инфекции и могут быть распознаны эффекторными клетками на внедряющемся патогене. То, что такие ответы могут иметь преимущества по сравнению с ответами на иммунодоминантные эпитопы, как было подсказано исследованиями HIV, где "ускользающие" мутанты, дефицитные по иммунодоминантным эпитопам, и поэтому не определяющиеся иммунной системой, является главной проблемой разработки вакцины в настоящее время (8).

Использованию субдоминантных Т клеточных эпитопов в разработке вакцин до сих пор препятствовали две главных проблемы: i) потребность в большом списке различных эпитопов для обеспечения разнообразной человеческой популяции из-за изменчивости отдельных эпитопов, распознанных индивидуумами с различной композицией HLA (человеческие лейкоцитарные антигены); ii) потребность в идентификации субдоминантных эпитопов, для которых обнаружен только низкий уровень Т клеточных ответов, близкий к или ниже уровня определения иммунологических анализов (например, ELISPOT).

Olsen et al (7) описали, что вакцина на основе одного субдоминантного эпитопа ESAT6 может защищать от ТВ. Однако, смесь перекрывающихся пептидов, охватывающих полную область ESAT6, не применялась в этом исследовании.

В международной публикации WO 01016163 описана вакцина против вируса, включающая пептидную смесь, содержащую пептиды, которые активируют Т клетки, независимо от их HLA генотипа. Эта заявка касается применения пептидных смесей от гепатита В для облегчения широкой зоны действия, когда применяются для вакцинации генетически изменчивой человеческой популяции, таким образом, отсутствуют случаи неудачной вакцинации, наблюдаемые при иммунизации отдельными пептидами. Это изобретение не касается пептида, управляемого распространением Т клеток, направленных против субдоминантных Т клеточных эпитопов, важных для предупредительной и терапевтической вакцинации против хронических болезней, в отличие от данного изобретения.

В международной публикации WO 03011331 раскрыта прайм-буст вакцина. Для предотвращения усиленного ответа на доминантные эпитопы и сниженного ответа на субдоминантные эпитопы, примирование достигается с помощью ДНК или вирусного вектора, кодирующего нить эпитопов. После стадии примирования эпитопы применяются отдельно, в отдельных конструктах, или переносятся на отдельных носителях, для стимуляции ответа, в отличие от введения как единственной полиэпитопной ДНК или вирусного конструкта. Напротив, данное изобретение применяет отрезки аминокислотных последовательностей, охватывающих полный белок, в пептидной смеси с перекрыванием 6-20 аминокислот для примирования и необязательно реиммунизации с полным белком в качестве вспомогательной субъединицы вакцины, или также экспрессированных в вирусных системах доставки для максимальной индукции гуморальных ответов.

Вообще, отмечено, что при хронических болезнях иерархия эпитопных ответов меняется с течением времени, чтобы составить ответы только на несколько доминантных эпитопов. Однако, поскольку ответы на субдоминантные эпитопы оказались защитными (7), и поскольку ответ на эти эпитопы непосредственно не активирован хронической болезнью, хроническая болезнь представляет очевидную мишень для изобретения, в котором индуцируют иммунный ответ к широкому ряду эпитопов, включая и доминантные, а, наиболее важно, субдоминантные эпитопы.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение раскрывает вакцины, индуцирующие широкое распознавание доминантных и субдоминантных ответов на какой-либо данный антиген. Вакцина содержит перекрывающиеся фрагменты желаемого антигена в приемлемых вспомогательных средствах. Спектр Т клеток, таким образом, расширяется для включения не только иммунодоминантного эпитопа, распознанного при использовании интактной молекулы для иммунизации или индуцированного хронической инфекцией непосредственно, а также для индуцирования намного более широкого и сбалансированного ответа на ряд субдоминантных эпитопов. Главное преимущество данного изобретения заключается в том, что оно не требует предварительной информации о точной локализации или идентичности субдоминантных эпитопов и их распознавания в человеческой популяции, а расширяет спектр T клеток и, таким образом, общее число мишеневых специфических T клеток, примированных вакцинацией от нескольких иммунодоминантных эпитопов до множества эпитопов. По данному изобретению, направленному на хронические болезни с широким рядом ответов на субдоминантные эпитопы, наглядно используется иммунитет к этим болезням.

Детальное описание изобретения

Данное изобретение раскрывает вакцину против хронической болезни, такой как бактериальная, вирусная или паразитная инфекция или рак, включающую пептидную смесь, содержащую смежные перекрывающиеся пептиды, охватывающие целую аминокислотную последовательность белка, экспрессированного во время хронической фазы болезни.

Данное изобретение раскрывает применение смеси перекрывающихся пептидов, полученных от антигенного белка и/или нуклеиновой кислоты, кодирующей эти пептиды, для вакцины против хронической болезни, такой как бактериальная, вирусная или паразитная инфекция или рак.

Пептиды имеют длину 10-30 аминокислот, предпочтительно 12-20 аминокислот, где перекрывание со смежным пептидом составляет 6-20 аминокислот, предпочтительно 10-12 аминокислот.

Антигенный белок, который охватывает пептидную смесь, выбран из белков, экспрессированых во время хронической фазы болезни, и индуцирует клеточно опосредованный иммунный ответ в случае хронической болезни.

Предпочтительно белок выбран из бактерии, такой как вирулентная микобактерия, например, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum или Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae или Chlamydia trachomatis, или вируса, такого как вирус гепатита В или С, или паразита, такого как Leishmania или вызывающего малярию паразита Plasmodium falciparum, или из молекул, экспрессированных в злокачественных опухолях.

Пептиды не ограничены, но предпочтительны из белка, выбранного из белка М Tuberculosis, такого как ESAT6, Ag85A, Ag85B или ТВ10.4, или из белка Chlamydia trachomatis, такого как СТ184, СТ521, СТ443, СТ520, СТ521, СТ375, СТ583, СТ603, СТ610 или СТ681, или из белка вируса гепатита В или С, или из белка Plasmodium falciparum, такого как Msp1, Msp2, Msp3, Ama1, GLURP, LSA1, LSA3 или CSP.

Данное изобретение также раскрывает способ получения пептидной смеси по данному изобретению протеолитическим расщеплением белка с двумя или более средствами протеолитического расщепления, такими как протеолитические ферменты, например, трипсин, V-8 протеаза, AspN или химотрипсин, или химическими средствами, такими как CNBr или BNPS-скатол (2-(2-нитрофеннлсульфенил)-3-метил-3-бром-3Н-индол).

Пептидную смесь по данному изобретению можно применять для получения вакцины против хронической болезни, такой как бактериальная, вирусная или паразитная инфекция, или рак. Вакцина включает систему доставки, такую как вспомогательное средство. Вспомогательное средство выбрано из вспомогательного средства на основе катионных липосом или смеси поликатионного пептида [например, полилизин (KLK пептид) или полиаргинин] и олигодеоксинуклеиновых молекул [I-ODN].

Предпочтительное вспомогательное средство, основанное на катионных липосомах, представляет собой диметилдиоктадециламмония бромид/трегалозы дибегенат (DDA/TDB). Пептидную смесь, применяемую для вакцинации, можно смешать со сформированными заранее липосомами, или каждый пептид можно смешать со сформированными заранее липосомами, отдельные пептиды, сформулированные в липосомах затем смешивают перед иммунизацией так, что они становятся включенными отдельно в липосомах. Каждый пептид в пептидной смеси предпочтительно можно отдельно смешать с липосомами перед созданием пептидной смеси для оптимального взаимодействия с индивидуальными антиген представляющими клетками из иммунной системы, таким образом, обеспечивая максимальные ответы на все возможные эпигоны в молекуле.

Примером I-ODN является олнго dIC, например, 5' - ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC-3'. Полный обзор I-ODN приведен в международных публикациях WO0193905 и WO0193903, которые включены путем ссылок. Примером KLK пептида служит NH2KLKLLLLLKLK-COOH или KLKLLLLLKLK-NH2, а другими примерами поликатионных пептидов являются RLRLLLLLRLR-NH2, RLKLLLLLKLR-NH2, KFKFFFFFKFK-NH2, KWKWWWWWKWK-NH2 или KVKWVVVKVK-NH2. Полный обзор поликатионных пептидов приведен в международной публикации WO0232451, которые включены путем ссылок.

Предпочтительным вспомогательным средством на основе смеси поликатионного пептида и олигодеоксинуклеиновых молекул является IC31. Вспомогательное средство IC31 состоит из смеси пептида NH2KLKLLLLLKLK-COOH (полученного от Multiple Peptide Systems, Сан-Диего, Калифорния, США) и олигонуклеотида 5' - ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC-3' (приобретенного у Proligo, Боулдер, USA)

Данное изобретение также раскрывает способ и вакцину для профилактики или терапевтического лечения хронической болезни у животного, включая человека, при котором животному вводят вакцину по данному изобретению. Необязательно профилактика или лечение представляет собой реиммунизацию путем введения второй вакцины, включающей полноразмерный белок, охваченный пептидной смесью во вспомогательном средстве или экспресснрованный в вирусных системах доставки, или как чистой ДНК вакцины, для оптимальной реиммунизации CMI, например, гуморального ответа.

Данное изобретение далее раскрывает вакцину, в которой аминокислотная последовательность образует соединения с липидами или конъюгирована непосредственно с TLR (Toll-подобный рецептор) агонистом, таким как CPG, так чтобы позволить самоадъювантный эффект полипептида.

Предпочтительный вариант осуществления по данному изобретению представляет собой вакцину, включающую пептидную смесь по данному изобретению со вспомогательным средством, как описано выше.

Определения

Хроническая болезнь

Хроническая болезнь является длительно протекающей или рецидивирующей болезнью. Выражение хронический описывает течение болезни, или темп ее начала и развития. Хроническое течение отличается от рецидивного течения; рецидивные болезни неоднократно вновь возвращаются с периодами ремиссии. Хронические инфекции могут быть вызваны бактерией, например, Mycobacteria sp. или Chlamydia sp., среди других, вирусом, например, гепатита или HIV, паразитом, например, вызывающим малярию паразитом, или Leishmania, или болезнями, такими как рак, диабет и т.п.

Пептиды

Выражение "пептид" в данном изобретении следует понимать в обычном его значении. Это цепь аминокислоты какой-либо длины, являющаяся частью или фрагментом белка, в которой аминокислотные остатки связаны ковалентными пептидными связями.

Пептид может быть химически модифицирован гликозилированнием, образованием соединений с липидами (например, путем химической липидизации с палмитоилоксисукцинимидом, как описано в (9), мечением с PAM3Cys (18) или с додеканоил хлоридом, как описано в (10)), включением простетических групп, или содержанием добавочных аминокислот, например, меченный гистидином или сигнальный пептид, или непосредственной конъюгацией с TLR агонистом (например, как описано в (11)).

Таким образом, каждый пептид может быть охарактеризован специфическими аминокислотами, и кодироваться специфическими нуклеиновокислотными последовательностями. Будет понятно, что такие последовательности включают аналоги и варианты, полученные рекомбинантными или синтетическими способами, при которых такие полипептидные последовательности модифицируются замещением, вставкой, добавлением или делецией одного или более аминокислотного остатка в рекомбинантном полипептиде, и все еще будут иммуногенными в каком-либо из биологических анализов, описанных здесь. Замещения предпочтительно являются "консервативными". Они определены согласно следующей таблице. Аминокислоты в одном и том же блоке во второй колонке и предпочтительно в одной и той же линии в третьей колонке можно заменить друг на друга. Аминокислоты в третьей колонке обозначены однобуквенным кодом.

Алифатические	Неполярные	GAP
		ILV
	Полярные-незаряженные	CSTM
		NQ
	Полярные-заряженные	DE
		KR
Ароматические		HFWY

Пептидная смесь представляет собой жидкую смесь фрагментов белка.

Предпочтительная пептидная смесь по данному изобретению основана на белке из М. Tuberculosis, таком как ESAT6, Ag85A, Ag85B или ТВ10.4, или из Chlamydia trachomatis, таком как СТ184, СТ521, СТ443, СТ520, СТ521 или СТ375, или из вируса гепатита, или из Plasmodium falciparuman, таком как momp, omp, msp1, msp3, ama1 или glurp. Она также может быть пептндной смесью или протеолитическим гидролизатом на основе слитой молекулы, например, конструкты значимой вакцины против ТВ, предварительно описанные в PCT/DK2006/000356. В общем, все пептидные смеси белков, индуцирующих CMI ответ, которые можно применять в вакцинах против хронической болезни, можно применять как вакцину для индуцирования усиленного профилактического или терапевтического ответа.

Везде в данном описании, если контекст не требует иного, выражение "включать", или варианты его, такие как "включает" или "включающий", следует понимать как включение установленного элемента, или целого, или группы элементов или целых, но без исключения какого-либо другого элемента или целого, или группы элементов или целых.

Хотя минимальная длина Т-клеточного эпитопа, как показали, составляет, по меньшей мере, 6 аминокислот, нормально, если такие эпитопы состоят из более длинных отрезков аминокислот. Следовательно, предпочтительно, что полипептидный фрагмент по данному изобретению имеет длину, по меньшей мере, 7 аминокислотных остатков, например, по меньшей мере, 8, по меньшей мере, 9, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 14, по меньшей мере, 16, по меньшей мере, 18, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 22, по меньшей мере, 24 и, по меньшей мере, 30 аминокислотных остатков. Следовательно, в важном варианте осуществления способа по данному изобретению предпочтительно, что полипептидный фрагмент имеет длину, самое большее, 50 аминокислотных остатков, например, самое большее, 40, 35, 30, 25 и 20 аминокислотных остатков. Ожидается, что пептиды, имеющие длину от 10 до 20 аминокислотных остатков, будут наиболее эффективными как МНС класса II эпитопы, и поэтому особо предпочтительные длины полипептидного фрагмента, применяемого в способе по данному изобретению, составляют 18, например, 15, 14, 13, 12 и даже 11 аминокислотных остатков. Ожидается, что пептиды длиной от 7 до 12 аминокислотных остатков будут наиболее эффективными как МНС класса I эпитопы, и поэтому особо предпочтительные длины полипептидного фрагмента, применяемого в способе по данному изобретению, составляют 11, например, 10, 9, 8 и даже 7 аминокислотных остатков.

Эпитопы

Под Т клеточными эпитопами подразумевается последовательность аминокислот, которая распознается специфическими Т клетками посредством их Т клеточного рецептора после представления антиген представляющей клетки в контексте МНС класса I или II.

Доминантный эпитоп представляет собой последовательность аминокислот, которые, когда являются частью белка, индуцируют мощный Т клеточный ответ, и часто главная часть ответа на антиген направлена на несколько Т доминантных Т клеточных эпитопов.

Субдоминантный эпитоп представляет собой последовательность аминокислот, которые, когда являются частью белка, индуцируют сильный Т клеточный ответ, хотя эпитопы иммуногенны и способны индуцировать существенный Т клеточный ответ, когда выделены из белка.

Под смесью перекрывающихся полипептидов или белковых фрагментов подразумевается смесь 10-30 меров с перекрыванием 6-20 аминокислот, охватывающим полный белок.

Варианты

Общим признаком полипептидов по данному изобретению является их способность индуцировать иммунологический ответ, как показано в примерах. Подразумевается, что вариант полипептида по данному изобретению, полученный замещением, вставкой, добавлением или делецией, также может быть иммуногенным, как определено каким-либо из анализов, описанных здесь.

Иммунный индивидуум

Иммунный индивидуум означает человека или животное с устраненной или управляемой инфекцией.

Иммунный ответ

Иммунный ответ можно изучать одним из нескольких способов.

- In vitro клеточный ответ определяют индукцией высвобождения релевантного цитокина, такого как IFN- , или индукцией пролиферации в лимфоцитах, взятых у животного или человека, в данный момент или ранее инфицированного вирулентной микобактерией или иммунизированного релевантной пептидной смесью. Индукцию выполняют добавлением пептидной смеси или иммуногенной порции смеси в суспензию, включающую от 2×10⁵ клеток до 4×10⁵ клеток на лунку. Клетки выделяют из крови, селезенки, лимфатических узлов, печени или легкого и добавляют полипептид или иммуногенную порцию до концентрации не более 20 µг на мл суспензии, а стимуляцию выполняют от двух до пяти дней. Для изучения клеточной пролиферации клетки метят радиоактивным тимидмном и через 16-22 часа инкубации пролиферацию измеряют подсчетом в жидком сцинтилляторе. Положительным ответом определяют ответ, превышающий фон плюс два стандартных отклонения. Высвобождение IFN- можно определить методом ELISA, хорошо известным специалисту в данной области. Положительным ответом определяют ответ, превышающий фон плюс два стандартных отклонения. Цитокины, отличные от IFN- , могли быть релевантными при изучении нммунологического ответа на полипептид, такой как IL-12, TNF- , IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, TGF- . Другим и более чувствительным способом выявления иммунного ответа является способ ELISpot, при котором определяют частоту клеток, продуцирующих IFN- . Планшет ELIspot (MAHA, Millipore), предварительно покрытый антителами к IFN- мыши (PharMingen) с оцененным числом клеток, выделенных из крови, селезенки или легкого (типично от 1 до 4×10 ⁵ клеток/лунка), инкубируют в течение 24-32 часов в присутствии пептидной смеси или иммуногенной порции, получая концентрацию не более 20 µг на мл. Затем планшеты инкубируют с биотинилированными антителами против IFN- , затем инкубируют со стрептавидин-щелочной фосфатазой. Клетки, продуцирующие IFN- , идентифицируют добавлением BCIP/NBT (Sigma), релевантного субстрата, дающего начало пятнам. Эти пятна можно подсчитать с помощью препаровальной лупы. Также можно определить присутствие мРНК, кодирующей релевантный цитокин, с помощью метода GWH (полимеразная цепная реакция). Обычно один или более цитокин будет измеряй с помощью, например, ПЦР, ELISPOT или ELISA. Специалист в данной области оценит, что существенное увеличение или уменьшение в количестве любого из этих цитокинов, индуцированных специфической пептидной смесью, можно применять при оценивании иммунологической активности полипептида.

- In vitro клеточный ответ можно также определить применением Т клеточных линий, полученных от иммунного или инфицированного индивидуума, где Т клеточные линии управляются или живой бактерией, экстрактом из бактериальной клетки, или культуральным фильтратом в течение 10-20 дней с добавлением IL-2. Индукцию выполняют добавлением не более 20 µг пептидной смеси на мл суспензии к Т клеточным линиям, содержащим от 1×10 ⁵ клеток до 3×10⁵ клеток на лунку, а инкубацию выполняют от двух до шести дней. Индукцию IFN-y или высвобождение другого релевантного цитокина определяют с помощью ELISA. Стимуляцию Т клеток также можно исследовать определением клеточной пролиферации с помощью радиоактивно меченного тимидина, как описано выше. Для обоих анализов положительным ответом определяют ответ, превышающий фон плюс два стандартных отклонения.

- In vitro клеточный ответ можно определить как положительный DTH ответ после внутрикожной инъекции или пластыря местного нанесения самое большее 100 µг полипептида или иммуногенной порции индивидууму, который клинически или субклинически инфицирован вирулентной бактерией, положительный ответ заключается в диаметре, по меньшей мере, 5 мм через 72-96 часов после инъекции или нанесения.

- In vitro гуморальный ответ определяют ответом специфических антител у иммунного или инфицированного индивидуума. Присутствие антител можно определить методом ELISA или вестерн-блот, где пептидная смесь или иммуногенная порция абсорбируется либо на нитроцеллюлозной мембране, либо на полистирольной поверхности. Сыворотку предпочтительно разбавляют PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером) от 1:10 до 1:100, добавляют к абсорбированной пептидной смеси, и выполняют инкубацию в течение 1-12 часов. Присутствие специфических антител можно определить применением меченных вторичных антител, измеряя OD, например, с помощью ELISA, где положительным ответом определяют ответ, превышающий фон плюс два стандартных отклонения, или, альтернативно, визуального ответа в вестерн-блоте.

- Другим релевантным параметром является оценка защиты у животных моделей, индуцированной после вакцинации с пептидной смесью во вспомогательном средстве или после ДНК вакцинации. Приемлемые животные модели включают приматов, морских свинок или мышей, у которых вызывают инфекцию. Снятие показаний для индуцированной защиты могло бы снизить бактериальную нагрузку в мишеневых органах, по сравнению с невакцинированными животными, продлить время приживления по сравнению с невакцинированными животными и уменьшить потерю веса по сравнению с невакцинированными животными.

Способы получения

В общем, антигены и ДНК последовательности, кодирующие такие антигены, можно получить с помощью какой-либо одной из множества методик. Пептидную смесь можно получить синтетически, когда пептидный фрагмент имеет менее около 100 аминокислот, обычно менее 50 аминокислот, с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области, таких как коммерчески доступные твердо-фазовые методы, где аминокислоты последовательно добавляют для наращивания аминокислотной цепи.

При конструировании и приготовлении плазмидной ДНК, кодирующей пептидную смесь, как определено данным изобретением, для ДНК вакцинации можно применять хозяйский штамм, такой как Е.coli. Затем можно приготовить плазмидную ДНК из культур хозяйского штамма, несущего интересующий плазмид, и очистить с помощью, например, набора колонок Qiagen Giga-Plasmid (Qiagen, Санта-Кларита, Калифония, США), включая этап удаления эндотоксина. Предпочтительно, чтобы плазмид ДНК, применяемый для ДНК вакцинации, не содержал эндотоксин.

Протеазный гидролизат антигенов

Набор перекрывающихся пептидов можно получить протеолитическим расщеплением интактного белка, который может быть экспрессирован как рекомбинантный меченный белок, например, в Е.coli, с последующей очисткой колоночной хроматографией, такой как металл-хелатная хроматография. Можно выбрать два или более средства протеолитического расщепления, которые образуют разные фрагменты и, таким образом, коктейль перекрывающихся пептидов. Можно использовать протеолитические ферменты, такие как трипсин, V-8 протеаза, AspN или химотрипсин, или химические средства, подобные CNBr или BNPS-скатолу. Число сайтов расщепления и длина образованных фрагментов определяется аминокислотной последовательностью белка и специфическим средством расщепления, например, Asp-N гидролизует белки на N-концевой стороне остатков аспарагиповой кислоты и цистеиновой кислоты.

V-8 протеаза расщепляет на карбоксильной стороне глутаминовой кислоты в аммоний бикарбонатном буфере при рН 7,8. Для протеолитических ферментов возможно соединение фермента с гранулами перед расщеплением (16), и это соединение позволит удалить фермент после завершения расщепления центрифугированием гранул. Альтернативно, протеазу можно удалить из гидролизатной смеси хроматографическими способами, такими как гелевая фильтрация или обратно-фазовая ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). После гидролизации белка выполняют масс-спектрометрию гидролизата для. подтверждения, что расщепление белка проходит, как ожидалось. Наконец, две гидролизатные смеси объединяют для формирования смеси перекрывающихся пептидов.

Белковая вакцина

Вакцинация с рекомбинантным белком будет индуцировать Т клеточный ответ к ограниченному числу доминантных пептидных эпитопов в этом белке. Напротив, вакцинация со смесью перекрывающихся пептидов, охватывающих полную аминокислотную последовательность белка, образует Т клеточный ответ против повышенного числа эпитопов, являющихся и доминантными, и субдоминантными пептидными эпитопами.

Данное изобретение касается композиции вакцины, включающей пептидную смесь по данному изобретению. Чтобы гарантировать оптимальное выполнение такой композиции вакцины, предпочтительно включение иммунологически и фармацевтически приемлемого носителя, наполнителя или вспомогательного средства.

Эффективная вакцина, в которой пептидная смесь по данному изобретению распознается животным, будет способна в животной модели снизить бактериальную нагрузку на мишеневые органы, продлить время приживления и/или снизить потерю веса после стимулирования инфекционным организмом, по сравнению с невакцинированными животными, или когда применяется как предупредительная или терапевтическая вакцина.

Приемлемые наполнители выбраны из группы, содержащей разбавитель и суспендирующее средство. Вспомогательное средство предпочтительно выбрано из группы, содержащей DDA (4,4'-дихлородифенилуксусная кислота), Quil A, поли I:С, алюминия гидроксид, неполное вспомогательное средство Фрейнда, IFN- , IL-2, IL-12, монофосфорил липид A (MPL), трегалозы димиколат (TDM), TDB и мурамил дипептид (MDP).

Вспомогательное средство определяют как вещество, которое неспецифически усиливает иммунный ответ на антиген. В зависимости от природы вспомогательное средство может содействовать клеточно-опосредованному иммунному ответу, гуморальному иммунному ответу или их смеси. Поскольку усиление иммунного ответа является неспецифическим, понятно, что одно и тоже вспомогательное средство можно применять с различными антигенами для содействия ответам против различных мишеней, например, антиген из М. tuberculosis для содействия иммунитету против М. tuberculosis, или антиген, полученный из опухоли, для содействия иммунитету против опухолей определенного вида.

"Липосомы" определяют как закрытые пузырьковые структуры, состоящие из одного или более липидных двойных слоев, окружающих водное ядро. Каждый липидный двойной слой состоит из двух липидных одинарных слоев, каждый из которого имеет гидрофобную "хвостовую" область и гидрофильную "головную" область. В двойном слое гидрофобные "хвосты" липидных одинарных слоев ориентированы к внутренней части двойного слоя, в то время как гидрофильные "головы" ориентированы к наружной части двойного слоя. У липосом может быть ряд физико-химических свойств, таких как размер, липидная композиция, заряд поверхности, текучесть и число мембран двойного слоя. По числу липидных двойных слоев липосомы можно классифицировать как однослойные пузырьки (UV), включающие единственный липидный двойной слой, или многослойные пузырьки (MLV), включающие два или более концентрических двойных слоя, каждый отделяется от следующего слоем воды. Растворимые в воде соединения задержаны в водной фазе/ядре липосом, в отличие от липофильных соединений, которые захвачены в ядре липндных двухслойных мембран.

Пептидную смесь, применяемую для вакцинации можно смешать со сформированными заранее липосомами, как описано ранее (международная заявка WO 2006002642, включенная в данное описание ссылкой), или каждый пептид можно смешать со сформированными заранее липосомами тем же способом, затем отдельные пептиды, сформулированные в липосомах смешивают перед иммунизацией.

Стандартное получение липосом заключается в растворении липидов в органическом растворителе, который затем выпаривают досуха, оставляя тонкую липидную пленку внутри пробирки для анализа. Сухую липидную пленку затем гидратируют в приемлемом количестве водной фазы, а смесь нагревают до температуры выше фазового перехода липидов и позволяют "вздуться". Получающиеся липосомы, которые состоят из многослойных пузырьков (MLV), диспергируют встряхиванием пробирки для анализа.

Существуют различные принципы взаимодействия пептида или пептидных смесей с липосомами. Один способ заключается в поверхностной ассоциации (путем электростатических или гидрофобных взаимодействий) пептидов с липосомами при инкубации пептидов со сформированными заранее липосомами (19). Также возможно осуществить ковалентное присоединение пептидов к поверхности липосом химическим сшиванием (например, как описано в ссылке 20). Кроме того, пептиды можно капсулировать в липосомах различными способами. Один способ заключается в добавлении пептидов непосредственно в липидную пленку с последующей регидрацией. Другой способ описывает добавление пептидов в буфер, применяемый для регидрации липосом из липидной пленки. Кроме того, пептиды можно капсулировать способом дегидрации-регидрации (21), при котором пептид капсулируют путем сублимационной сушки с последующей регидрацией лиофилизированных липосом. Альтернативно, антиген капсулируют с помощью методики замораживания и оттаивания, описанной Pick (22), и методикой Bally et al. в патенте США № 4975282. В этой методике пузырьки смешивают с белковым антигеном и многократно быстро замораживают в жидком азоте и нагревают до температур, выше главной температуры фазового перехода релевантных липидов. Пузырьки далее можно обработать для удаления какого-либо незахваченного антигена, например, промыванием и центрифугированием.

Наконец, пептидную смесь затем можно доставить липосомами двумя способами. Пептиды можно либо смешать перед взаимодействием с липосомами, либо пептиды можно смешать после взаимодействия отдельных пептидов с липосомами, как описано выше.

Пептиды также можно капсулировать в липосомах путем добавления пептидов в буфер, применяемый для регидрации липосом из липидной пленки или в замороженной высушенной форме.

Полипептид можно также химически модифицировать гликозилированием, образованием соединений с липидами (например, химической липидизацией с палмитоилоксисукцинимидом, как описано Mowat et al. 1991, мечением PAMSCys (18) или додеканоил хлоридом, как описано Lustig et al. 1976), включением простетических групп или непосредственной конъюгацией с TLR агонистом (например, как описано Seder, 2006).

Получение вакцин, содержащих пептидные последовательности в качестве активных ингредиентов, хорошо известно в данной области, примером служат патенты США 4608251; 4601903; 4599231 и 4599230, включенные в данное описание ссылкой.

Другие способы достижения вспомогательного эффекта для вакцины включают применение средств, таких как алюминия гидроксид или фосфат (квасцы), синтетические полимеры Сахаров (Карбопол), можно также использовать агрегацию белка в вакцине термообработкой, агрегацию путем реактивирования обработанных пепсином (Fab) антител к альбумину, смесь с бактериальными клетками, такими как С.parvum, или эндотоксины, или липидосахаридные компоненты грамотрицательных бактерий, эмульсию в физиологически приемлемых масляных наполнителях, таких как маннид моноолеат (Aracel A), или эмульсию с 20 процентным раствором перфторуглерода (Fluosol-DA), применяемым как блоковый заместитель. Другие возможности включают применение модулирующих иммунитет веществ, таких как цитокины или синтетические IFN- индукторы, такие как поли I:С, в комбинации с вышеупомянутыми вспомогательными средствами.

Другой интересной возможностью для достижения вспомогательного эффекта является применение методики, описанной в (17) (которая, таким образом, включена здесь путем ссылки). Кратко, релевантный антиген, такой как антиген данного изобретения, может быть конъюгирован с антителом (или связывающим антиген фрагментом антитела) против Fey рецепторов на моноцитах/макрофагах.

Вакцины вводят способом, согласующимся с дозированным составом, и в количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от субъекта лечения, включая, например, способность иммунной системы индивидуума показывать иммунный ответ и степень желаемой защиты. Приемлемые диапазоны дозировки составляют порядка нескольких сотен микрограмм активного ингредиента на вакцинацию с предпочтительным диапазоном от около 0,1 µг до 1000 µг, например, диапазоном от около 1 µг до 300 µг и особенно диапазоном от около 10 µг до 50 µг. Приемлемые режимы начального введения и бустер-доз также варьируют, но служат типичным образцом начального введения с последующими инокуляциями или другими введениями.

Способ применения может широко варьировать. Применяются любые традиционные способы введения вакцины. Как полагают, они включают оральное введение в твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентерально, инъекцией или подобное. Дозировка вакцины будет зависеть от пути введения и будет варьировать в зависимости от возраста вакцинируемого индивидуума и, в меньшей степени, от его размера.

Вакцины традиционно вводят парентерально, инъекцией, например, или подкожно, или внутримышечно. Добавочные составы, приемлемые для других способов введения, включают суппозитории и в некоторых случаях оральные составы. Традиционные связывающие вещества и носители для суппозиториев могут включать, например, полиалкаленгликоли или триглицериды; такие супозитории могут быть сформулированы из смеси, включающей активный ингредиент в диапазоне 0,5%-10%, предпочтительно 1-2%. Оральные составы включают такие обычно применяемые формообразующие средства как, например, фармацевтических категорий маннитол, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и подобное. Эти композиции принимают форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, составов длительного высвобождения или порошков, и преимущественно содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%.

Во многих случаях придется выполнять многократные введения вакцины. Особенно, вакцины можно вводить для предотвращения инфекции. Когда вводят для предотвращения инфекции, вакцина является профилактической до наличия определяемых клинических признаков или симптомов. Поскольку современные вакцины, например, BCG, оказывается, индуцируют эффективный, но непродолжительный иммунный ответ, можно также разработать профилактические вакцины для применения в качестве вакцин для реиммунизации. Такие вакцины вводят индивидуумам, которые ранее были вакцинированы, для продления периода защиты.

В случаях, когда индивидуум уже инфицирован, или предполагается, что стал инфицированным, предварительная вакцинация, возможно, обеспечила достаточный иммунитет для предотвращения первичной болезни, но, как обсуждалось ранее, реиммунизация этого иммунного ответа не поможет против латентной инфекции. В такой ситуации вакцина обладает особым преимуществом, как терапевтическая вакцина, разработанная для эффективного воздействия на латентную стадию инфекции.

Важно, что при хронических болезнях, таких как ТВ, рак, гепатит и HIV, долговременное равновесие между хозяином и патогеном часто приводит к иммунным ответам, фокусированным на нескольких иммуно-доминантных эпитопах. Индуцнрование широкого сбалансированного ответа на диапазон эпитопов в данном белке нельзя достичь иммунизацией с рекомбинантным белком, что дает ответ только на ограниченное число доминантных эпитопов. Напротив данное изобретение указывает, что вакцинация со смесью перекрывающихся пептидов действительно индуцирует Т клеточный иммунный ответ на диапазон эпитопов, включая субдоминантные эпитопы, в данном белке. По данному изобретению индукция ответов на субдоминантные эпитопы, поэтому, имеет особое преимущество при этих болезнях, потому что можно индуцировать иммунный ответ против защитных эпитопов, которые не индуцированы хронической болезнью непосредственно или вакцинациями с данным белком в рекомбинантной форме полной длины. Применение технологии вакцины пептидной смеси традиционной предупредительной вакцинацией или постэкспозицией терапевтическим путем превосходит, с намного более высокой активностью, традиционные вакцины на основе полноразмерных молекул против этих хронических болезней.

Кроме того, для хронических болезней, где важен гуморальный иммунитет, можно индуцировать оптимально широкий Т клеточный ответ и максимальный В клеточный ответ на тот же белок. В этой ситуации первичную иммунизацию выполняют со смесью перекрывающихся пептидов (во вспомогательном средстве), охватывающих полную последовательность данного белка, а реиммунизацию выполняют со второй вакциной, включающей тот же белок в рекомбинантной форме во вспомогательном средстве. Таким образом, широкий Т клеточный ответ против доминантных и субдоминантных эпитопов позволит максимальную активность Т хелперных клеток, и, таким образом, очень сильный ответ антитела. Образующийся ответ представляет собой широкий Т клеточный и максимальный ответ антитела на тот же антиген со специфическим применением против хронических болезней.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1

А. Анализ ESAT-6 перекрывающихся пептидов. В. Аминокислотная последовательность 15-ESAT-6.

Фигура 2. Иммуногенность ESAT6 и 15ESAT6 в спленоцитах

Группы F1 (Balb/cxC57BL/6) мышей подкожно вакцинировали трижды с двухнедельными интервалами или с солевым раствором, ESAT6, или 15Е8АТ6 в DDA/TDB. Через три недели после окончательной вакцинации проанализировали клетки селезенки с помощью ELISA для IFN-гамма секреции после стимуляции с 1 мкг/мл ESAT6, 15ESAT6 или одним из 13 перекрывающихся пептидов, покрывающих ESAT6 последовательность (Р1-Р13, как обозначено на фигуре, также показано на фигуре 1).

Фигура 3. Защитная эффективность ESAT6 и 15ESAT6

Группы F1 (Balb/cxC57BL/6) мышей подкожно вакцинировали трижды с двухнедельными интервалами или с солевым раствором, BCG, или DDA/TDB с ESAT6 или 15ESAT6. Через шесть недель после последней вакцинации мышей заразили вирулентной М. tb. Через шесть недель после заражения мышей умертвили и в легком измерили бактериальную нагрузку (КОЕ).

Фигура 4. ТВ10.4 перекрывающиеся пептиды, Р1-Р9

Фигура 5. Вакцинация с рекомбинантным ТВ10 с последующей in vitro стимуляцией отдельных пептидов Р1-Р9

In vitro IFN- ответы клеток от мышей, трижды вакцинированных DDA/TDB-ТВ10.4 в DDA/TDB. Клетки отобрали через две недели после окончательной вакцинации из крови и стимулировали 0,5 мкг/мл определенного пептида.

Фигура 6. Распознавание ТВ10-4 пептидов Р1-Р9 после ващинации отдельными пептидами

In vitro IFN- ответы клеток мышей, трижды вакцинированных отдельными ТВ10.4 пептидами в DDA/TDB. Клетки отобрали через две недели после окончательной вакцинации из крови и стимулировали 0,5 мкг/мл того же пептида, применяемого для вакцинации, а секрецию IFN- определили с помощью ELISA.

Фигура 7. Защитная способность ТВ10-4 пептидов Р1-Р9

Бактериальную нагрузку у вакцинированных мышей (выраженную как logic в КОЕ защите), зараженных аэрозольным путем вирулентной М. tb., определяли через шесть недель после последней вакцинации. Через шесть недель после заражения мышей умертвили, и бактериальную нагрузку (КОЕ) измерили в легком. (*Р<0,05 по сравнению с невакцинированными мышами, ANOVA и анализ Тьюки).

Фигура 8. Распознавание ТВ10-4 пептидов Р1-Р9 после вакцинации ТВ10-4 пептидной смесью

In vitro IFN- ответы клеток от мышей, трижды вакцинированных DDA/TDB-ТВ10.4-пептидной смесью. Клетки отобрали через две недели после окончательной вакцинации из крови и стимулировали 0,5 мкг/мл пептида или ТВ10.4 белка, как определено.

Фигура. 9. Бактериальная нагрузка у мышей, вакцинированных ТВ10.4 или ТВ10.4-пептидом, инфицированных М. tb.

Бактериальную нагрузку у вакцинированных мышей (выраженную как log₁₀ в КОЕ) по сравнению с невакцинированными контролями, зараженными аэрозольным путем вирулентной М. tb., определили через десть недель после первой вакцинации. Через шесть недель после заражения мышей умертвили, и бактериальную нагрузку (КОЕ) измерили в легком. (*Р<0,05, ANOVA и анализ Тьюки).

Фигура 10

Анализ СТ521 перекрывающихся пептидов.

Фигура 11

Мышей подкожно вакцинировали трижды с двухнедельными интервалами смесью всех ESAT-6 пептидов (Р1-Р13), а иммунный ответ, измерянный с помощью секреции IFN-гамма, исследовали с помощью культивируемых клеток крови с каждым из отдельных ESAT-6 пептидов Р1-Р13.

Фигура 12

Мышей подкожно вакцинировали трижды с двухнедельными интервалами или ESAT-6, или ESAT-6-пептидной смесью (Р1-Р13). Через шесть недель после последней вакцинации мышей подвергли аэрозольному заражению вирулентной М. tb. Через 10 недель после заражения мышей умертвили, а число бактерий определили в легких.

Примеры

Пример 1

ESAT-6

Чтобы исследовать, в какой степени экспрессированный Mycobacterium tuberculosis антиген ESAT-6 содержит доминантные и субдоминантные эпитопы, мышей трижды вакцинировали рекомбинантным белком ESAT-6 с двухнедельным интервалом, а клетки отобрали через две недели после окончательной вакцинации из крови и стимулировали определенными ESAT-6 пептидами (Фиг.1А), где после определили секрецию IFN-гамма с помощью ELISA. Результаты показали индукцию IFN-гамма продуцирующих Т клеток, специфических по Р1 ив меньшей степени Р2. Удаление иммунодоминантного эпитопа Р1 из ESAT6 (дающее конструкт, названный " 15-ESAT-6, в котором удалены аминокислоты 1-15" (Фиг.1В)) привело к иммунному распознаванию новых эпитопов, Р2 и, в частности, Р3 (Фиг.2). Это показало, что Р1 является доминантным эпитопом, а Р2 и Р3 составляют субдоминантные (но иммуногенные) эпитопы.

Затем определили, были ли субдоминантные эпитопы в состоянии обеспечить защиту против инфекции М. tb. Мышей подкожно вакцинировали трижды с двухнедельными интервалами или солевым раствором, BCG, или DDA/TDB с ESAT6 или 15Е8АТ6. Через шесть недель после последней вакцинации мышей заразили вирулентной М. tb. Через шесть недель после заражения мышей умертвили, а бактериальную нагрузку (КОЕ) измерили в легком.

Защитные эксперименты показали, что 15-ESAT-6 обеспечивает большую защиту, чем ESAT-6 (Фиг.3), указывая, что субдоминантные пептиды (эпитопы) Р2 и Р3 действительно были способны индуцировать иммунный ответ, который обеспечивает защиту против инфекции М. tb.

Затем определили, приведет ли вакцинация смесью всех перекрывающихся ESAT-6 пептидов к более широкому распознаванию Р1-Р13 по сравнению с мышами, вакцинированными рекомбинантным белком ESAT-6. Мышей вакцинировали трижды с двухнедельными интервалами смесью всех пептидов, а иммунный ответ исследовали с помощью культивируемых клеток крови с каждым из отдельных ESAT-6 пептидов Р1-Р13 (Фиг.11).

Результаты показали, что, в отличие от вакцинации рекомбинантным белком ESAT-6 вакцинация смесью ESAT-6 пептидов (Р1-Р13) привела к более широкому распознаванию пептидов (Фиг.11).

Для проверки, был ли более широкий ответ к ESAT-6 отражен в защите против инфекции с М. tuberculosis, по сравнению с белком, индуцированным вакцинацией рекомбинантным белком ESAT-6, мышей вакцинировали трижды с двухнедельными интервалами или ESAT-6, или ESAT-6-пептидной смесью. Через шесть недель после последней вакцинации мышей подвергли аэрозольному заражению вирулентной М. tb. Через 10 недель после заражения мышей умертвили, а число бактерий определили в легких.

Результаты показали, что мыши, вакцинированные смесью ESAT-6 пептидов, не только показали более широкое распознавание ESAT-6, но также были значительно более защищенными против инфекции М. tb., по сравнению с мышами, вакцинированными рекомбинантным белком ESAT-6 (Фиг.12). Таким образом, вакцинация смесью ESAT-6 пептидов ведет к более широкому распознаванию ESAT-6 эпитопов, которые в свою очередь индуцируют значительно более высокую защиту против инфекции М. tb., по сравнению с вакцинацией рекомбинантным белком ESAT-6.

Пример 2

ТВ10.4

Затем анализировали другой белок, экспрессированный М. tb., ТВ10.4. Мышей трижды вакцинировали с двухнедельным интервалом рекомбинантным ТВ10.4, а клетки отобрали через две недели после окончательной вакцинации из крови, стимулировали 0,5 мкг/мл определенных ТВ10.4 пептидов (Фиг.4), и определяли секрецию IFN-гамма с помощью ELISA.

Результаты показали, что вакцинация ТВ10.4 главным образом индуцировала Р3 специфические Т клетки (Фиг.5). Поэтому Р3 составлял доминантный эпитоп.

Пример 3

Чтобы проанализировать, была ли недостаточность Т клеток, отвечающих на пептиды Р1, Р2, Р4, Р5, Р6 и Р9 (и до некоторой степени Р7 и Р8), обеспечена этими пептидными эпитопами, являющимися субдоминантными или неиммуногенными, вакцинировали отдельными ТВ10.4 пептидамн (Р1-Р9). После вакцинации очищенные лимфоциты стимулировали in vitro теми же пептидами, применяемыми для вакцинации, а секрецию IFN- определили с помощью ELISA. Результаты показали, что другие субдоминантные (при вакцинации рекомбинантным белком ТВ10.4) пептиды также были сильно иммуногенными. В частности, вакцинация пептидом 1 или 3, или, по меньшей мере, Р7, Р8 или Р9, индуцировала специфический Т клеточный ответ (Фиг.6).

Кроме того, все субдоминантные пептиды, в частности, Р1, Р7, Р8, Р9, защищали от инфекции М. tb. (Фиг.7). Вакцинация доминантным пептидным эпитопом Р3 также индуцировала значительную защиту.

Пример 4

Определив существование субдоминантных эпитопов при вакцинации рекомбинантным белком ТВ10.4, определили, приведет ли вакцинация смесью всех перекрывающихся ТВ10.4 пептидов к более широкому распознаванию Р1-Р9, чем у мышей, вакцинированных рекомбинантным белком ТВ10.4. Мышей трижды вакцинировали с двухнедельными интервалами смесью всех пептидов, а иммунный ответ исследовали с помощью культивируемых клеток крови с каждым из отдельных ТВ10.4 пептидов Р1-Р9 (Фиг.8).

Результаты показали, что, в отличие от вакцинации рекомбинантным белком ТВ10.4, вакцинация смесью ТВ10.4 пептидов (Р1-Р9) привела к намного более широкому распознаванию пептидов. В частности, все Р1, Р3 и Р8 были в значительной степени распознаны (Фиг.8).

Пример 5

Чтобы проанализировать, был ли более широкий ответ на ТВ10.4 отражен в защите против инфекции М. tuberculosis, по сравнению с белком, индуцированным вакцинацией рекомбинантным белком ТВ10.4, мышей трижды вакцинировали с двухнедельными интервалами или ТВ10.4, или ТВ10.4-пептидной смесью. Через 6 недель после последней вакцинации мышей подвергли аэрозольному заражению вирулентной М. tb. Через 6 недель после заражения мышей умертвили, а число бактерий определили в легких.

Результаты показали, что мыши, вакцинированные ТВ10.4-пептидной смесью, не только проявляли более широкое распознавание ТВ10.4, но также были значительно более защищенными от инфекции М. tb., по сравнению с мышами, вакцинированными рекомбинантным белком ТВ10.4 (Фиг.9). Таки образом, вакцинация смесью ТВ10.4 пептндов ведет к более широкому распознаванию ТВ10.4 эпитопов, которые в свою очередь индуцируют значительно более высокую защиту от инфекции М. tb., по сравнению с вакцинацией рекомбинантным белком ТВ10.4.

Пример 5

ct521

Мышей трижды вакцинировали с двухнедельным интервалом рекомбинантным CT521 или смесью CT521 перекрывающихся пептидов (Фиг.10), а клетки, отобранные через две недели после окончательной вакцинации из крови, стимулировали 0,5 мкг/мл каждого из CT521 пептидов. Секрецию IFN-гамма определили с помощью ELISA для проверки ведет ли вакцинация смесью CT521 пептидов к более широкому распознаванию CT521 по сравнению с вакцинацией рекомбинантным СТ521 белком.

Ссылки

1. Paul, W. 1999. Fundamental Immunology, fourth edition, Lippincott-Raven.

2. Sette, A., and J. Fikes. 2003. Curr Opin Immunol 15:461.

3. van der Most, R.G., K. Murali-Krishna, J.G. Lanier, E.J. Wherry, М.T. Puglielli, J.N. Blattman, A. Sette, and R. Ahmed. 2003. Virology 315:93.

4. Crowe, S.R., S.J. Turner, S.C. Miller, A.D. Roberts, R.A. Rappolo, P. C. Doherty, K. H. Ely, and D. L. Woodland. 2003. J Exp Med 198:399.

5. Wherry, E.J., J.N. Blattman, K. Murali-Krishna, R. van der Most, and R. Ahmed. 2003. J Virol 77:4911.

6. Kamath, A.B., J. Woodworth, X. Xiong, C. Taylor, Y. Weng, and S. M. Behar. 2004. J Exp Med 200:1479.

7. Olsen, A.W., P.R. Hansen, A. Holm, and P. Andersen. 2000. Eur J Immunol 30:1724.

8. McMichael, A.J., and R.E. Phillips. 1997.. Annu Rev Immunol 15:271.

9. Mowat et al 1991, Immunology 72(3):317-22

10. Lustig et al 1976, Cell Immunol 24(1): 164-7

11. Wille-Reece, U., C.Y. Wu, B.J. Flynn, R.M. Kedl, and R.A. Seder. 2005. J.Immunol. 174:7676.6

12. Thompson J., et al Nucleic Acids Res 1994 22:4673-4680

13. Ravn, P. et al 1999. J.Infect.Dis. 179:637-645 14.Stryhn, A., etal 1996 Eur. J. Immunol. 26:1911-1918

15. Harboe, M., et al 1998 Infect. Immun. 66:2; 717-723

16. Krogh, TN, Berg, T, & Hojrup, P. (1999). Anal. Biochem. 274, 153-162

17. Gosselin et al., 1992. J. Immunol. 149: 3477-3481

18. Babu et al. 1995. Vaccine 13:1669-76.

19. Davidsen et al (2005). Biochim Biophys Acta. 1718: 22-31.

20. Munoz et al (2004). Int J Pharm 269:177-84.

21. Kirby & Gregoriadis. 1984. 2: 979-984.

22. Pick U. 1981. Arch. Biochem. Biophys. 212: 186-194.